Tema 1: Operaciones básicas en DNA recombinante 1/3 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 11
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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TEMA 1 OPERACIONES BÁSICAS EN DNA RECOMBINANTE TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología ELECTROFORESIS EN GEL DE ARAGOSA.
La identificación del material de partida no sería posible sin la electroforesis en gel de agarosa, es importantísima en el DNA recombinante, sin la electroforesis de DNA no podría haber nacido el DNA recombinante (además de gracias a las enzimas de restricción, transformación cepas de eficiencia con restrictasas). Se desenvolvió poco antes de los AANN, a principios del 70, finales del 60, haciendo posible la visualización de fragmentos del genoma en geles de agarosa y de acrilamida.
• • • En geles de acrilamida de menos de 200 nt: quedan reducidos a los métodos de separación por secuenciación de Sanger.
En geles de agarosa podemos ir desde los 200 nt hasta los 25kb.
En geles de agarosa + campo pulsante podríamos ir hasta 1000 kb, como mucho 2 mega bases. El campo pulsante no es nada más que una electroforesis de agarosa, solo que el polo positivo y negativo se mueven a lo largo de la electroforesis y así es más fácil ordenar el DNA, permitiendo grandes resoluciones.
Normalmente utilizaremos geles de agarosa, donde la migración de DNA es inversamente proporcional al logaritmo de su masa. Imagen 2, esquema con diferentes migraciones.
El límite inferior es 200 kb, para resolver fragmentos de entre 0.5, 0.7, 1.5 de más peso molecular y 0.5 y 0.7 de más masa. La primera gráfica que vemos es válida para fragmentos de DNA lineal, en el DNA vemos 2 extremos sueltos, inversa del logaritmo de su masa.
Cuando el DNA tiene conformaciones topológicas su migración no es proporcional a su masa. Es decir, con un DNA lineal, las correspondientes formas cerradas, ya sean covalentemente cerradas con diferentes grados de super-enrollamiento (SC) y (OC) (la forma cerrada pero medio), migran por debajo y por encima, el DNA lineal tiene una migración intermedia entre la abierta y la cerrada, siempre es así. Incluso pbr322. Esa foto de abajo es una imagen de un gel de electroforesis que ha corrido sin bromuro de etidio y teñido con el agente intercalante con posterioridad.
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Si se suministra bromuro de etidio durante la migración, eso ya no es verdad.
Resumen: el DNA sin cortar tendrá la forma circular abierta (OC) y la forma circular cerrada (SC), que tienen una migración que es ligeramente inferior y ligeramente superior al correspondiente DNA lineal, siendo el DNA lineal el único que migra de forma inversamente proporcional al logaritmo de su masa. El SC migra más porque está súper-enrollado, el por qué físico del OC no se sabe. Sin bromuro de etidio el lineal queda por el medio de OC y SC, con bromuro de etidio no tiene por qué.
En presencia de bromuro de etidio, cuando el DNA tiene superenrollamiento dextrógiro disminuye la afinidad por el bromuro de etidio. Así pues, el DNA relajado coge más bromuro de etidio que con super-enrollamiento.
El bromuro de etidio cuando se intercala en el DNA aumenta la masa aparente de esa molécula de DNA, y esa molécula se retrasa en la electroforesis. Cuanto más bromuro de etidio coja, más masa aparente y más se retrasará.
En presencia de super-enrollamiento y bromuro de etidio, podemos ver las formas superenrolladas del plásmido en diferentes bandas (SC). Si tienes 3 vueltas dextrógiras de sobra cogerá menos que el que tenga dos. Cualquier DNA circular resuelto en un gel de agarosa sin bromuro de etidio durante el curso electroforético su forma circular cerrada y su circular abierta son los casos extremos del mismo DNA lineal, es decir, el lineal siempre queda entre la cerrada para cualquier molécula de DNA menor a unas 25 kb. El por qué físico no se sabe.
OC (es un DNA relajado, porque está abierto) migra un poco menos que el L, no sabemos por qué, el SC migra más porque está superenrollado.
