Temas 51 y 52 Modelos de estudio en cáncer (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura Cáncer
Año del apunte 2016
Páginas 21
Fecha de subida 03/05/2016
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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CÁNCER TEMAS 51 y 52 Modelos de estudio del cáncer Dentro del campo del cáncer y de la oncología, podemos encontrar diferentes maneras de investigar y distintos tipos de experimentación que abarcan desde un punto de vista básico o traslacional hasta un punto de vista más clínico.
En primer lugar, ya conocemos las características diferenciales que han sido adquiridas por las células tumorales que determinan el fenotipo tumoral, también conocidas como Hallmarks del cáncer: evasión de la apoptosis, autosuficiencia de señales de crecimiento, capacidad de evasión de los supresores de crecimiento, invasión tisular y metástasis, potencial replicativo ilimitado y angiogénesis.
Para el estudio de las células tumorales y sus propiedades (Hallmarks) podemos encontrar básicamente dos tipos de experimentación: Métodos in vitro – cultivos celulares Pueden ser cultivos primarios o líneas celulares. Las líneas celulares son células que, en un momento dado se aislaron de un tumor, y se han ido dividiendo y creciendo a lo largo de los años ya que son inmortales y no entran en senescencia. Algunas de las líneas disponibles se aislaron hace ya 60 años.
Dentro de los cultivos primarios y de las líneas celulares podemos encontrar diferentes tipos de cultivos: cultivos en suspensión o cultivos adherentes en monocapa, cultivos en tres dimensiones y cultivos organotípicos.
Los cultivos en tres dimensiones dan más información sobre el microambiente tumoral y sobre las propiedades de las células que la que dan los cultivos en dos dimensiones, y se acercan más a la realidad, Los cultivos organotípicos consisten en coger un fragmento de un tejido y ponerlo en la placa de cultivo para que crezca. A partir de estos pueden obtenerse cultivos primarios o líneas celulares.
Métodos in vivo – se utilizan modelos animales (frecuentemente roedores) - Trasplantes. Podemos inyectar las células tumorales (habitualmente en una vena de la cola o una inyección intracardiaca) o bien se pueden hacer xenotrasplantes (entre organismos de distinta especie) y alotrasplantes (entre organismos de la misma especie) subcutáneos, en la cápsula renal u ortotópicos.
- Modelos inducidos por carcinógenos, frecuentemente inducidos con carcinógenos químicos - Modelos de ratón genéticamente modificados: transgénicos, Knock-out/knock-in o Knock-down 1 CÁNCER Curso 2015/2016 MÉTODOS IN VITRO A continuación vamos a ir viendo diferentes métodos para conocer las propiedades de las células que se están estudiando (y si estas presentan el fenotipo tumoral).
Cultivos en suspensión o en monocapa Autosuficiencia de señales de crecimiento Las células tumorales son, en muchos autosuficientes, por lo que, en cultivo, no requieren lo mismo que las células normales. Un ensayo muy típico es el ensayo de crecimiento dependiente de anclaje. Para este ensayo se utiliza como medio de cultivo el agar blando, un sustrato en el que las células normales no pueden dividirse.
Como sabemos, para poder dividirse y crecer, las células normales necesitan estar enganchadas a un sustrato pero las células tumorales, autosuficientes, no necesitan estar enganchadas para poder sobrevivir y proliferar. En este experimento se coge una placa de cultivo que se recubre con agar blando al 0,3%, que crea una capa que impide la adhesión celular. Se ponen las células a analizar en suspensión en una concentración muy diluida para que queden individualizadas, sin lugar al que adherirse.
Pueden ocurrir dos cosas: que la célula no prolifere y muera por anoikis (tipo de apoptosis que se activa cuando la célula se desengancha del sustrato) o que la célula sea tumoral y tenga la capacidad de proliferar y formar una pequeña colonia en el agar.
En el experimento que se muestra en la imagen vemos colonias que proceden de una sola célula. Las colonias pueden ser tratadas con inhibidores farmacológicos, como siRNAs. Tras el tratamiento con siRNAs, las colonias han desparecido.
Estos estudios en agar blando permiten ir añadiendo diferentes compuestos para estudiar cómo afectan a las células.
