Tema 3 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2014
Páginas 18
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 30
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Tema 3. CINÈTICA DE LA REACCIÓ ENZIMÀTICA MÈTODES D’ANÀLISIS DE LA ENZIMÀTICA: TÈCNIQUES D’ASSAIG DELS ENZIMS D’un enzim sempre ens interessa conèixer la seva activitat de catàlisis i per mesurar aquesta tenim diferents aproximacions però alhora de triar el mètode a utilitzar cal que tinguem present una sèrie d’aspectes:  Mètode més simple  Rapidesa  Economia  Tipus d’informació sobre l’activitat que volem tenir, hi ha vegades que no volem tenir tots els paràmetres de la reacció sinó saber si s’ajusta a una sèrie de característiques  Tipus de mostra que tenim i les seves limitacions (si la mostra és molt tèrbola no podrem elaborar bé un mètode d’absorció de llum) Tenim diferents mètodes i sempre hem de buscar l’adequat per les nostres característiques. En relació al tipus d’assaig podem diferenciar dos mètodes diferents (independentment de l’assaig que elaborem)  Mètode continu: Són aquells assajos en que es pot seguir l’activitat de l’enzim en cada moment i per tant, la transformació de substrat a producte es segueix al llarg de tot el temps de reacció.
 Mètode discontinu: En aquest cas tenim dades puntuals de l’activitat mesurada en el temps i per tant, no tenim una resposta contínua en el temps sinó que tenim valors puntuals distribuïts en la franja del temps.
Tots els mètodes que es poden elaborar en continu també ho poden fer en discontinu però no al inrevés.
Observem una taula resum dels diferents mètodes que ens permeten estudiar l’activitat d’un enzim: 1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Mètodes basats en processos d’absorció o emissió de llum: mètodes fotomètrics Mètodes d’absorció de la llum Aquests mètodes es fonamenten en que en la reacció que volem mesurar tenim un component que quan es transforma presenta un canvi en el seu espectre d’absorbància de manera que a mesura que té lloc la reacció l’espectre va variant i nosaltres el podem anar seguint. Aquest mètode es pot elaborar en continu i discontinu.
Assaig continu directe En aquelles reaccions catalitzades per oxidoreductases i en les que participa el NADH en forma oxidada o reduïda podem elaborar un assaig d’aquest tipus i aquest és precisament molt utilitzat ja que el canvi del NADH de la seva forma oxidada a la reduïda provoca un canvi en les seves propietats i conseqüentment en el seu espectre.
El NADH és una estructura nucleotídica que presenta un canvi en l’espectre de manera que la seva forma reduïda (NADH) absorbeix al voltant de 340 nm (marcada en blau) mentre que la seva forma oxidada (NAD+) no absorbeix en aquest rang (marcada en vermell). Això ens permet observar, en una reacció en que ell NADH reduït passi a NAD+ oxidat, una disminució de l’absorbància en aquest rang.
Gràcies a la llei de Lambert Beer (A= ε·l·c) podem conèixer la quantitat de substrat que es transforma en producte. Aquest és un mètode molt útil i utilitzat en les reaccions redox.
Existeixen algunes condicions en que el mètode pot tenir algunes dificultats com per exemple si volem mesurar l’activitat en una mostra que estigui contaminada per molts components que absorbeixen en el mateix espectre. També pot presentar problemes en situacions en que la mostra presenta altres enzims que també utilitzen el mateix coenzim i per tant, el producte final que mesurem és la contribució del conjunt de reaccions.
Assaig continu indirecte Els assajos amb el NADH són molt fàcils i es poden elaborar amb un equipament simple però si la reacció que volem mesurar no hi ha cap molècula que tingui una variació tenim dues opcions: reaccions acoblades o l’aplicació de cromófers sintètics.
1) Reaccions acoblades Imaginem les reaccions de la glucòlisis, el que fem és acoblar un dels productes de la reacció amb una segona reacció que si que tingui una molècula que pugui ser seguida per mitjà del seu espectre (molts cops és utilitzat el NADH).
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 En el cas anterior tenim la nostra mostra i en la barreja de reacció introduïm el substrat i els components necessaris per acoblar tot el procés (enzim que catalitza la segona reacció i el NADH). El que volem saber és la quantitat d’activitat que presenta l’enzim aldolasa i per tant hem de treballar en les condicions en que l’etapa limitant de tot el procés, l’etapa més lenta, sigui la que ve determinada per l’enzim que busco i tot els altres han d’estar en excés de manera que, tot el producte que es generi per l’enzim que busquem és transformat per les altres reaccions.