Antes se utilizaba radioactividad, por casualidad descubrieron el bromuro de etidio para visualizar el DNA en las muestras de agarosa, se ha desenvuelto en los años 50 del siglo pasado.
Se utilizaba como tratamiento contra el Tryponosoma, un parásito. Se hicieron unos experimentos con personas y, sobre todo, con animales, en los cuales se les daba bromuro de etidio y se veía que se intercalaba sobre el DNA. Además de en personas y animales también se intercalaba en el DNA de parásitos y, por tanto, dificultaba de una forma importante la 2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología replicación del DNA del Triponosoma respecto a la replicación del cromosoma de la célula huésped. Es un fármaco anti triponosoma. Se continúa dándose a los animales.
A alguien se le ocurrió tirarlo en gel de DNA e iluminarlo en luz ultravioleta, viéndose las bandas.
Flujo de fluorescencia: o o NO INTERCALADO: picos de emisión de 302-366 INTERCALADO: picos de emisión sobre los 590 (anaranjado).
Además, cuando está intercalado es mucho más eficiente porque están las moléculas ordenadas y la fluorescencia se multiplica, de forma que podemos ver los geles de una forma muy buena.
Familia SYBR Green: es una mejora del bromuro de etidio. Son agentes intercalantes con una estructura mejorada de la del bromuro de etidio puesto que tienen diferentes grupos laterales. Sin embargo, tanto el bromuro de etidio como la familia SYBR Green tienen gran tendencia a atravesar membranas celulares, por eso son peligrosos.
Por eso, a partir del 2000 se ha desenvuelto las familias de: q. Gel Red.
r. Midor.
s. SYBR safe.
Que disminuyen la permeabilidad y, por tanto, su toxicidad genética será menor que la del bromuro de etidio. Aún así, no podemos tirarlos en la pica ni no usar guantes porque continúan siendo agentes intercalantes.
Finalmente, la última aplicación de los geles de agarosa en moléculas de DNA es estudiar si una determinada proteína es capaz de interaccionar con una molécula de DNA mediante los geles de retraso EMSA, en inglés “electrophoretic gel mobility shift assay” Son geles con carga en los que el DNA en la electroforesis migra para el polo positivo (abajo) porque tiene cargas negativas. La proteína aumenta el peso molecular del DNA, al igual que lo hacía el bromuro de etidio, haciendo que se retarde en el gel de electroforesis. Por tanto, estudiamos la posibilidad de que una determinada proteína sea capaz de interaccionar electroestáticamente con el DNA para formar un complejo.
Un gel de retraso mira si un DNA complejado con una proteína queda retardada su migración electroforética, prueba de que esa proteína puede interaccionar con el DNA. Sirve para detectar si una región de DNA tiene secuencias reguladoras.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología La electroforesis también puede hacerse en RNA. El RNA es una única molécula que puede tener estructura secundaria. Las moléculas de RNA pueden resolverse en geles de agarosa, pero la estructura secundaria puede generar problemas ya que dos moléculas de la misma medida pueden tener estructura secundaria diferente y por tanto migran diferente.
Es mejor tratarlo con un agente desnaturalizante, de estar forma, tenemos un gel de agarosa con formaldehído, de manera que se desestructura la estructura secundaria (se desnaturaliza) y el RNA migra de acuerdo a su masa.
NOTA I: Cuanto más largo es un plásmido, más imprecisas serán las bandas lineales y circular abierta ya que se parecen.
NOTA II: Siempre que hagamos algún gel con enzimas de restricción hace falta poner un DNA no cortado al lado para comprobar que se ha cortado o no.
t.
Normalmente queda el vector abajo y el inserto arriba.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Las enzimas de restricción son enzimas que detectan DNA foráneo y lo degradan.
• TIPO I.
Son enzimas unarias compuestas por tres subunidades: reconocimiento, metilación y endonucleasa/restrictasa en la misma proteína.
El corte se produce a una distancia indeterminada (sobre 1 kb) de la secuencia de reconocimiento, por ello, no son útiles. Sólo nos interesan para ver el genotipo de la célula huésped.