Insensibilidad a las señales anti-crecimiento El principal tipo de inhibición de crecimiento que se pone de manifiesto en los cultivos celulares es la inhibición por contacto. Al entrar en contacto con las células vecinas, las células paran de crecer para mantener la homeostasis. Por el contrario, las células tumorales son insensibles a las señales inhibitorias del crecimiento. Esto puede ponerse de manifiesto con un ensayo de formación de focos. Se cultivan las células en una placa de cultivo hasta que lleguen a confluencia. Con una pipeta, hacemos un corte en la monocapa de células y esperamos a que las células vuelvan a crecer hasta la confluencia de nuevo. Si las células son sensibles a la inhibición por contacto, deberían crecer hasta restablecer la monocapa. Si son insensibles a la inhibición por contacto, las células continuarán creciendo aunque no tengan más 2 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV sitio para crecer en monocapa, por lo que crecerán hacia arriba. Con un experimento de este tipo podemos caracterizar los mecanismos celulares que controlan el crecimiento de un determinado tipo celular.
Evasión de la apoptosis Para estudiar si las células de las que disponemos son sensibles a la apoptosis o tienen capacidad de evadirla, debemos exponer las células a estímulos pro-apoptóticos para analizar si las células mueren.
Se estudia si las pro-caspasas se procesan (y si aparecen las caspasas) tras estos estímulos y se hacen ensayos en TUNEL.
Capacidad de invasión y metástasis Se hacen estudios en los que se observa si las células tienen capacidad de migrar y la velocidad a la que lo hacen.
Se suelen hacer ensayos de curación de heridas en los que se tienen las células en cultivo y se hace una raya en la placa con una punta de pipeta. Se observa si las células de ambos márgenes de la raya son capaces de migrar y de cerrar la “herida”. De esta manera analizamos la capacidad de migración de las células ya que, cuanto más rápido cierren la herida, mayor será esta capacidad.
Este ensayo no es demasiado fino ya que las células también comienzan a dividirse por lo que realmente no se sabe qué porcentaje del cierre de la herida podemos atribuir a la migración de las células y qué porcentaje podemos atribuir al crecimiento.
3 CÁNCER Curso 2015/2016 Un ensayo algo más refinado es el ensayo de migración o ensayo transwell. Tenemos una placa de cultivo más pequeña con forma de cesta que tiene en su base una membrana con pequeños poros (normalmente de 8 micras). Estas placas con forma de cesta se colocan sobre una placa de cultivo normal.
Las células se colocan sobre las placas en forma de cesta. Si las células no tienen capacidad migratoria, se quedan sobre la membrana sin moverse, quedando enganchadas a su posición inicial. Si las células tienen capacidad migratoria, atravesarán los poros de la membrana y quedarán al otro lado (en la placa grande). Normalmente, las células son más grandes de 8 micras, por lo que les supone un esfuerzo comprimirse lo suficiente como para atravesar los poros y pasar al otro lado. De esta manera, exigimos más a las células para que puedan migrar.
Cuando las células tumorales migran, reciben señales quimiotrópicas que atraen a las células favoreciendo la migración. Si cogemos la placa de cultivo y ponemos una capa de medio sin factores de crecimiento sobre una capa de medio con señales quimio-atrayentes favoreceremos la migración. De esta manera, podemos estudiar cuáles son los factores que promueven la migración de cada tipo celular.
Es decir, los ensayos transwell permiten analizar si las células tienen capacidad migratoria y frente a qué estímulos la adquieren. Dependiendo del tipo celular con el que se trabaje, el experimento puede durar entre 24 y 48 horas.
Al comienzo del experimento se crea un gradiente de factores que se acaba perdiendo, por lo que hay que ir vigilando cómo va el experimento cada cierto tiempo: a las 3, 6, 12 y 24 horas, para evitar que se pierda este gradiente ya que si no se mantiene, los resultados obtenidos podrían deberse al azar.
Si las células tienen realmente la capacidad de invadir, tendrán la capacidad de degradar la matriz extracelular que las rodea. Por tanto, habrá que estudiar si las células tienen esta capacidad de invadir la matriz y de migrar. Para ello se hace un ensayo trasnwell de invasión en el que, antes de colocar las células en la placa con forma de cesta, se recubre la membrana (y por tanto, también los poros) con matriz extracelular artificial.
Las células se colocan sobre esta matriz por lo que, si quieren llegar hasta los poros, deberán desengancharse y degradarla. Para provocar que las células traten de desplazarse al otro lado, se colocan sustancias quimio-atrayentes.