Observant les reaccions anteriors podem determinar l’estequiometria, que depèn de la introducció d’un tercer enzim: triosa fosfat isomerasa:  Sense aquest enzim la quantitat de NADH oxidat té una estequiometria en funció del substrat inicial, 1:1  Si introduïm l’enzim perquè volem més senyal sabem que es generar dons productes per cada substrat inicial i per tant, l’estequiometria serà 2:1, és a dir, es produirà dos NADH per cada substrat inicial.
Conèixer les equacions estequiomètriques és molt important alhora de dissenyar un assaig.
2) Cromòfers sintètics Aquestes molècules són utilitzades en aquelles reaccions en que ni el substrat ni el producte són mesurables i a més, no podem generar una reacció acoblada. Entenem per cromòfers sintètics a molècules que són reconegudes per l’enzim com a substrat, les transforma a producte i aquesta transformació dóna un senyal que podem mesurar per un canvi en l’espectre d’absorbància. Aquests no han de ser necessàriament substrats naturals sinó que simplement són molècules reconegudes per l’enzim i transformades a substrat, el que genera el canvi. Moltes vegades aquests cromòfers poden tenir una estructura més simple que la del substrat i per tant, la quantificació de l’activitat és més fàcil.
Un exemple és el p-nitrofenilacetat, que és reconeguda per algunes proteases com la quimotripsina gràcies a la seva especificitat sobre aminoàcids aromàtics, que catalitza el trencament d’aquesta molècula per formar àcid acètic i p-nitrofenol. Quan la molècula inicial és hidrolitzada per la proteasa es produeix un canvi en l’absorbància a 405 nm degut a la formació del p-nitrofenol i per tant, és una quantificació fàcil.
Un altre exemple és quan en els processos de transformació de bacteris es pot inserir fragments de DNA en la seqüència d’un determinat gen perquè expressin la seva activitat sabem que molts cops s’insereixen en una zona determinada que codifica per la β-galactosidasa de manera que podrem saber que forma senzilla si s’ha inserit el nostre fragment de DNA: si tenim el gen sencer es produirà la β-galactosidasa i tindrà activitat mentre que si s’ha inserit el nostre fragment no tindrem activitat. Per diferenciar si hi ha hagut inserció en el plasmidi en aquesta zona hi ha un assaig en que tenim un substrat, que no és el natural, que és reconegut per la β-galactosidasa i que el trenca donant un producte que presenta absorbància a la zona del 420 nm. Observem doncs, que utilitzem el cromòfer sintètic per detectar una activitat.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Mètodes de fluorescència La fluorescència s’utilitza en els laboratoris tot i que necessitem d’un equipament més car perquè té molta més sensibilitat que l’absorbància i per tant, amb poca activitat d’una molècula la veiem millor. A més, hi ha alguns tipus de substrats que es comporten molt bé en el rang fluorescent.
La florescència es basa en un compost que és un substrat o producte que absorbeix la radiació a una certa longitud d’ona i part d’aquesta energia la emet com fluorescència, que seria radiació d’una longitud d’ona amb menor energia i per tant, amb una freqüència més alta.
Un exemple és amb el NADH tot i que no és freqüent utiltizar-lo en fluorescència.
El NADH té un espectre d’absorbància amb un màxim a 320nm i per tant, aquest espectre és el primer, és a dir, irradiem la molècula a aquesta longitud d’ona.
Aquesta radiació ens detectaria la fluorescència al seu màxim d’emissió, que és 480 nm, a partir del canvi veurem si augmenta o disminueix la seva concentració.
L’assaig basat en el canvi de fluorescència és un assaig que es compra preparat però que és interessant alhora de treballar amb DNA per estar segurs que la preparació no té activitat RNAasa. El RNA està modificat en dos grups: un grup que té un espectre de fluorescència (F) i un altre anomenat quencher (Q) que apantalla la fluorescència anterior. Quan tenim un frgment de RNA amb el grup fluorescent i l’apantallador sabem que no s’emetrà fluorescència. Si la preparació que mesurem té aactivitat RNAasa aquest enzim actuarà trencant alguna de les posicions d’aquest RNA i per tant, els grups anteriors no s’apantallaran de manera que s’emetrà fluorescència.
Turbidimetria Aquest és un mètode més limitat i mesura la terbolesa de la mostra ja que mesura la reflexió de la llum per efecte de partícules que hi ha en la dissolució. Aquest tipus d’assaig és basant utilitzat sobre tot en el tractament o mesura de certs tipus de cultius bacterians i en concret del lisozim, que el que fa és hidrolitzar la paret cel·lular bacteriana i amb aquest assaig ho podem detectar.
