Tema 5 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 19/04/2016
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Biología Molecular Héctor Escribano Tema 5 Mutagénesis y reparación del DNA Las mutaciones genéticas suelen tener efectos perjudiciales sobre las células, por lo que las células desarrollan mecanismos para corregirlos.
5.1. Origen de las mutaciones. Experimento de Luria-Delbrück (1943) Se plantearon quien de los dos tenía razón, si Darwin o Lamarck. Lamarck proponía que los cambios que suceden en nuestros organismos vienen de un efecto del ambiente. Darwin, que las mutaciones son aleatorias y ya existen, y que es la selección natural (el ambiente) selecciona aquellos cambios que eran beneficiosos.
Decidieron experimentar con bacterias y con su resistencia a bacteriófagos. Ellos habían observado que si en una placa de Petri se pone primero una solución vírica y luego las bacterias, morían todas. Solo sobrevivía una de cada cien mil. Esas bacterias que resistieron al ataque, crecen, se dividen y forman colonias. Esas colonias habrían desarrollado una cierta resistencia a esos virus.
Experimento Crecieron bacterias en un matraz con medio pero sin el virus, cuando se echaba un poco del matraz sobre cada una de las 10 placas que tenían ya sembrado el virus En otro caso cogieron 10 matraces pequeños y en cada uno sembraron bacterias, y cada uno lo echaron en una placa con un virus.
Según Lamarck, en todas las Placas de Petri, de un caso y de otro, tendríamos que obtener números muy parecidos entre las 20 placas. Ya que la mutación se produce en una respuesta al virus, y por tanto todas las bacterias responderían igual.
Según Darwin, Las placas que salen del matraz grande desarrollarían las mismas colonias. Pero en las placas de los matraces pequeños puede que en alguno no se produzca mutación. Cuanto antes se produce la mutación, más bacterias serán mutantes. Si la mutación se sucede al final, tendríamos muchas menos. Por lo que en las placas de los matraces pequeños, encontraríamos que sobreviven diferentes números de colonias en cada placa.
El resultado del experimento dio poca dispersión en la cantidad de colonias que sobrevivían proviniendo del mismo matraz, y mucha dispersión entre las de los matraces pequeños. Este resultado se dio validez a la hipótesis de Darwin, de que la mutación se daba en los matraces y no en las placas. No obstante, no se podía descartar que el factor ambiental tuviera algo que ver.
5.2. Mutagénesis y consideraciones generales Cuando la luz solar incide sobre las células provoca una fusión de dos timinas contiguas, pero la célula tiene mecanismos para arreglarlo. En ese momento hablamos de Lesión o Daño al genoma. Una Mutación es un cambio en la secuencia de DNA original y que es heredable a nivel celular. Una mutación en una célula no siempre significa que existan una herencia generacional, ya que si en organismos Biología Molecular Héctor Escribano Tema 5 pluricelulares se produce una mutación en una célula somática, no conlleva herencia generacional. En cambio, si la mutación se produce en gametos, la herencia generacional si se puede dar.
Si existiera una alta tasa de mutación en la línea celular germinal, se podría llegar a la exterminación de la especie, debido a la infertilidad o incapacidad de la fecundación. Si se producen mutaciones en las líneas somáticas se producirían afecciones no hereditarias generacionalmente, pero sí que entre células, por lo que se podría generar un tumor y un cáncer. Un cáncer no se desarrolla por una sola mutación, sino por un acumulo de estas. Por lo que altas tasas de mutaciones acaban o con la especie o con el individuo.
Una tasa nula de mutaciones, provoca una falta de variabilidad en la descendencia que llevaría a la falta de evolución y ante unas condiciones adversas del medio, nadie podría haberse adaptado.
¿Cómo pueden originarse las mutaciones? 1. Errores que se producen durante la replicación del DNA (En la maduración de los espermatozoides deben darse 80 divisiones y al final del proceso, cada espermatozoide acumula del orden de 60 mutaciones) Se produce cuando las polimerasa introduce nucleótidos de forma errónea, pero no se dé cuenta de que lo ha hecho, piensa que lo está haciendo bien. Esto se debe a los tautómeros, formas resonantes de los aminoácidos. La Citosina o Timina tiene una forma mino y una forma imino. La Guanina o Adenina una forma ceto y una enol. Las formas raras, enol o imino, se dan en 1 de cada 100.000.