4 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Sobre este ensayo hay muchas modificaciones posibles, sobre todo en lo que respecta a la composición de la membrana, que puede tener diferentes composiciones. Se pueden probar distintas composiciones para ver si las células tumorales tienen la capacidad de degradarlas todas: colágeno, laminina,… Normalmente se usa matrigel (empleada en el 95% de los estudios). El matrigel es una especie de gelatina muy hidrosoluble, por lo que no da problemas a la hora de establecer el gradiente.
Los experimentos más visuales que pueden realizarse en el estudio de la invasión son aquellos en los que colocan las células sobre la matriz extracelular y se va observando si la atraviesan pero podemos encontrar muchas variantes. También se hacen estudios en los que se quita la matriz y se estudia la migración en directo con el microscopio confocal, haciendo un escaneado de los planos y estudiando si las células están migrando o no.
También se puede hacer inmunohistoquímica y analizar marcadores en las células mientras van avanzando.
Angiogénesis Los experimentos para estudiar la angiogénesis in vitro son bastante complicados, ya que formar un vaso in vitro es bastante difícil aunque este tipo de experimentos también se llevan a cabo.
Se emplean líneas celulares de células endoteliales normales y se cultivan en placa sobre un factor que induce la angiogénesis, como el VEGF. Estas células se organizan de una manera similar a un capilar, es decir, pueden organizarse de manera similar a cómo lo hacen las células de un vaso.
Otro estudio que puede realizarse para evaluar la angiogénesis es el siguiente: tenemos un cultivo de células tumorales en medio de cultivo, sobre las que pondremos las células endoteliales y se observa si las células endoteliales se organizan de forma similar a como lo hacen cuando forman vasos sanguíneos.
De esta manera podremos saber si las células tumorales secretan al medio algún factor angiogénico 5 CÁNCER Curso 2015/2016 (con capacidad de inducir que se formen los vasos sanguíneos). La angiogénesis es un proceso muy complejo y, probablemente en este experimento se esté simplificando mucho.
Cultivos celulares y terapia: fármacos quimioterapéuticos Además de para el estudio de las características del fenotipo tumoral, la experimentación in vitro con cultivos celulares se ha empleado para desarrollar terapias contra las células tumorales. De hecho, la experimentación in vitro es el primer paso por el que todo tratamiento pasa.
Empleando cultivos celulares podemos, sin utilizar una gran cantidad de recursos, estudiar muchos tratamientos y ver si tienen algún efecto o no sobre las células tumorales. Es decir, podemos probar los agentes quimioterápicos in vitro sobre muchas líneas celulares diferentes.
Bortezomib Se trata de un tratamiento que induce la muerte celular.
Tratamos un cultivo, con un determinado número inicial de células, con concentraciones crecientes del fármaco. Se enfrentan diferentes tipos celulares a distintas dosis de un agente del que queremos testar si tiene capacidad antitumoral.
Vemos que para cada dosis obtenemos una supervivencia celular distinta y podemos crear curvas de viabilidad.
Dependiendo del tipo celular que estemos utilizando, las células serán más sensibles o más resistentes.
6 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Medicina personalizada Hoy en día se intenta hacer medicina personalizada, analizando cada paciente individualmente. Para ello se cogen las células del paciente, que tendrán unas mutaciones concretas, y se cultivan para probar diferentes fármacos a distintas concentraciones e incluso combinaciones de estos. De esta manera, se estudia a qué son sensibles las células del paciente y se correlacionan estos datos con los perfiles tumorales. Los datos obtenidos de estos estudios se suman a los resultados de un screening genético en el que se analizan las mutaciones del tumor. Esto sirve para conocer los mecanismos celulares por lo que una célula sensible a un tratamiento acaba desarrollando resistencia.
Si volvemos a los estudios (dejando aparte la medicina personalizada y el caso de un paciente particular), se pueden ir siguiendo estos procesos en los cultivos y analizar los cambios genéticos o epigenéticos que se producen en el momento en que las células comienzan a desarrollar resistencia al tratamiento.
Radioterapia También se usan los cultivos celulares para testar si las células son sensibles o resistentes al tratamiento con radioterapia. Se cultivan en una placa con una dilución clonal con la que las células estarán lo suficientemente separadas como para que un clon se diferencie del clon vecino.
Se someten estas células tumorales a diferentes grados de radioterapia y se analiza su sensibilidad o resistencia.
Se puede investigar qué genes posibilitan esta resistencia haciendo screenings diferenciales de cada pocillo para ver qué genes se relacionan con la sensibilidad y la resistencia a la terapia (serán aquellos genes que tengan patrones de expresión distintos).