La idea és que, imaginem que volem detectar l’activitat d’una mostra de lisozim, que hidrolitza específicament components de la paret cel·lular (composada per NAG i NAM). Per detectar-ho treballarem amb una suspensió de microorganismes (generalment micrococs) amb aspecte tèrbol. Afegim l’enzim, que anirà degradant l’estructura de la paret cel·lular i per tant, la terbolesa anirà desapareixent, la solució s’anirà clarificant perquè els microorganismes anirant degradant els seus components, que baixaran cap al final del tub.
En general els mètodes de fotometria es poden treballar en continu o disconitnu.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Assaig electroquímic Aquest també és un mètode que es pot treballar tant en continu com en discontinu i es basa en tenir una reacció que pugui ser mesurada per un detector de tipus elèctrode. Tenim dues opcions: Reaccions que produeixen o consumeixen oxigen Un exemple d’aquestes reaccions són les que estan catalitzades per la catalasa, i per tant, podem mesurar la producció d’oxigen utilitzant un elèctrode d’oxigen, que mesura el canvi de pressió parcial d’oxigen durant l’assaig. Aquest tipus d’assaig és molt limitant perquè depèn de l’oxigen.
Mètodes de pH-stat o mètodes de pH estacionari Aquest mètode es pot aplicar en aquelles reaccions en els que durant el procés de la reacció hi ha o bé una producció de protons o un consum de protons del medi i per tant, la reacció produeix un canvi en el pH d’aquest, que serà el que mesurarem.
Al elaborar una activitat enzimàtica hem de saber que les condicions del medi les hem de mantenir constants i en aquest cas suposa uns canvis, els altres mètode sempre treballen amb un tampó que fixa el pH i per tant, tot i que la reacció produeix una alteració en aquest el tampó permet que es quedi constant. En aquest cas però, treballem amb un sistema sense amortidor però en canvi volem mantenir també el pH constant de manera que el que fem és ajustar inicialment el pH a 7 i afegir l’enzim. A mesura que la reacció es produeix sabem que també es produiran protons (per exemple) el que provocarà una disminució del pH. El sistema té un elèctrode de pH dins la reacció que està connectat a un sistema que va aportat a l’assaig petites quantitats o bé d’àcid o bé de base que mantenen aquest pH constant. Aquest aspecte ens serveix perquè la quantitat d’hidròxid sòdic (per exemple) que hem necessitat correspon a la quantitat de substrat de la reacció que s’ha transformat en producte, sempre i quant tinguem les relacions estequiomètriques.
És un mètode molt sensible i en general és millor la utilització d’un àcid fort per diluir al màxim la mostra.
Assaig radiomètric Aquest assaig implica la utilització de substrats marcats radioactivament i per tant, la senyal que detectem és una senyal de radioactivitat que es mesura en un comptador de radioactivitat. És un assaig molt sensible i en el que podem utitlizar diferents tipus d’isòtops derivats d’àtoms diferents.
Aquest mètode va ser utilitzat per caracteritzar reaccions metabòliques com per exemple aquelles reaccions que utilitzen una quinasa i un ATP com a substrat. Marquem l’ATP amb fòsfor 32 en el fosfat gamma (últim fosfat) i si volem mesurar l’activitat quinasa el que fem es veure en aquesta reacció on va a parar aquest fòsfor radioactiu ja que la molècula on aparegui serà el substrat, que ja ha estat convertit en producte.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Aquest mètode té una sèrie de característiques diferenciades:  Mètode que sempre s’utilitza en discontinu ja que no el podem elaborar en continu perquè hi ha un moment de l’assaig en que cal separar de la barreja de reacció el que seria l’ATP marcat respecte el producte marcat i per tant, hi ha mètodes que separen per solubilitat, càrrega o mida el producte de l’ATP per quantificar-los.
 Mètode molt car  Necessitat d’unes instal·lacions específiques ja que treballem amb radioactivitat  Els residus de la reacció s’han d’emmagatzemar correctament perquè la radioactivitat baixi  El manipulador ha de tenir uns certs coneixements i per tant, una formació específica L’ús d’aquest assaig pels inconvenients anteriors s’ha substituït en molts casos per marcadors fluorescents.
Mètode basat en la separació de substrat i producte per HPLC Aquest mètode s’utilitza sempre en discontinu i analitza la transformació de substrat en producte basant-se en un mètode en que en diferents temps de reacció es separen els components de la reacció per una cromatografia d’HPLC.
Necessitem quantificar el substrat i el producte en condicions en que es separin de manera que observaren en un gràfic com el producte va augmentant i el substrat va disminuint.
