TÈCNIQUES BÀSIQUES EN BIOLOGIA CEL·LULAR (2014)

Resumen Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura biologia cel·lular
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 05/10/2014
Descargas 11
Subido por

Descripción

TÈCNIQUES BÀSIQUES EN BIOLOGIA CEL·LULAR

Vista previa del texto

SEMINARI 1: TÈCNIQUES BÀSIQUES EN BIOLOGIA CEL·LULAR Microscòpia òptica Amb els microscopis que hem estudiat fins ara, hem pogut estudiar l’estructura, però no la dinàmica del que observem.
Microscòpia de fluorescència Permet veure la dinàmica del que observem, ja que no matem les cèl·lules. Marca les molècules amb fluorocroms (GFP, Green Fluorescent Protein), que captes la llum i la tornen a emetre amb una longitud d’ona més gran, és a dir, que té menys energia. El fluoròfor és la part de la molècula capacitada per fer-ho.
Per exemple, un fluorocrom marcat de color blau, el veurem al microscopi òptic de fluorescència de color verd.
Aquest microscopi és com el microscopi òptic, l’únic que té més components: llum fluorescent (làmpada) i filtres.
La microscòpia de fluorescència es basa en que certes proteïnes contenten components que la fa fluorescents, anomenats fluoròfors. el fluoròfor absobeix la llum radiant i posteriorment emet llum fluorescent. En absorbir la llum, els electrons del fluorofor passen del seu estat energètic estacionari, és a dir, del estat mínim d’energia, a un estat energètic superior. Es diu, per tant, que el fluorofor queda excitat. En tornar a l’estat energètic estacionari es produeix l’emissió de llum fluorescent. La llum emesa per una molècula tindrà una longitud d’ona superior a la radiació original absorbida per aquesta. S’emet molt ràpidament, ja que la molècula excitada tendeix a recuperar un estat més estable.
L’espectre d’absorció o excitació i d’emissió és característic de cada fluorofor i depèn dels nivells d’energia dels seus electrons i de l’energia dels estat excitats.
La microscòpia de fluorescència consisteix en exposar una mostra a llum ultraviolada, violada o blava, per posteriorment registrar la imatge a partir de la llum fluorescent que emet la mostra. La làmpada emet una llum molt intensa que passa a través d’un filtre d’excitació, encarregat de deixar passar només la llum en el rang de longituds d’ona desitjada.
A continuació, la llum que ha travessat el filtre d’excitació es reflexa en la superfície d’un mirall dicromàtic. Dirigeix la llum cap a l’objectiu i té la propietat de deixar passar una franja molt curta de longitud d’ona i reflectir tota la resta.
En aquesta primera fase d’il·luminació de la mostra l’objectiu actua com a condensador, emetent un con de llum per il·luminar i excitar la mostra.
La mostra, en veure’s excitada per la llum d’excitació, emet la llum fluorescent. Aquesta realitza en part el camí invers al seguit per la llum d’excitació, passant novament a través de l’objectiu (que, en aquest cas, actua com a tal augmentant la imatge de la mostra) i posteriorment pel mirall dicromàtic. A continuació passa a través del filtre d’emissió que és l’element encarregat de bloquejar les longituds d’ona de llum corresponents a la llum d’excitació per deixar passar només la llum fluorescent.
Colocalització Solament podem veure en el microscopi un sol tipus de molècules marcades, però si que podem fer-ne una fotografia i aleshores marcar una altre molècula, d’aquesta manera, al solapar les imatges, queden les dues molècules marcades.
L’ADN acostuma a estar marcat i és de gran ajuda alhora de contar el número de cèl·lules.