Sólo metilan el DNA de cadena hemi-metilada, por lo que si le añadimos DNA exógeno será degradado. In vitro no se puede hacer DNA hemi-metilado, por lo que si queremos replicar este DNA en un huésped que tenga enzimas de restricción, lo degradará. Por tanto, es importante que la cepa destino sea restricción negativa (hsdR).
Para DNA recombinante podemos usar dos fenotipos: 1. r- y m2. r- y m+ -> mejor No usaremos r+ m+ porque degradará el DNA. No puede ser usado en DNA recombinante a menos que tengamos un DNA metilado. Las cepas r-m- podemos usarlas, meteremos DNA no metilado de manera que no le pasará nada a este DNA al no haber restricción.
Incluso sería mejor una cepa r-m+, con actividad metilasa y la subunidad que lleva a cabo la restricción tiene una modificación en el centro activo de manera que es r-. Esta cepa formará un complejo sin actividad restrictasa.
Así, la mejor será esta última, ya que si introducimos el DNA en este tipo de cepa luego lo podemos meter en una cepa r+m+ sin ningún problema.
Esta cepa no corta el DNA porque es r-, mientras que sí que lo metilará porque es m+. Así, una vez pasado por aquí ya lo tendremos metilado y por tanto se podrá entrar en una cepa r+m+ sin problema alguno.
4 Belén Pérez Sanmartín • 2º Biotecnología TIPO II.
Son enzimas binarias con actividad metilasa y restrictasa en proteínas diferentes.
La restrictasa sólo requiere Mg+ para su actividad, a diferencia de las de tipo I y tipo III.
Corte a unos 24 o 26 pb de la diana.
Nos interesa para caracterizar el DNA (mapas de restricción) y DNA ligasa.
In vitro se puede metilar DNA.
Son las responsables del nacimiento del DNA recombinante.
• TIPO III.
Son también unarias por lo que no se podrán usar. La diferencia con I es la distancia del punto de corte:  En las de tipo I será a 1 kb del punto de reconocimiento mientras que en las de tipo III a unos 25 pb. Las de tipo II hacen también corte a unos 25 pb.  Son enzimas unarias compuestas por dos subunidades: reconocimiento y metilación en una y endonucleasa en la otra.
El sistema mcr reconoce DNA metilado y, específicamente, citosinas metiladas. Estos dos sistemas son habituales en cepas bacterianas de E. coli. Así, en caso de clonar DNA de procedencia eucariota es importante que la cepa destino sea mcrA y mcrBC (es decir, mcr-).
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TIPO II Y METILASAS ASOCIADAS.
Pueden reconocer palíndromos, es decir, secuencias de DNA que se leen igual por las dos cadenas.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Todas las secuencias palindrómicas son autocomplementarias . Es decir, una secuencia palindrómica es complementaria con ella misma, es la antiparalela de sí misma.
Siempre se leen las secuencias 5’-3’, la secuencia de abajo siempre tiene la misma secuencia que la de arriba. Así, a este tipo de secuencias se le denomina palíndromo. Siempre que nos den una secuencia nos darán la 5’-3’, a no ser se indique lo contrario.
Luego también pueden reconocer palíndromos interrumpidos, como por ejemplo: 5’ GANTC 3’ 3’ CTNAG 5’ Tenemos una base que interrumpe al palíndromo.
Por último, pueden reconocer secuencias no palindrómicas (IIs). El punto de reconocimiento está a unos 20-30 nucleótidos de la secuencia de reconocimiento del enzima. Ejemplo de IIs: 5’ GTGGG 3’ 3’ CACCC 5’ Tanto palindrómicos como los palindrómicos interrumpidos cortan dentro de la secuencia de reconocimiento, mientras que los no palindrómicos cortan a una distancia fija entre 20-30 pb de la diana de reconocimiento.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TIPO II. NOMENCLATURAS.
De tipo II hay descubiertas sobre 200-300. Algunas tienen la misma secuencia de corte, pero están aisladas de dos microorganismos distintos.
• Isoquizómeros.
Cuando dos enzimas tienen la misma secuencia de reconocimiento y el mismo punto de corte, pero son de distintos microorganismos.
• Neoisoquizómeros.