Imaginem una reacció en que modifiquem l’aminoàcid glutamina en l’extrem N-terminal de manera que aquest passa a formar un glutàmic amb un grup cíclic, la transformació modifica molt poc l’estructura del substrat respecte el producte i per tant, hem de definir unes condicions de cromatografia capaces de detectar aquesta diferència per comportaments cromatogràfics diferents. També hem de tenir un sistema que em permeti detectar tant el producte com el substrat per tant, podem introduir un grup fluorescent que no es transformat durant la reacció i que ens servirà per detectar la posició d’elució del substrat i quant hi ha de producte.
Aquests són mètodes que s’utilitzen en condicions molt concretes ja que és un mètode molt lent de realitzar.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Aquest mètode té una segona utilitzat; quan tenim un substrat que és un polímer (en aquest exemple un anàleg del RNA) el podem tractar amb un enzim que el va trencant i el que passa és que en funció de les posicions de trencament no tindrem un únic producte sinó molts productes diferents. Alhora, en molts casos aquests productes són una altra vegada substrats. Sabem que quan el RNA es degrada la seva absorbància puja per tant, si ho determinem amb aquest mètode (d’absorbància) el canvi de color ens dóna la suma de totes les reaccions (només és un valor numèric) però no ens dona informació sobre el procés de trencament de manera que gràcies al sistema d’HPLC definim una determinada columna i en condicions de separació en que els productes es separen per la mida, el que ens permet obtenir més informació.
Mètodes electroforètics Aquests mètodes mesuren l’activitat enzimàtica basant-se en l’electroforesis. Es basa en analitzar la transformació de substrat a producte però en aquest no és exactament això sinó que la transformació ens serveix per detectar l’activitat que jo busco i per tant, la finalitat d’aquest mètode és identificar quin és el tipus d’enzim i algunes de les seves propietats.
Podem tenir el nostre enzim contaminat o molt purificat i es tracta de veure, en aquest cas, quina és la mida i on està en el gel d’electroforesis d’una barreja de moltes proteïnes per saber quina és la que té l’activitat que busquem. És un tipus d’assaig que es basa en fer un gel d’electroforesis amb presència de SDS. Recordem que un gel normal d’electroforesis té dues característiques:  Si és un gel de poliacrilamida de SDS sabem que les proteïnes es separen per mida  Generalment també s’introdueix β-mercaptoetanol per reduir els ponts disulfurs i que els grups tiols estiguin lliures Gel que incorpora el substrat En aquest cas però no podem aplicar la segona característica de manera que serà un gel normal però en el moment de la polimerització el gel en la barreja d’acrilamida introduirem un substrat que sigui reconegut per l’activitat que busquem de manera que quan polimeritzi el gel contindrà l’acrilamida, bisacrilamida i el substrat (que ha de ser molt gran i ha de ser un polímer perquè quedi atrapat en la xarxa dels components anteriors i no es mogui durant el camp elèctric).
Quan acabem l’electroforesi el que fem és agafar el gel, rentar en un tampó adient per tal d’eliminar el SDS (cal que ho fem perquè la proteïna replegui i això molts cops és una limitació perquè no totes ho poden fer sinó que generalment només ho fan les petites) i per tenir el gel en les condicions de pH en que l’enzim que busquem tingui una bona activitat.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Quan ja hem fet això el que hem de fer és deixar un temps d’incubació en que l’enzim en el lloc del gel on es trobi anirà trencant el polímer, que és el seu substrat. Com que el polímer és degradat es convertirà en polímers de mida més petita, que poden difondre pel gel i surten de l’estructura de poliacrilamida i per tant, en les bandes en que hi ha l’activitat que busquem el substrat estarà degradat.
Tenyim amb un colorant específic pel meu substrat i el que veurem és que en els llocs on el gel té el polímer atrapat es tenyirà mentre que aquelles zones en que l’enzim l’ha degradat i l’ha trencat en molècules més petites ens quedarà transparent de manera que, podem determinar a simple vista en quin carril es troba l’activitat que busquem.
Substrat cromogènic Aquest també es basa en un sistema d’electroforesis però la detecció és diferent. Com en el cas anterior cal elaborar un gel d’electroforesis però en aquest cas de forma normal i un cop ho hem fet també hem de rentar per eliminar el SDS i restablir les condicions òptimes per l’activitat que busquem.
Per realitzar aquest mètode necessitem que el substrat de la reacció sigui soluble i que quan es transformi el producte sigui insoluble. Fem el gel d’electroforesis i afegim el substrat; en aquelles bandes en que hi ha activitat el substrat es transformarà en producte i precipitarà i per tant, quedarà “unit” a la superfície dl gel i per tant, generalment aquest té una coloració en el rang visible. Així doncs, en aquelles bandes en que observem un color tindrem l’activitat que busquem.
És un mètode molt sensible que ens permet detectar moltes activitats.