7 CÁNCER Curso 2015/2016 Cultivos en tres dimensiones Los cultivos en tres dimensiones son una especialización de los cultivos que nos aproxima más a la realidad ya que nos permite observar las características morfológicas de los tejidos.
En los cultivos en dos dimensiones, tenemos las células en monocapa pero no es así como se encuentran dentro del organismo. Dentro de los tejidos y órganos las células pueden formar glándulas polarizadas, tienen polaridad ya que cuentan con una parte apical y otra basal, descansan sobre una matriz con la que presentan uniones, … La polaridad de las células hace que el comportamiento celular cambie y el programa celular es distinto en función de la polaridad y del tejido que forma parte la célula, por lo que resulta bastante importante para estudiar la función.
Por tanto, se busca provocar que las células que están creciendo en dos dimensiones crezcan con una morfología similar a la que presentan dentro del tejido. Por ejemplo, si tenemos células epiteliales, éstas pueden crecer formando glándulas como las que se encontramos en el útero, en el epitelio mamario, en la próstata,… que no son iguales entre sí.
Una vez tenemos el cultivo en tres dimensiones, podemos estudiar muchas características de las células que se encuentran desreguladas en el fenotipo tumoral (crecimiento, polaridad,…) Es decir, los cultivos en tres dimensiones permiten estudiar los cambios morfológicos y moleculares que se producen durante la carcinogénesis.
Por ejemplo, en la imagen vemos una comparación entre un endometrio de ratón normal y un carcinoma de endometrio (también de ratón). Podeos comprobar cómo en el endometrio normal las células están polarizadas mientras que las células del carcinoma han perdido la polaridad. Si estudiamos esto in vitro, tendríamos las glándulas (cultivo en 3D) y podríamos modificar las condiciones y estudiar cuáles son los factores que inducen la transformación de epitelio glandular a epitelio tumoral.
8 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En el tejido epitelial también podemos encontrar las células mesenquimales o del estroma, formando parte del tejido de soporte. Como podemos comprobar en la imagen, en un cultivo en dos dimensiones apenas se diferencian morfológicamente de las células epiteliales pero en el cultivo en tres dimensiones vemos que hay grandes diferencias. Normalmente, el cultivo en tres dimensiones se hace con el epitelio, no solo de las células mesenquimales.
Polaridad de las células epiteliales En los cultivos en tres dimensiones, las células adquieren las características de un epitelio, con una polaridad y posición correctas. También deben conservarse las uniones entre células y entre las células y la matriz extracelular.
Tipos de cultivos en tres dimensiones Podemos encontrar infinidad de variantes e incluso de aparatos para formar las matrices extracelulares, los sustratos o andamios que permiten cultivar las células en tres dimensiones. Este esfuerzo que ha impulsado los cultivos en tres dimensiones ha surgido del campo de la regeneración tisular que ha centrado sus esfuerzos en la regeneración de órganos y tejidos para lo que es necesario lograr una disposición de las células en tres dimensiones.
9 CÁNCER Curso 2015/2016 Lo primero que hay que elaborar es una matriz extracelular, ya que sin ella las células no pueden adoptar la morfología que tienen en el organismo. Una de las primeras matrices que se desarrollaron, llamada Matrigel se hizo con células del epitelio mamario. Estas células no son tumorales (no tienen propiedades tumorales) pero están inmortalizadas y crecen en cultivo. Por tanto, se establece in vitro un epitelio similar al mamario que permite estudiar la morfología y las implicaciones del carcinoma de mama.
Cuando se cultivan las células en presencia de esta matriz y de medio de cultivo, es como si las células crecieran dentro de un organismo de verdad y crecen en forma de gránulos. Las células se colocan individualiadas encima de una capa de matriz, que normalmente es Matrigel, se añade el medio y se pone algo más de matriz para que las células reciban las señales que promuevan que empiecen a crecer en tres dimensiones y para que estas células en crecimiento se vayan enganchando a la matriz.
Se debe añadir un medio que aporte las condiciones adecuadas como para que las células puedan desarrollar glándulas in vitro.
En la imagen vemos un ejemplo de este tipo de experimentos realizado con células MCF-10A. Estas células forman glándulas en tres dimensiones.