Si la secuencia es la misma, pero varía el punto de corte y son de organismos distintos. Es decir, son isoquizómeros que varían en el punto de corte.
• Isocaulómeros.
Los más interesantes para clonar. Son enzimas que tienen secuencia de reconocimiento diferente, pero los extremos que generan son compatibles el uno con el otro.
6 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Ejemplos isocaulómeros: BamHI: GGATCC. Corta entre las dos GG y las los CC: G|GATC|C 5’ G|GAT C 3’ 3’ C CTA|G 5’ 5’ G 3’ CCTA GATC 3’ G 5’ BcI: CGATCG. Se corta entre CG: C|GATC|G 5’ C|GATC G 3’ 3’ G CTAG|C 5’ 5’ C 3’ GCTAG GATCG 3’ C 5’ Los extremos que generarán serán compatibles, de manera que podrán unirse entre ellos.
De esta forma, hay 3 tipos de corte en enzimas de restricción de tipo II no IIs: 1. Extremos cohesivos: a veces compatibles y a veces no.
1.1. extremos 5’ sobresalientes. Por ejemplo, EcoR1: 5’ G|AAT T C 3’ 3’ C TTAA |G 5’ 1.2. extremos 3’ sobresalientes.
2. Extremos romos: hechos por isocaulómeros, generan la misma cola, es decir, siempre generan extremos compatibles entre sí.
u. SmaI y EcoRV: cualquier cortado con un enzima es clonable con la otra enzima.
En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de restricción: Las tres primeras letras indican género y especie. Desde el 2003 la IUPAC recomienda no escribir en cursiva las letras correspondientes a género y especie. A continuación viene la cepa concreta (R) que corresponde a la cuarta letra. Por último, el número que corresponde a la ordinal (el orden, V).
MAPAS DE RESTRICCIÓN.
Entonces, las enzimas de restricción generan extremos cohesivos que facilitan el clonaje o también sirven para mapear el DNA. Es un término que no existe, pero se usa.
Se aisla un DNA determinado mediante PCR y los procesos que sean. Para caracterizarlo además de decir su medida: • • Determinar su secuencia completa.
También se puede caracterizar el DNA por la presencia de dianas de restricción. Si hacemos esto, obtenemos el mapa de restricción de una molécula de DNA. Esta era la manera rutinaria para caracterizar DNA, ya que secuenciar el DNA antes era muy caro y muy lento.
Mediante enzimas de restricción generamos extremos cohesivos para el clonaje y para hacer mapas de restricción.
7 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Cada día se hace DNA recombinante y se hacen centenares de mapas de restricción. ¿Para qué se hace? Es una herramienta buena para saber si un clonaje se ha producido de manera correcta o no. Se determina si ha tenido éxito un clonaje para colocarlo en un inserto.
Por tanto, los mapas de restricción se pueden utilizar como método de diagnóstico o como método de secuenciación.
Por caro que sea secuenciar un clon con un inserto, caracterizar este inserto puede ser interesante. Si hacemos el clonaje de un vector clonado + inserto lo más simple es coger lo que tenemos, cortarlo con la enzima (EcoRI) y ver si la electroforesis nos da dos bandas que corresponden al vector y al inserto o no. Así, comprobamos que tengamos un inserto sin necesidad de secuenciar todo el plásmido. Es decir, después de clonar, lo habitual es vía enzimas de restricción hacer preparaciones de DNA, digerirlas con EcoRI y ver si nos salen las dos bandas que corresponden al vector y al inserto. Se continúa haciendo de forma rutinaria en todos los laboratorios donde se hace DNA recombinante. Hacemos mapas de restricción haciendo esto.
DNA LIGASAS.
Se usan para unir extremos cohesivos generados por enzimas de restricción. Podemos encontrar dos tipos de extremos cohesivos: compatibles o no compatibles. Sólo podemos juntar extremos libres procedentes de isocaulómeros, pero los que son romos también se pueden ligar con DNA ligasas.
Tenemos dos tipos de DNA ligasas: 1. La de E. Coli que requiere NADH pero no necesita ATP para formar el enlace fosfodiéster entre el 5’P y el 3’-OH.