VELOCITAT DE REACCIÓ La velocitat de reacció ens permet analitzar les reaccions enzimàtiques. Anteriorment hem vist mètodes que ens serveixen per caracteritzar l’activitat enzimàtica i quan parlem d’aquesta ens referim a la mesura de la velocitat d’una reacció.
Definim la velocitat de reacció com el canvi de concentració de substrat en funció del temps i en general, hi ha una disminució de la concentració de substrat per unitat de temps. Aquesta velocitat també pot quedar definida com el producte de la contant de la velocitat per la concentració de substrat.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Si això ho observem amb dades experimentals en una reacció de transformació la gràfica que obtenim del canvi de substrat en funció del temps s’anomena corba de progrés. Tenim una sola concentració de substrat i veiem com varia en el temps i d’acord a l’expressió aquesta disminueix. En relació al producte, si treballem en un tipus de reacció en que 1 substrat dóna 1 producte, sabem que al cap d’un cert temps la suma de la concentració de substrat i producte és igual a la concentració inicial. Això ens permet obtenir la següent expressió: També hi ha un altre terme important que és el temps de vida mitja de la reacció, el temps en que la concentració de substrat arriba al 50% respecte la concentració inicial: Si mesurem la concentració e producte que es forma com la disminució de substrat observarem que no hi ha una relació lineal en el temps. La relació lineal només es manté durant un període curt de la etapa de reacció i és durant l’etapa inicial, quan parlem d’una velocitat inicial que es satisfà sempre que la quantitat que es transforma de substrat sigui pràcticament despreciable. En aquestes condicions considero un esquema més simple que ens permet definir una reacció més simple en que el producte no podria revertir la reacció (en una reacció més avançada si) ja que no tenim pràcticament producte.
A concentracions creixents de substrat tenim velocitats majors i amb aquestes dades de velocitat inicial, per cada concentració de substrat podem construir una gràfica, que és una gràfica de la cinètica enzimàtica en la que represento per les diferents concentracions de substrat quina és la velocitat inicial (abans representàvem una concentració de substrat que es transformava en producte).
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Tenim que la velocitat màxima correspon a la velocitat en concentracions de substrat on pràcticament tot l’enzim està formant el complex enzim – substrat i per tant, queda aturat.
Efecte de la concentració de l’enzim Per determinades velocitats inicials la velocitat que observo depèn de la concentració d’enzim. Tenim velocitats inicials per una determinada concentració de substrat i respecte la concentració d’enzim. A les velocitats inicials la relació sempre serà lineal tal com es mostra en el següent esquema: Ordre de reacció Recordem el següent quadre comparatiu 10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 REACCIONS ENZIMÀTIQUES: FASES DE “BURST” O “LAG” A vegades, quan un fa un estudi cinètic i es vol determinar la velocitat inicial, observa que tot i que compleixi amb els requisits experimentals adequats (baixa concentració d’enzim, temps d’anàlisi suficient...) por passar que quan analitzem la corba de progrés, encara que estiguem en condicions de velocitat inicial, no trobem una relació lineal en la resposta.
Recordem que el que esperem en condicions normals és relació lineal. Observem dos tipus de fenòmens: de burst i de lag.
Per una banda, en els fenòmens de burst observem que encara que estiguem a velocitat inicial, és a dir, a temps molt curts de reacció, la velocitat que observem és superior a la que observem en temps posteriors, on ja s’ajusta a la recta. Per tant, trobem una etapa inicial on la velocitat és més elevada.
Per una altra banda, en els fenòmens de lag es produeix el cas contrari; en condicions inicials i a temps curts observem una velocitat més lenta que després va cap a una velocitat superior amb una relació més lineal.
Quan observem respostes no lineals el que hem de fer és pensar quina és la raó per la qual observem aquests comportaments anòmals. Hi ha una sèrie de motius que poden explicar aquests comportaments, entre els quals trobem:  Control no adequat de les condicions de reacció. Podem trobar casos on el nostre sistema no controli bé alguna de les condicions del sistema, com ara la temperatura. Per exemple, si nosaltres tenim el substrat emmagatzemat en gel perquè no es faci malbé i ho aboquem a la cubeta per fer la mesura de la velcoitat, si el sistema de regulació de temperatura no funciona correctament, la velocitat de la reacció es veurà afectada.
 Presència de partícules en suspensió. Sabem que en alguns medis poden haver-hi algunes partícules insolubles que afectin a la velocitat de la reacció, normalment disminuint-la.
 Detector de resposta lenta. Si el detector que tenim al laboratori és de resposta lenta, la concentració de producte que estarem detectant no farà referència a l’actual sinó a una altra i per tant, això pot modificar la gràfica de la velocitat de la reacció en front el temps.