Microscòpia confocal És un microscopi capaç d’obtenir imatges tridimensionals de la cèl·lula. Es basa en un principi similar al d’un microscopi de fluorescència, però s’utilitzen dos diafragmes confocals (un abans de la mostra i l’altre després) capaços d’enfocar la il·luminació en un únic punt de la mostra. S’utilitza un làser com a font lluminosa, i amb aquest es va rastrejant la mostra per tot el seu volum, ja que per molt prim que sigui el gruix de la mostra aquesta té diferents plans, pla a pla, crea moltes imatges bidimensionals que un ordinador interpreta, generant finalment una imatge tridimensional de l’objecte. (Pinhole selecciona el pla visual que fotografia).
Per observar preparacions amb aquest microscopi és necessari tenyir-les amb substàncies fluorescents o marcar-les amb substàncies conjugades amb fluorocroms, com els anticossos.
FRAP: Fluorescense Recovery after Photobleaching Aquesta tècnica s’utilitza en microscopis fluorescents o confocals, es basa en que el làser crema una part de la mostra, aleshores en aquesta part deixa de veure’s la fluorescència i apaguem la llum fluorescent. Es fan fotografies fins que es torna a veure del tot la part de la mostra que no es veia, ja que és una tècnica in vivo.
Ens serveix per saber el temps que tarden en omplir l’espai molècules d’altres zones: DINÀMICA DE DIFUSSIÓ.
Permet la quantificació de molècules d’interès a través del temps de recuperació de la fluorescència després d’un “fotocremat” làser.
FLIP: Fluorescense Loss In Photobleaching És una tècnica molt semblant a l’anterior, però en aquest cas no la deixem d’irradiar, veiem com es perden les molècules del voltant, ja que es mouen cap a la zona on es cremen: DINÀMICA DE DIFUSSIÓ. Es torna a fotografiar i fer una gràfica.
FRET: Fluorescense Resonance Energy Transfer És una tècnica fluorescent que permet la investigació de les interaccions moleculars. Esta basada en la transferència directa d’energia d’una molècula a una altre, la qual pot ocórrer en distàncies molt petites (1-10nm). Estudia la proximitat de dues molècules, dos fluorocroms. Si estan a prop, i l’espectre d’absorció és proper: quan s’excita una i aquesta irradia energia a l’altre, aquesta segona també s’excita i emet fluorescència.
Ens permet analitzar la unió de dues proteïnes si marquem cada una amb un dels dos fluorofors. Si les proteïnes estan separades, no estaran suficient a prop per produir fluorescència del segon fluorofor. Però si estan unides, si que ho emetrà.
TIRFM: Total Internal Reflectance Fluorescence Microscopy Filtra tota la llum que tenim a partir d’una distància determinada. Permet que només s’observi una regió que fa com a màxim 200nm.
TÈCNIQUES BIOQUÍMIQUES Immunocitoquímica ANTICOSSOS: reconeixen proteïnes específiques. Es marquen no fluorocroms, sinó que també amb enzims i GTP.
només amb Proteïnes de fusió i transfecció cel·lular Podem aportar de DNA extern als cultius per tal de que creïn coses noves. Es treballa amb plasmidis, petits fragments de DNA autoreplicatius. Té tres zones importants: el seu origen de replicació, la regió promotora (per posar-li la seqüència que jo vulgui) i una regió “etiqueta” on posem una seqüència d’aminoàcids per tal de marcar -lo.
Els creem nosaltres i els transmetem dins de cèl·lules eucariotes, on hi haurà sobre població de la seqüència que hi hem posat. Aquesta proteïna la veurem fluorescent.
Els anticossos tenen quatre cadenes: dues pesades (llargues) i dues lleugeres (curtes). Solament té una petita fracció variable (Fv, part fosca), tot el demés és constant per a tots els anticossos (Fc, part clara). Per tant, per fer el reconeixement només necessitem la regió variable.
Introduir una proteïna en un individu és com les vacunes; s’introdueix inoculant una part o sencera, aleshores s’uneixen anticossos que s’enganxen per diferents llocs.
Aquests anticossos poden ser: - Policlonats: si provenen de diferents limfòcits.
Monoclonats: si provenen d’un sol limfòcit.
L’utilització d’anticossos és universal, però per tal de veure’ls s’han de marcar: fotocroms o enzims.