Podemos observar estas glándulas con el microscopio confocal si se tiñen con marcadores contra el citoesqueleto y con DAPI para observar el DNA. De esta manera se ve que las células están polarizadas y forman estructuras glandulares. Las células del margen de la glándula quedan polarizadas y en contacto con la matriz y, como las células que se encuentran en el centro de la glándula no están en contacto con la matriz, mueren. Por tanto, en este caso, el epitelio se forma por el vaciamiento de la glándula. A pesar de esto, sirve para el estudio de la morfogénesis de las glándulas.
10 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Podemos encontrar diferentes tipos de cultivos en tres dimensiones. Algunos cultivos usan matrices extracelulares más diluidas, diferentes bases, … Dependiendo del tipo celular, funcionarán mejor unos tipos de cultivo u otros.
Estudios en cáncer Como las MCF12A son células normales, se espera que formen un epitelio normal. A pesar de ello, este tejido puede servir para estudios de carcinomas. Esto se ha hecho, por ejemplo, transfectando con la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) que puede provocar hiperplasia de las células del epitelio mamario. Es decir, simulamos los efectos de la infección por el virus del papiloma que provoca hiperplasia. De esta manera, podemos estudias los mecanismos que permiten la transformación oncogénica o probar diferentes tratamientos.
En el cáncer de mama normalmente lo que ocurre es que se activa el receptor HER2, por lo que para simularlo hay que crear un plásmido con el gen activo de HER2 (o ErbB2). Se desarrolla in vitro una masa amorfa similar a la masa tumoral de la mama, en la que hay una mezcla de células sin polaridad que no forman glándulas. Sí, estamos reproduciendo in vitro lo que ocurre in vivo. Al transfectar un cultivo en dos dimensiones con el plásmido con el HER2, las células proliferan más pero no se ven los efectos morfológicos de la transformación.
Para el cáncer de endometrio se han podido crear cultivos celulares a partir de células de ratón. Se cogen los úteros de los ratones y, tras la digestión con tripsina se separan las células del estroma de las células epiteliales. Las células pueden crecer en dos dimensiones como células epiteliales o pueden hacerse cultivos en tres dimensiones gracias a Matrigel y a un buen medio.
Si las células se cultivan en un mal medio, no se podrá obtener un cultivo en tres dimensiones ya que las células deben quedar expuestas a determinados factores de transcripción. En caso de que haya demasiados factores, las células pueden perder su morfología y volverse células tumorales. Y en caso de que haya pocos factores de crecimiento, las células no podrán sobrevivir. Por tanto, es muy importante diseñar un medio apropiado.
Se caracterizan las células con inmunofluorescencia. Las células normales están polarizadas, ordenadas y tienen las uniones célula-célula correctas. Encontramos la laminina en la parte basal, el aparato de Golgi en la cara apical, las uniones estrechas entre la cara apical y el dominio basolateral, … 11 CÁNCER Curso 2015/2016 La caracterización con inmunofluorescencia puede emplearse también para caracterizar las células tumorales. Por ejemplo, se pueden caracterizar células que han perdido PTEN o células que han perdido la cadherina, altamente relacionada con los procesos de invasión y metástasis. Es decir, podemos estudiar como las mutaciones características del cáncer afectan morfológicamente a las células.
PTEN puede inhibirse gracias a un shRNA, creando células KO de PTEN que desarrollarán una hiperplasia.
De esta manera mimetizamos in vitro los efectos in vivo de la mutación de PTEN.
La E-cadherina es un supresor tumoral que forma las uniones estrechas célula-célula y cuya pérdida está asociada con evasión y metástasis. Hemos quitado gracias a un shRNA la E-cadherina de un cultivo control que hace glándulas. Al quitar esta molécula de adhesión, las glándulas se disgregan y las células comienzan a migrar a través del Matrigel. Hay una destrucción de la glándula y las células se desplazan, creando metástasis.
12 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV MÉTODOS IN VIVO De la misma manera que con los métodos in vitro, vamos a ir viendo la aplicación de los diferentes métodos de estudio in vivo, enumerados al comienzo del tema, al estudio del cáncer.
Trasplantes Para estudiar el cáncer es frecuente trasplantar las células tumorales a un modelo. Por tanto, en primer lugar, es necesario elegir un receptor de estas células que nos sirva como modelo de estudio. Lo más frecuente es elegir al ratón como modelo. Podemos elegir diferentes cepas de ratón: ratones normales, ratones consanguíneos (que se han cruzado entre familiares en más de 10 generaciones alcanzando un alto grado de consanguineidad) o animales inmunodeprimidos (más delicados y caracterizados por no tener pelo).