2. La de DadE4 (proveniente del bacteriófago T4) que requiere ATP pero no NADH. para formar el enlace fosfodiéster entre el 5’P y el 3’-OH.
La DNA ligasa del bacteriófago T4 une extremos romos y además extremos cohesivos procedentes de enzimas isocaulómeras (nos genera 5’ o 3’ sobresalientes). Se suele usar siempre.
La de E. coli solo nos permite ligar extremos cohesivos procedentes de enzimas isocaulómeras.
Habitualmente la de E. coli se reserva si tenemos un DNA circular con tres nicks, es decir, que se ha cortado por tres lugares. De esta forma transformamos la forma de DNA abierta (nickada) a su forma cerrada. La de E. coli solo se usaría si tienes dos tipos de extremos y sólo quieres ligar los extremos cohesivos, pero no se usa en general.
8 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología LIGACIÓN DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN.
o Adaptadores y linkers.
Utilizados para la conversión de extremos romos en extremos cohesivos. Las reacciones de ligación con extremos romos, aunque se usaba la DNA ligasa del fago T4, eran muy ineficientes.
Por muchos motivos, no era eficiente la ligación de extremos romos y la ligación en general.
Para incrementar la eficiencia de ligación se inventaron dos estrategias: 1. Con oligonucleótidos autocomplementarios: linkers.
2. Con oligonucleótidos complementarios entre sí: adaptadores.
Un linker es por ej GAATTC, que es complementaria con ella misma, palindrómico: CTTAAG. 6 bases. Solo hace falta una unidad.
Si ponemos un oligonucleótido que esté en una posición por encima del inserto, la reacción de ligación entre el oligonucleótido estará favorecida por la elevada concentración que tenemos. Es decir, la reacción de ligación con un inserto y linker es mucho más eficiente que la reacción de ligación entre inserto-vector.
Linker y EcoRI.
Tenemos un extremo romo. En presencia de una elevada concentración de linker se colocarán muchas copias del linker a cada uno de los dos extremos del inserto e hibridan sobre si mismos al ser autocomplementarios.
Si el inserto tiene la diana EcoR1, en presencia de EcoRI se cortarán los linkers que están a los lados y acabaremos teniendo extremos cohesivos.
9 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Si el inserto no tiene dianas de restricción los linkers no se utilizan.
Fueron importantes en los bancos de cDNA. EcoR1 siempre genera extremos cohesivos. No suelen usarse los linkers.
Los linkers al cortarse por enzimas de restricción salen siempre no fosforilados los extremos 5’OH, entonces haría falta que se fosforilasen para poder tener un DNA circular. Si no están fosforilados no se pueden añadir otras moléculas sin fosfato, por ello se han desarrollado los adaptadores.
Los adaptadores se usan hoy en día. Debemos poner dos piezas junto a un inserto. No son dos piezas autocomplementarias, pero sí que son complementarias, de manera que tenemos que poner 2 (en los linkers solo se ponía 1).
Una de ellas estará fosforilada y la otra estará sin fosforilar. Entonces, las dos piezas recrearán el extremo cohesivo de una diana de restricción.
Así, no hará falta tratar con EcoR1 para generar extremos cohesivos ya que, el hecho de poner los dos oligonucleótidos por sí mismos ya nos generan los extremos cohesivos.
Ejemplo adaptador: 5’OH GATCCCCGGT 3’ OH 3’ OH GGGCCA 5’ P Los dos oligonucleótidos hibridan entre sí, pero no pueden hibridar consigo mismos. Los adaptadores y linkers ya no suelen hacerse. No obstante, ha quedado un concepto que es mezcla de ambos y que comentaremos en PCR.
Conclusión: ahora mezclamos ambos conceptos para facilitar el clonaje de los productos del PCR y también para bancos de cDNA. Como tales, su reacción en la ligación para incrementar la eficiencia pues hoy en día ya no hace falta, pero para tenerlo claro y tal lo explica.
DNA POLIMERASA Y DE Escherichia Coli.
La DNA polimerasa I. Es un enzima de reparación y tiene 3 tipos de actividad (funciones): 10 ...

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