 Dissociació lenta d’un inhibidor reversible  Pre estadi estacionari. Si estem mesurant en temps molt curts de reacció, aquesta probablement encara no ha arribat a l’estat estacionari i per tant la relació que se segueix no és lineal.
 Inhibició o activació pel substrat.
 Activació o inhibició pel producte.
Els dos últims casos són efectes en el mecanisme de l’enzim i fa que tingui velocitats diferents en funció de la concentració de substrat o bé de producte. Aquí cal veure si realment és un efecte del propi mecanisme o bé que el fet que la relació no sigui lineal vingui donat per un error experimental. En el cas que es tractés d’un efecte del mecanisme, caldrà estudiar més en detall quin és aquest mecanisme.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 PURIFICACIÓ D’ENZIMS Procés general de purificació d’enzims Quan treballem amb enzims i volem elaborar una purificació hem de tenir en compte quina és la destinació final d’aquests enzims ja que depenent d’això els voldrem tenir purificats totalment, mitjançant un procés més costós, o bé parcialment.
Per una banda, si els enzims estan destinats a aplicacions industrials, sabem que no exigeixen un grau de puresa excessiu de manera que no cal purificar fins el punt que la dissolució sigui homogènia. Si arribéssim a una purificació homogènia el procés s’encariria i a més, no aportaria cap valor afegit. Cal tenir present que quan treballem amb preparacions parcialment purificades hem d’estar segurs que en el medi amb el que treballem no hi ha res que modifiqui l’activitat de l’enzim que estem estudiant.
Per una altra banda, si volem resoldre l’estructura tridimensional d’una proteïna, l’enzim ha d’estar molt purificat, és a dir, ha d’estar en una mostra homogènia ja que per elaborar el cristall cal tenir unes estructures molt definides i en conseqüència que només tinguem un tipus de molècula en la mostra.
Així doncs, en cada cas cal decidir quin és el grau de purificació que s’adapta a les nostres necessitats tenint en compte quina serà la destinació.
A la imatge veiem un esquema del procés general de purificació d’enzims. Per una banda trobem diferents fonts per poder obtenir els enzims: animals, bacteris, plantes, etc. Així doncs, els enzims poden provenir d’una font natural o bé de recombinació.
Observem a l’esquema de purificació que sempre es passa per una etapa inicial, excepte si es tracta de fruits biològics, on hi ha una degradació de la font, de manera que arribem a una etapa on tenim l’enzim que volem en dissolució, fora d’orgànuls, etc. A partir de les mostres on tenim l’enzim en dissolució, apliquem diferents processo de purificació.
Quan hem acabat la purificació, l’última etapa, que fa referència a les condicions en les quals conservem l’enzim, és molt important ja que nosaltres podem fer una bona purificació però si no mantenim el producte final en unes condicions que mantinguin l’activitat no haurà servit de res. Si es tracta d’un procés de purificació per a un enzim que volem comercialitzar, les condicions de conservació són més importants encara ja que hem de fixar un temps en el qual es garanteixi que aquell enzim mantindrà unes condicions durant X temps.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Purificació d’enzims: elecció de la font En l’actualitat hi ha dos grans tipus de fonts a partir de les quals podem obtenir enzims: naturals o bé a partir de proteïnes recombinants Font natural La font natural és la matèria de partida per excel·lència ja que els enzims, com que són proteïnes, poden incorporar modificacions post traduccionals que juguin un paper molt important en la seva estructura, i en conseqüència, en la seva funció. Per tant, si els obtenim de la font natural estem garantint que l’enzim que purifiquem tindrà les activitats que volem estudiar.
A vegades, el problema resideix en el fet que la font natural dóna molt poca quantitat d’enzim o bé que és difícil d’aillar.
Per exemple, aïllar enzims que hi ha presents en els humans no és un procediment fàcil. És per aquest motiu que s’han buscat altres alternatives a l’hora d’obtenir enzims com és el cas de les proteïnes recombinants.
Proteïnes recombinants Les proteïnes recombinants són molt útils per estudiar enzims però s’han de tenir en compte quines són les seves limitacions. El rendiment d’aquestes proteïnes sol ser molt elevat però el problema és que en alguns casos, tot i tenir la mateixa proteica, no obtenim la proteïna que trobaríem a la font natural ja que no ha patit modificacions post traduccionals.
Trobem diferents sistemes on podem produir proteïnes recombinants: bacteris, llevats i cèl·lules eucariotes.
Bacteris Els bacteris és el sistema d’expressió de proteïnes recombinants amb el qual obtenim un rendiment més elevat. Els bacteris que se solen utilitzar són E. Coli i Bacillus.