Para alotrasplantes, es decir, trasplantes entre animales de la misma especie pueden usarse ratones singénicos, es decir, ratones similares genéticamente compatibles y por tanto, compatibles inmunológicamente. El problema es que estos ratones no aguantan los xenotrasplantes (trasplantes de células u órganos de otra especie) por lo que no se les pueden trasplantar células humanas (hay rechazo).
Para los xenotrasplantes hay que usar ratones inmunodeprimidos, en los que el sistema inmune es deficiente y no habrá rechazo del tejido trasplantado.
Trasplante subcutáneo Tenemos las células tumorales in vitro y se inyectan al ratón de forma subcutánea con la ayuda de una jeringa. Al cabo de unos días, el ratón desarrollará un tumor subcutáneo del cual podremos analizar la morfología, las alteraciones, … Gracias a este tipo de trasplante, pueden estudiarse dianas moleculares para terapia. Por ejemplo, se puede probar a poner un RNA de interferencia contra BRaf y analizar después el crecimiento del tumor.
La masa tumoral del tumor al que se ha administrado el RNA de interferencia contra BRaf es más pequeña.
13 CÁNCER Curso 2015/2016 Además de probar diferentes terapias y combinaciones de estas, se pueden extraer proteínas, DNA, … para ver cómo se comportan los niveles en un tumor.
En el siguiente estudio, se han implantado las células tumorales de forma subcutánea al ratón y se ha administrado un tratamiento con Vorinostat, un inhibidor de las deacetilasas de histonas. Se puede comparar que el fármaco para el crecimiento del tumor.
También se ha probado de esta manera el efecto de la combinación del Vorinostat con otros fármacos, como RNAs de interferencia.
Con estos trasplantes subcutáneos también puede estudiarse in vivo la angiogénesis. Se cogen las células que se quieren estudiar y las envolvemos de Matrigel (la matriz artificial que se usa para los cultivos en tres dimensiones). La bola de Matrigel (con las células tumorales en el interior) se implanta subcutáneamente en el ratón y se deja unos días. Al cabo de unos días se extrae y se analiza la angiogénesis que se ha producido. Podemos ver cómo las células han adquiridos nuevos vasos (que se localizan en el interior del Matrigel) ya que las células han necesitado irrigación dentro del ratón. Si no hubiera sido posible la formación de nuevos vasos, las células habrían estado muertas (a pesar de ser tumorales) ya que no habrían recibido nutrientes.
Trasplante bajo la cápsula renal Las células que se quieran trasplantar se inyectan bajo la cápsula renal, que es un tejido altamente irrigado, lo que favorece el crecimiento de las células tumorales. De esta manera, se intenta reproducir lo que ocurre durante el proceso de tumoración humana y observar cómo se comporta el tumor in vivo.
Si por ejemplo queremos coger las células del endometrio, hay que coger las células epiteliales y las células del estroma (células de soporte). Una vez tenemos las células de cada tipo celular aisladas, hacemos un recombinado. Normalmente, esto se coloca en un pequeño pocillo con agarosa y se deja reposar. Tras dejar incubar toda la noche, se forma una bola con células del estroma y células epiteliales. Después, esto se inyecta en un ratón inmunodeprimido bajo la cápsula renal.
14 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV De esta manera, conseguimos reproducir un pequeño endometrio bajo la cápsula renal (hay mucha grasa pero encontramos pequeñas células envueltas de estroma).
En el tejido trasplantado podemos inducir mutaciones para lograr un modelo que nos permita estudiar la oncogénesis. Tras la implantación, se puede hacer que las células expresen un transgen, infectarlas con un lentivirus, … y estudiar si se comportan como células normales o si se comportan como células tumorales. Además, podemos analizar los genes que participan en la tumorogénesis.
Esto se ha hecho, por ejemplo, en el caso de PTEN. Se cogieron células epiteliales deficientes de PTEN (full KO) y un estroma Wild Type y se creó el recombinado, que se implantó bajo la cápsula renal. El epitelio forma un epitelio tumoral.
Trasplante ortotópico Este tipo de trasplante consiste en trasplantar las células de un tejido al tejido al que pertenecen (en otro individuo). Se puede suturar en el útero del ratón una pieza de carcinoma de endometrio. Al cabo de un tiempo se ha desarrollado un tumor con sus correspondientes metástasis.
15 CÁNCER Curso 2015/2016 Es posible hacer medicina personalizada e implantar células de un carcinoma de endometrio de una paciente en un endometrio de ratón para poder probar distintos tratamientos.