T ceto aparea con Aamino, Camino con Gceto. Pero T enol se junta con G ceto, y cuando encuentra una Cimino, la une a una Aceto. Por lo que la complementariedad de bases queda comprometida. Por lo que se produce un mal apareamiento. Hay mecanismos para corregirlo e impedir que llegue en mutación.
Buena parte de los errores que se dan en la replicación se deben a la tautomerización de las bases nitrogenadas.
2. Daños o lesiones en el DNA Causados por agentes mutágenos como los rayos gamma, el tabaco, los rayos UV, los X, el agua, el oxígeno (ROS) u otros metabolitos producidos en las reacciones comunes del organismo (S-adenosilmetionina). Muchas moléculas pueden dar lugar mutaciones en la secuencia, también existen agentes intercalantes que provocan una replicación inexacta, o análogos de las bases que se hacen pasa por ellas.
En general los podemos distinguir entre agentes físicos y agentes químicos.
Muchas lesiones se producen de forma espontanea. Los agentes solo aumentan el número. Se pueden producir reacciones por hidrolisis, rompiendo los enlaces N-glicosidicos, perdiendo la base y formando los sitios Abasicos. Parece ser que los enlaces más atacados por el agua son los de Adenina y Guanina. La Citosina, por hidrolisis de su grupo amino, se convierte en Uracilo (mutación de cierta frecuencia).
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 5 (El apareamiento de GC, la C pasa a U, y queda GU. La mutación se produce si se produce la replicación antes que la reparación. Existen enzimas que quitan el U y ponen la T. Si se replica, quedaran dos cadenas de GC y una de AU. Esa U, se cambiara por una T. Y la mutación ya será irreversible. Debido a que ya no se puede saber dónde está el daño.) Este uracilo es fácil encontrarlo, en el DNA, ya que este no tiene Uracilo. El Uracilo que se origina por daño aparea con la G. Pero la A también aparearía con U, si no hubiera Timina. Por eso en DNA la Timina sustituye al Uracilo.
Otras lesiones se deben a factores oxidantes, en la que se afecta a los dobles enlaces o carbonos de los anillos. En el caso de la 8-Oxo-Guanina, la guanina es atacada por oxígeno, adquiriendo la posibilidad de interaccionar con Adenina o con citosina.
También se pueden producir metilaciones; dímeros de Pirimidina por UV (los más frecuentes de TT) o roturas de las cadenas por rayos gamma.
No todos los daños son igual de mutágenos. Los dímeros de Pirimidina no es mutágeno, sino letal. La célula se muere. Si se producen mutaciones, la célula prefiere mutar a morir, e introducirá una mutación.
En el caso de la 8-Oxo-guanina, sí que es mutagénica ya que puede aparear con diferentes bases. Las metilaciones suelen tener efectos letales en las células, debido a la detención de la replicación.
3. Transposición.
La transposición consiste en la facultad que tienen diversos trozos de DNA que pueden saltar de un lado a otro. AL saltar de un sitio a otro del genoma, se integran al azar. Si el Transposón es TAGC y se integra en una secuencia de TATATATA, el gen queda mutado en TATATAGCTATA por lo que genera una mutación. En el genoma humano no has Transposones, pero si fósiles de ellos, no activos.
No toda modificación se considera un daño. La Citosina se puede metilar en el carbono 5, pero no afectaría a nada. Sigue exactamente igual. El organismo utiliza la metilación de la citosina como regulador de la expresión génica.
En un día, una célula debe reparar unos 18.000 sitios apurínicos. Unas 100 desaminaciones de Citosina en Uracilo. 1500 8-Oxo-Guaninas. etc...
5.3. Mecanismo de reparación de apareamientos erróneos (mismatch) Todo mecanismo de reparación lleva una doble tarea, localizar donde esta ese daño y repararlo de forma fiel. Es el mecanismo post-replicativo que hará disminuir la tasa de error de la polimerasa. Existen unas proteínas, que funcionan como dímeros llamadas MutS, que escanean el DNA a lo largo de estos.