Els bacteris tenen un avantatge i és que el seu creixement és molt ràpid de manera que se sintetitza una gran quantitat de l’enzim que volem estudiar.
Però cal tenir present que també tenen limitacions. Principalment, hem de tenir en compte que els bacteris no incorporen modificacions post traduccionals com ara glucosilacions i a vegades aquestes són importants per l’estructura, l’estabilitat o la funció de la proteïna.
Una altra limitació resideix en el fet que molts sistemes d’expressió, sobretot els que donen rendiments molts grans, la proteïna la trobarem en cossos d’inclusió que són uns orgànuls del bacteri on s’acumulen les proteïnes malament plegades. Així doncs, la proteïna s’ha de desnaturalitzar i tornar a plegar per tal d’obtenir una estructura més estables que en ocasions, sobretot si la proteïna és gran, no ho aconsegueix. Per tant, si expressem la proteïna amb mètodes que donen lloc a cossos d’inclusió podem tenir problemes a l’hora de plegar-la.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 En els bacteris hem d’expressar les proteïnes com a proteïnes de fusió, és a dir, la nostra proteïna s’expressa associada a un fragment addicional que normalment sol ser una cua d’histidines. Això ens permetrà purificar-la sense gran dificultat però en el cas dels enzims aquesta cua pot ser interessant eliminar-la, sobretot en aquells on en el centre actiu participa aquest aminoàcid. Això és degut que la cua d’histidines pot fer interferència en l’activitat de l’enzim. Així doncs, quan un treballa amb enzims expressats com a proteïnes de fusió s’ha de plantejar si treure la cua o no. Cal tenir present que si la eliminem cal un altre processament i per tant pèrdua d’enzim.
Llevats Els llevats que se solen utilitzar per obtenir proteïnes recombinants són S. Cervisiae i Pichia pastoris.
En el cas dels llevats sabem que sí que s’incorporen modificacions post traduccionals en les proteïnes però, normalment s’incorporen masses. Així doncs, amb els llevats obtenim proteïnes hiperglucosilades on aquestes glucosilacions poden no coincidir amb les que es produeixen a la font natural. A vegades, això pot interferir en l’activitat de l’enzim i per tant en el nostre estudi.
Cèl·lules eucariotes També s’ha aconseguit expressar proteïnes en cèl·lules eucariotes d’insecte a partir de vectors baculovirus. En aquest sistema s’elaboren modificacions post traduccionals com les glucosilacions.
El dubte recau en el fet si aquestes modificacions són les mateixes que s’elaboren a la font natural i això encara no s’ha pogut determinar. El que sí s’ha vist és que els enzims poden tenir variacions en l’activitat segons quin sigui el seu origen.
Purificació d’enzims: mètodes d’homogeneïtzació Excepte en el cas que la font d’un enzim sigui un fluid biològic, en la resta de casos, cal sotmetre a la font a un procés de trencament i de disgregació.
Per homogeneïtzar l’enzim podem utilitzar mètodes mecànics que consisteixen en trencar per una elevada pressió o polvoritzar, o mètodes no mecànics com ara els ultrasons, lisi per mitjà de shocks osmòtics, detergents o enzims.
Sigui quin sigui el mètode que emprem, la finalitat és sempre la mateixa: trencament de l’estructura.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Principals mètodes de separació utilitzats en la purificació d’enzims Trobem una gran diversitat de mètodes de separació quan volem purificar enzims. Aquests mètodes els podem dividir en funció del principi amb el que separen en funció de: la mida, de la polaritat (en funció de la càrrega o del seu caràcter hidrofòbic, de la solubilitat o interaccions específiques.
Mètodes de separació en funció de la mida En tenim diversos mètodes que ens permeten separar les molècules que tenim en funció de la mida i aplicarem un o altre depenent en quin moment de la purificació ens trobem. Així doncs, en una etapa inicial, on tenim una barreja de molts components (restes de membrana, tot tipus de molècules, contaminats...) hauríem d’utilitzar una centrifugació ja que si elaborem un gel filtració o una ultrafiltració (diàlisi), probablement la columna col·lapsaria.
Per tant, és important que a l’hora de definir que farem la purificació d’una etapa, escollim el mètode més adient en funció de les característiques de la mostra.
Mètodes de separació en funció de la polaritat Pel que fa als mètodes de separació en funció de la polaritat, els podem dividir en funció si separem segons la càrrega o segons la hidrofobicitat.
Si parlem dels mètodes de separació en funció de la càrrega trobem: cromatografia d’intercanvi iònic, que es pot utilitzar tant a gran com a petita escala, i després mètodes per a escales petites: cromatoenfoc, electroforesis i isoelectroenfoc.