- - - DIRECTA: l’anticòs primari (el que visualitza la nostre proteïna) ja està marcat. És la més simple però la més sensible.
INDIRECTA: l’anticòs primari reconeix a la proteïna, però aquest no està marcat. La fracció constant és específica per cada espècie, per tant posem un anticòs marcat que reconegui aquesta part. Pot posar dos anticossos secundaris; un a cada cadena pesant. Això amplifica la senyal, la dobla.
Es creen de secundaris marcats perquè és més fàcil que crear-ne un primari específic per cada proteïna.
TÈCNIQUES DE PONT: augmenta encara més la senyal, ja que a vegades, si n’hi ha poques, és difícil veure la proteïna amb anticossos secundaris. En aquest cas l’anticòs secundari està unit a un enzim (bilina) que alhora està unida amb altre bilines, aquestes estan marcades. Igual que en la marcació indirecta, això pot passar en cada cadena pesant de l’anticòs primari.
En el cas dels fluorocroms és molt més fàcil veure’ls, però no tenen color, així que s’han de rebel·lar: quan posem l’enzim amb el substrat. Un exemple de substrat és el DAB que podem rebel·lar de diferents colors: sulfat amònic de níquel (color blau fosc), sulfat de coure (color vermellós), clorur de cobalt (color negre)....
Western blot SDS-PAGE És molt freqüent analitzar les proteïnes per la seva estructura primària. Aixafant un teixit fins a deixar-ho en forma líquida.
Per exemple: la tubulina, que forma un dímer. El SDS-PAGE separa el dímer de l’estructura quaternària, de la terciària passem a la secundària trencant els enllaços covalents i no covalents i per últim trenca els ponts d’hidrogen per arribar a l’estructura primària. A més, l’SDS-PAGE iguala la càrrega, ho deixa tot negatiu.
L’únic que no pot aconseguir és trencar els ponts disulfurs, per això hi afegim una solució reductora com pot ser: β-meraptoetanol. Moltes vegades també ho escalfem per ajudar.
Fem una electroforesis d’aquestes estructures primàries i les fem migrar en un gel. Només es diferencien pel pes molecular, ja que tenen les mateixes condicions desnaturalitzants i reductores (estructura primària i càrrega negativa). Migraran del pol negatiu al positiu i se separaran en funció del pes molecular, les més petites quedaran més a prop del pol positiu (normalment s’utilitza un marcador del pes molecular).
Quan ja han migrat les proteïnes, tenim dues opcions: - - TINCIÓ: ja que inicialment no les veiem. S’han de tenyir amb colorants, com per exemple: o Coomassie: la més fàcil però menys sensible.
o Nitrat de plata: és molt més sensible.
TRANSFERÈNCIA: si el que vull no és veure-les totes, sinó només veure una proteïna en concret, aleshores transferim les proteïnes a una membrana porosa, que pot ser de diferents materials, i es munta com un “sanwich”: papers,etc per fer pressió. També funciona amb corrents elèctriques.
Passaran del gel a la membrana. Aleshores farem un protocol Western blot (rentar, etc.) i acabarem tenint les nostres proteïnes marcades amb anticossos primaris i secundaris (peroxidasa). Aleshores es rebel·la i d’aquesta manera tindrem un rebel·lat diferents per a cada mostra.
Immunoprecipitació Ens serveix per saber si dues proteïnes interaccionen físicament.
En una barreja de proteïnes hi posem un anticòs. Remenem tota la barreja per tal de que l’anticòs quedi en contacte amb tota la proteïna, que pot ser, per exemple, l’actina.
Normalment s’utilitza com a anticòs la proteïna A o la proteïna G, que poden estar lligades a unes boles d’agarosa o sefarosa, que l’únic que fan és donar-li pes perquè al centrifugar la barreja baixi tot el complex. Per exemple: actinaproteïnaA-agarosa.
Coimmunoprecipitació Això que hem immunoprecipitat, li fem una electroforesis Blot overlay És molt semblant a Western blot (electroforesis d’homogenat) però en comptes de fer servir anticossos, fem servir lligants per marcar les proteïnes. Molts cops fem servir isòtrops.
...