Este sistema detecta una distorsión en la molécula, cuando dos nucleótidos no encajan, provocando una distorsión en la hélice de DNA. Cuando esta distorsión se encuentra, la proteína queda allí unida y Biología Molecular Héctor Escribano Tema 5 padece un cambio de conformación. A MutS se le une MutL, que activa una endonucleasa (MutH - que está unida al DNA de forma general, pero no activada) y esta corta la cadena que tiene el error. Una hexonucleasa se come esa cadena hacia donde está el error en sentido 5'-3', eliminando un trozo de DNA monocatenario y con él, el error. El hueco se rellena con una DNA polimerasa y la ligasa une las cadenas cortadas; reparando así el error de emparejamiento. Si MutH estuviese en el otro lado de MutS, también cortaría la cadena del error, pero la hexonucleasa que iría, tendría una polaridad distinta 3'-5', ya que el error queda hacia el otro lado del corte. Existen diferentes hexonucleasas, con polaridades distintas, dependiendo de cada situación.
A nivel de población, este tipo de error (no letal) daría lo mismo que se repararan los errores al azar que no se reparasen; siempre quedaría un 50% de la población mutado y otro 50% normal. Por tanto, la MutH debe ser inteligente para poder saber que cadena cortar. Paul Modrich descubrió el mecanismo. En eucariotas no es el mismo método, pero también hay un método para saber que cadena cortar. En procariotas, una metilasa llamada DAM reconoce la cadena GATC y le añade un metilo a la Adenina. La secuencia GATC aparece en 1/256 nucleótidos. Cuando la cadena se replica, queda una de cada cadena de las dos hélices hijas metiladas, y la pareja no. La MutH reconoce esa secuencia hemi-metilada y se une a ella. Si existe un error en la cadena, MutS reconoce el error, MutL activa a la MutH y MutH corta la cadena que contiene el error, aquella cadena que no está metilada. Si la Metilasa metila la Adenina antes de reparar el error, no se puede saber que cadena es la original, pero no suele metilar antes de tiempo.
La metilación no se considera un daño. Metilar la Adenina en el Nitrógeno 6 no tiene ningún efecto. Que metile en el N 3 o 7, sí que es dañino.
Los tipos de errores se pueden clasificar por el método de reparación: -Reversión del daño: Solo se quita aquello malo, si hay un metilo mal puesto se quita.
-Reparación de Dímeros de timina por fotoliasa en E.Coli (Fotoreactivacion) -Reparación por alquil transferasas Fotoreactivacion La luz UV suele formar dímeros de Timina, al formar enlaces covalentes entre ellos, formando un nuevo anillo de ciclo butano. Los humanos reparan con un sistema genérico. En este caso, la fotoliasa es un reparador específico de este daño.
La fotoliasa va escaneando el DNA, localizando los daños, no necesita que haya luz para detectar los dímeros de Timina. Para separar a las Timinas que se han unido de forma covalente necesita energía para romper el anillo de ciclo butano; y esa energía se extrae de la luz.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 5 Alquil transferasas Es un sistema más general, presente tanto en eucariotas como procariotas. Las proteínas encargadas de esta reparación no son enzimas, son proteínas suicidas, se gastan en la reacción. O-6-MetilGuaninaTransferasa que coge los metilos del DNA y se lo pasa a una cisteína propia, por lo que la cisteína queda ya bloqueada y la proteína debe degenerarse. No se puede volver a utilizar. El gasto en síntesis de la proteína es el precio a pagar por desmetilar el DNA.
-Escisión del daño BER: Base Excision Repair NER: Nucleotide Excision Repair BER Detecta las bases que tienen un daño y la corta, dejando un hueco. Las Glicosilasas son las enzimas encargadas de repararlo. Cada glicosilasa se encarga de un daño específico, por eso hay del orden de 1520 glicosidadas distintas en nuestro genoma. No necesita ir abriendo las cadenas para reparar los daños, van a través del surco mayor, buscando este tipo de errores. Cuando encuentran el daño giran la base errónea hacia fuera (Base Flipping) y cortan la base del azúcar, por el enlace glicosídico. El hueco se rellena con AP endonucleasa, que reconoce cada hueco, corta el enlace fosfodiéster (quizás también se necesite una hexonucleasa para acabar quitando el azúcar) y finalmente una polimerasa rellena el hueco y la ligasa une los trozos. Cuando la AP endonucleasa corta el azúcar, puede que no se lleve solo un nucleótido, sino más de uno. De AP endonucleasas hay de dos tipos, la que solo cortan un enlace fosfodiéster o la que corta los dos. Si deja un fosfato, deben llegar otras enzimas que "limpien" el sitio para que la polimerasa pueda trabajar. Si corta los dos, el sitio ya queda limpio.