Si volem separar en funció de la polaritat trobem la cromatografia de fase reversa, per a petites quantitats de mostra.
Mètodes de separació en funció de la solubilitat Pel que fa a la separació en funció de la solubilitat ho podem encabir a partir de dues perspectives.
Per una banda, la solubilitat dels enzims, com que es tracten de proteïnes, en el valor del punt isoelèctric la seva càrrega neta és 0 i per tant la solubilitat és mínima. Podem jugar amb el pH i així, en funció del punt isoelèctic, separar diferents proteïnes que tinguem a una barreja.
Per una altra banda, la separació pot basar-se en la concentració salina del medi. Sabem que la solubilitat de les proteïnes depèn de forma específica de la quantitat de sal que hi ha en el medi. Si per una determinada proteïna anem veient la solubilitat a mesura que augmentem la força iònica del medi, és a dir, la concentració de sal, arriba un moment en el qual la proteïna precipitarà.
La precipitació de les proteïnes en funció de la concentració salina depèn també d’altres factors com és el pH del medi i la temperatura.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Aquests sistemes, sobretot el del pH, els podem fer servir a etapes inicials ja que són mètodes poc específics i que ens permeten treballar amb volums grans on el cost és baix. Així doncs, pot tractar-se d’un procés inicial molt bo ja que elimina molts contaminants, processant una gran quantitat de mostra.
Efecte del pH i de la concentració salina en la solubilitat Imaginem que volem separar dues proteïnes ja que a un % determinat de sulfat d’amoni tenen característiques diferents.
Observem que una d’elles precipitarà, i per tant la trobem al sediment, mentre que l’altre quedarà en dissolució, és a dir, en el sobrenedant. Per tant, ens quedarem amb una cosa o l’altre en funció de quina sigui la proteïna que volem.
Mètodes de separació en funció de interaccions específiques Quan ja hem fet les etapes que ens han permès purificar de manera més general, si ens interessa, anirem a mètodes més específics i menys econòmics que treballen amb volum més petits.
Les cromatografies d’afinitat i les cromatografies amb colorants específics són mètodes que es basen en interacció específica entre l’enzim que volem purificar i el sistema.
Anàlisi del procés de purificacio Quan fem una etapa de purificació hem de veure si l’etapa funciona bé o no. Per una banda, hem de saber quina és la activitat total abans de fer la purificació i també quina és la concentració de contaminants que hem queda i que en principi només haurien de ser proteïnes ja que la resta s’haurien d’haver eliminat.
El mètode de purificació ha d’aconseguir eliminar les proteïnes contaminants i alhora mantenir al màxim l’activitat del nostre enzim. Cal tenir present que si quan apliquem el procediment obtenim el contrari, no és una bona etapa de purificació.
Per tal de poder determinar el contingut proteic podem aplicar mètodes colorimètrics com el Bradford o bé analitzar el tipus de proteïnes contaminants per mitjà de mètodes electroforètics.
També cal que coneixem quina és l’activitat de la mostra on està l’enzim que volem purificar abans i després de la purificació.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 A partir d'aquests valors podem determinar l’activitat específica que hem permetrà veure el grau de purificació ja sigui respecte la mostra inicial o bé respecte l’etapa anterior. Les fórmules per determinar aquests paràmetres són: Un altre paràmetre important és el rendiment de l’enzim que ens indica quin és el % d’activitat. Aquest valor ens pot interessar ja que si per exemple, perdem el 70% d’activitat d’un enzim pot no anar-nos bé.
Taula de purificació A la taula veiem que es parteix d’un homogenat a partir del qual s’obté un sobrenedant al qual se li aplica una precipitació amb sulfat d’amoni que es tracta d’un mètode barat i que treu molts contaminats. A continuació s’elaboren diferents cromatografies i al final una gel filtració.
Podem veure com a cada etapa, l’activitat total que recuperem va baixant i també la quantitat de proteïna. Però l’important és que l’activitat específica augmenti a cada etapa ja que si no ho fa vol dir que estem perdent més enzim que altres proteïnes.
Pel que fa a l’activitat total, podem determinar si ens surt a compte o no que disminueixi, això depèn de la situació.
Finalment obtenim que recuperem un 0,6% del nostre enzim però com que segurament aquesta proteïna va cap a cristal·lografia cal que estigui molt purificada i per tant ens hem de sacrificar.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T3 Purificació dels enzims: cost Un altre aspecte alhora de purificar és el cost. Des del punt de vista de recerca bàsica sí que es miren el cost ja que el projecte ha de tenir fons per poder pagar-lo. Però en el cas de la producció industrial, el cost és molt més important i per tant, en aquests caos a part de fer la taula de purificació anterior s’elabora una taula de costos com la següent.
18 ...