Además de con el carcinoma de endometrio, también se ha hecho con cáncer de mama. En el ratón, el árbol de la glándula mamaria está bajo una masa de grasa aunque es posible quitar el árbol glandular sin quitar la grasa. Tras quitar el árbol glandular, se inyectan las células.
Por ejemplo, pueden sustituir las células del epitelio mamario (árbol glandular o epitelial) por células epiteliales modificadas, como MCF10, que reproducirán un epitelio mamario que, tal vez no sea funcional pero es morfológicamente muy similar.
Inyección La inyección es el tercer tipo de trasplante y constituye el principal modelo de estudio de la metástasis.
Para hacer metástasis, la célula debe poder circular en el torrente sanguíneo y sobrevivir en él, extravasarse en un tejido en el que establecerse y crecer a distancia. A través de la inyección de las células en la cola del ratón o tras el ojo (inyección retroorbital), estas van a la circulación por la que se desplazarán a distintas partes del organismo. Si dejamos pasar un tiempo tras la inyección, las células se habrán establecido en otro lugar.
Las células inyectadas hacen metástasis principalmente en los pulmones ya que en primer lugar van a la circulación pulmonar (ya que se inyectan en la vena).
De esta manera solo podremos estudiar las metástasis en el pulmón.
La forma de conocer cuál es la preferencia de las células tumorales a la hora de hacer metástasis es la inyección intracardiaca. Las células tumorales se inyectan en el ventrículo izquierdo del ratón para que vayan a la circulación sistémica. Así, las células harán metástasis en el órgano en el que normalmente la hacen y es posible estudiar esto.
16 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Es importante seguir las células por el organismo por lo que deben llevar algún marcador, por ejemplo, el gen de la luciferasa o algún marcador fluorescente. Si llevan el gen de la luciferasa, se podrá observar dónde se encuentran las células gracias a la luciferina. Se observa in vivo (sin tener que sacrificar al ratón) si las células se han implantado allí donde se ha hecho la inyección o si se han movido e implantado en otro lugar.
También se pueden estudiar si responden a un tratamiento.
Lo más nuevo son los xenotrasplantes hechos a partir de las células del propio paciente o PDX (Patient-derived Xenotrasplants). Esto es una forma de hacer medicina personalizada.
Modelos de carcinogénesis inducida Podemos encontrar una gran cantidad de sustancias que, si se inyectan, pueden generar tumores. Se trata de carcinógenos químicos, como la dietilnitrosamina (DEN), el humo del tabaco y otros agentes químicos que actúan como iniciadores.
Se puede inducir un tumor en un modelo para después estudiar muchos aspectos de este, como la relación entre inflamación y cáncer, los genes mutados en las células tumorales (para lo que se secuencia el tumor inducido), … 17 CÁNCER Curso 2015/2016 Modelos animales modificados genéticamente En el humano puede ocurrir que muten un gen clave que da lugar a una célula mutada en la que se irán acumulando más mutaciones hasta desarrollar un fenotipo mutante. Esto mismo puede ocurrir en organismos modelo, como los ratones, que son el organismo modelo más utilizado en carcinogénesis.
Como podemos ver en el esquema, el ratón puede usarse para estudiar muchas cosas diferentes, como posibles tratamientos y resistencias a estos, métodos de detección, las metástasis o la prevención (desarrollando un modelo de ratón susceptible a la carcinogénesis al que suministrar una dieta o fármacos).
Se pueden desarrollar más de un tipo de modelo modificado genéticamente: - Ratones transgénicos – se sobreexpresa uno o varios genes (oncogenes en el caso de modelos de carcinogénesis).
- Ratones Knoc-in o Knock-out. Se pueden crear animales Knock-in a los que se sustituye un gen por una copia mutada (para oncogenes –copias sobreactivadas- o supresores tumorales –copias inactivadas) o crear animales Knock-out en los que se deleciona un gen o parte de él (para supresores tumorales).
- Ratones Knock-down, mediante la expresión de shRNAs que silencian genes supresores tumorales.
Ratones transgénicos Se coge un cDNA con uno o varios genes concretos y se introduce en un cigoto que se implanta en un ratón. De esta manera se crea un ratón transgénico con más de una copia de un gen determinado.