NER El NER es tiene muy poca especificidad. Está más enfocado a daños voluminosos, que producen distorsiones. Pero también reparan metilaciones (relativamente pequeñas). Cuando el sistema Uvr forma un complejo UvrAB se unen A y B, es el que localiza el daño con un gasto de ATP. El UvrA se despega del B y el UvrB abre las cadenas. Al mismo tiempo, el complejo del DNA con el UvrB, recluta a la proteína UvrC, una proteína monomérica pero con dos lados; que se une al complejo B, y que corta un trozo de la cadena que contiene el error. El fragmento es de 12-13 nucleótidos, y el error no se sitúa justo en el medio de la secuencia, no es simétrico. El trozo que se corta es degradado por la UvrD (Helicasa) y una polimerasa rellena el huevo y una ligasa une los cachos.
Es un mecanismo genérico que está presente en todos los organismos. En humanos, los complejos se llaman XP, en lugar de Uvr. Alguien que tiene mutaciones en los genes del sistema NER, tiene terminantemente prohibido tomar el sol. Debido a que no pueden reparar los dímeros de timina, provocándose tumores en la piel.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 5 -Roturas de doble cadena (Se arreglan por recombinación) -Recombinación Homologa (Todos los organismos, Tema 2) -NHEJ (Non-Homologous End Joining) (Todos los eucariotas, algunos procariotas) Es el sistema más utilizado en nuestras células para reparar cromosomas. Ya que el primero necesita de dos cromosomas muy similares y muy próximos, solo ocurre cuando se acaban de replicar (en Fase S y G2). La mayor parte del tiempo se pasa en G1. Si en ese tiempo se rompe un cromosoma, se utiliza el segundo mecanismo.
NHEJ La rotura se repara a coste de introducir una mutación. Cuando la cadena se rompe, unas proteínas degradan los extremos 3', dejando los extremos 5' más largos. Las puntas se protegen mediante proteínas de hexonucleasas del medio. Entonces, de las dos cadenas 5', se buscan unos pocos nucleótidos que encajen (micro homología) se corta el sobrante de la cadena 5' que no encaja, y si queda hueco se rellena. Por lo que la secuencia final queda alterada conforme la original al haber eliminado cacho de secuencia.
-Tolerancia al daño No son bien bien sistemas de reparación, pero sí de supervivencia. Si hay errores, las células los reparan.
Pero si hay muchos errores y la célula no da abasto, antes de morir activa estos mecanismos (que no son nada buenos). Antes de morir, prefiere introducir mutaciones. La mayoría de daños impiden la replicación, estos sistemas meten lo que sea en aquellos sitios donde no se sabe que poner en condiciones normales.
-Síntesis Translesión -SOS Cuando se encuentra un obstáculo en la replicación, la polimerasa se para, pero no la Helicasa, que sigue abriendo el DNA. Existen entonces, mucho DNA monocatenario, al cual se les une la proteína RecA. LexA impide que se fabriquen proteínas de algunos genes. Cuando la célula detecta que hay mucho DNA monocatenario, RecA degrada al LexA y se producen proteínas. Esas proteínas son polimerasas indeseables, son polimerasas que se equivocan mucho, por lo que no son muy exigentes con la cadena.
Aunque también se sintetizan proteínas y enzimas que replican de forma fiel el DNA. Las polimerasas poco fieles, a la que encuentran un daño no se paran, ponen algo. Son Polimerasas capaces de replicar por encima del daño, pero introduciendo muchas mutaciones de bases que están bien.
Los humanos no tenemos sistemas SOS, pero sí que tenemos polimerasas de este tipo, Translesión. Que no se expresan normalmente, pero si la célula detecta un problema, sí que se utilizan. La respuesta SOS es específica de bacterias.
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