18 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Ratones Knock-out El mecanismo para generan ratones Knock-out es la recombinación homóloga. Las células normales tienen dos copias normales de un mismo gen. Lo que se hace es fabricar un plásmido con el gen al que le falta un fragmento o mutado (inactivo) que se introduce en el núcleo de la célula embrionaria normal y, por recombinación homóloga sustituye a la copia correcta del gen. Esto se implanta dentro del embrión del que se acaba desarrollando un ratón que tendrá una copia del gen mutada y otra copia normal, es decir, un animal heterocigoto. Cruzando este animal heterocigoto con otros heterocigotos con la misma mutación podemos obtener un animal homocigoto para la mutación.
Los KO pueden convertirse en modelos de cáncer familiar, es decir, son modelos de aquellos individuos que tienen, desde el nacimiento, predisposición a desarrollar algún tipo de cáncer (por heredar en heterocigosis una mutación). Los animales tendrán una copia normal y una mutada de algún gen que está involucrado en algún tipo de cáncer familiar, que predispones a la generación de un tumor.
Normalmente son genes supresores tumorales, que son los que están frecuentemente involucrados en cáncer familiar.
En el caso de un KO heterocigoto de PTEN, este mimetiza con un síndrome de Cowden, caracterizado por una predisposición al cáncer de endometrio.
Muchos de estos genes son extremadamente importantes para el desarrollo y el mantenimiento de la viabilidad del individuo en las primeras etapas del desarrollo embrionario. Por esto, es común a muchos genes supresores tumorales que los full KO sean animales letales embrionarios. Este hecho condiciona el estudio y las investigaciones.
19 CÁNCER Curso 2015/2016 Para estudiar lo que ocurre cuando faltan las dos copias del gen, se crean animales KO condicionados.
Los animales condicionales se crean gracias al sistema de la recombinasa Cre y a las secuencias LoxP. Se elabora una construcción con el gen que se quiere eliminar (delecionar) flanqueado por dos regiones LoxP. Incorporamos esta construcción al genoma de un ratón.
Por otro lado, tenemos otro ratón que expresa Cre bajo el control de un promotor específico de tejido (es decir, que solo se expresará en un tejido concreto). La recombinasa Cre es una enzima que reconoce las secuencias LoxP y escinde todo lo que queda entre ellas. De esta manera, si cruzamos los dos ratones y obtenemos un ratón que tenga el locus del gen flanqueado por los LoxP y expresión en un tejido de las recombinasa Cre, tendremos un ratón con una deleción del gen en el tejido que queramos (en el que expresemos Cre). Esto nos permite delecionar genes necesarios para el desarrollo embrionario sin que los embriones mueran antes de nacer. Se hace por ejemplo en el caso de PTEN, cuyo ratón full KO resulta letal embrionario. Se pone la recombinasa bajo el control del promotor de la progesterona, por lo que solo se expresará en los tejidos en los que esta se expresa, como el útero. Así, se pueden crear un ratón KO de PTEN en el útero.
En el caso de querer estudiar el tejido hematopoyético, se puede poner Cre bajo el control de un promotor que solo se exprese en las células hematopoyéticas, como el promotor de CD45. Estos ratones mutantes desarrollarán linfomas y leucemias (tumores del sistema hematopoyético).
También se pueden crear ratones KO inducibles. En este caso, se fusiona el gen de la recombinasa Cre con una forma modificada de un receptor de estrógenos bajo el control de un promotor que se exprese en cualquier tejido, como el promotor de la actina. Esta forma del receptor de estrógenos es inducible en presencia de tamoxifeno, por lo que, aunque Cre se exprese siempre, solo actuará cuando inyectemos el tamoxifeno. En el momento en que se inyecte el tamoxifeno, las dos copias del gen desaparecerán en aquellos tejidos en los que se haya expresado Cre, que en este caso son todos.
20 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Este sistema también puede hacerse específico de tejido si colocamos la construcción con Cre y el receptor de estrógenos bajo el control de un promotor que se exprese en un tejido concreto.
Este mecanismo permite establecer un control espacial y temporal de Cre, lo que nos permite establecer la deleción cuando (y también donde) queramos.
Normalmente, las mutaciones propias del cáncer se producen ya en la edad adulta por lo que podemos reproducir estos tiempos con los ratones e inyectarles el tamoxifeno ya cuando son adultos. Mediante estos ratones inducibles podemos crear modelos de experimentación de diferentes tipos de cáncer.
Estos modelos inducibles permiten estudiar y probar diferentes fármacos. Por ejemplo, se han utilizado para probar el tratamiento con Everolimus en ratones full KO de PTEN.
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