Genètica Temes 6, 7, 9 : elements genètics mòbils, lligament i recombinació, replicació i estructura del DNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Genética
Año del apunte 2014
Páginas 24
Fecha de subida 03/09/2015
Descargas 3

Vista previa del texto

Final tema 6 Transposons i elements genètics mòbils Totes les espècies d’organismes vius pateixen mobilitzacions de fragments del seu material genètic.
El primer element mòbil que es va identificar va ser l’IS1 en Escherichia Coli. IS1 és una seqüència d’inserció. Les seqüències d’inserció consten de dues parts: un gen que codifica per a la transposasa (enzim) al mig, i dues seqüències “inverted repeat” a cadascun dels extrems. El gen transposasa codifica informació per saltar a un altre loci dins del cromosoma. Aquest cas concret no aporta res excepte la seva presència física. Si codifica per una altra característica (resistència a un antibiòtic, per exemple) parlem d’un transposó.
Perquè l’element es pugui transposar cal que en el DNA receptor es produeixi un tall esglaonat. Quan s’insereixi l’element quedaran dos forats que s’ompliran per complementarietat de bases de la seqüència original.
Existeixen dos mecanismes de transposició: - Conservativa: el transposó s’allibera del seu lloc original i s’insereix dins d’un altre loci en el mateix genoma. No augmenta el nombre de material genètic de la cèl·lula.
No conservativa: es produeix un tall en el genoma donador del transposó, i aquest s’integra en el genoma acceptor gràcies a l’enzim transposasa.
o No replicativa: el tros de genoma del donador és escindit i només queda el transposó. Procés dut a terme per la resolvasa.
o Replicativa: un cop tenim el tros de genoma donador inserit dins del genoma hoste, l’ADN polimerasa replica aquest fragment i forma un “cointegrat”. Després la resolvasa uneix dos extrems (“recombinació recíproca”) de manera que queda el genoma donador igual que al principi i el genoma acceptor amb una còpia del transposó.
1 Una altra classificació dels transposons és segons si són simples o compostos.
- - Compost o Tn: porta en els seus extrems 2 seqüències d’inserció (una a cada extrem) directe o inversa i una regió central amb la transposasa que a més conté informació per a resistència o alguna altra cosa.
Simple, element d’inserció (IS): conté seqüència central amb informació per a la transposasa i als extrems una seqüència repetida en ordre invers.
En eucariotes, la transposició pot ser de tipus I o de tipus II: - Tipus I: replicació via RNA intermediari mitjançant la retrotranscriptasa; també són coneguts com retrotransposons. Poden ser amb o sense LTR. En altres paraules, per replicar el transposó es necessita la cogeneració d’un RNA intermediari.
(DNA (transposó)RNADNA transposable) 2 Els transposons de tipus I els podem classificar entre: o LTR: long terminal repeats, com Ty1, MoMLV o Copia.
o Sense LTR com L1 (humà). Els LINEs són Long Interspersed Elements. SINE i LINE són un tipus de transposó L1 en humans. ORF és un “open reading frame”, una seqüència de DNA que correspon a una unitat funcional. No sempre la llargada del fragment correspon amb la llargada de la proteïna. Tenen senyal d’inici i també d’STOP.
- Tipus II: procés de replicació via transposasa mitjançant procés de tall i unió. Mecanisme clàssic.
Disgènesi híbrida Als anys 70, Kidnell va observar en Drosophila que quan feia encreuaments recíprocs entre mosques de laboratori i mosques salvatges donaven resultats diferents. En l’encreuament disgènic la descendència era defectuosa i no podia reproduïr-se: tenien moltes mutacions, els mascles presentaven recombinació meiòtica, anomalies morfològiques... .
Aquest fenomen és degut a que els individus salvatges pot ser que hagin adquirit una sèrie d’elements mòbils. A més hi ha un sistema que reprimeix la transposició, és a dir, que encara que hi hagi transposons aquests no es mobilitzen i per tant no s’observen els seus efectes; és con si no n’hi haguessin. Els efectes de la disgènesi híbrida es veuen influenciats per la temperatura. Si aquesta és superior a 20 graus, els resultats són diferents.
Els elements p són transposons. En el citoplasma dels individus salvatges hi ha molècules repressores que impedeixen la mobilització dels transposons.
Quan no hi ha aquest repressor es produeix la mobilització dels elements i per tant la disgènesi híbrida es posa de manifest.
3 Quan es posa en evidència que els transposons estan en tots els éssers vius es veu que representa una part molt important del genoma. En el cas dels humans, tenim les seqüències LINE i SINE, que són milers de còpies d’un nombre determinat de parells de bases.
- LINEs: 850000 còpies de 6000-8000 pb. Representen el 21% del genoma humà.
SINEs: 1,5 milions de còpies d’entre 100 i 300 pb que representen el 13% del genoma humà.
*Notes random: - El DNA fòssil és aquell que no té cap funció, només és una relíquia de l’història evolutiva.
- Els elements autònoms són aquells que als extrems tenen IS i poden saltar a diferents loci del genoma.
4 Tema 7 – lligament, recombinació i mapes en eucariotes L’entrecreuament o crossover és l’intercanvi genètic entre cromàtides no germanes de cromosomes homòlegs durant la meiosi.
La imatge mostra una parella de cromosomes homòlegs, dels quals A,B i a,b són gens lligats (Diem que dos gens estan lligats quan es troben en el mateix cromosoma.). La imatge posterior mostra el resultat de l’entrecreuament. Entre A i B s’ha produït un quiasma, que ha conduït a l’intercanvi físic de material genètic.
Els quiasmes poden migrar al llarg del cromosoma. Només sabrem com s’ha produït el crossover quan s’hagi resolt (és a dir quan s’hagin separat les cromàtides). La última part de la imatge mostra els quatre tipus de gàmetes que obtindrem, dels quals el 50% són parentals i l’altre 50% són els recombinants.
La recombinació genètica és el producte de l’entrecreuament entre cromosomes en heterozigosi.
La freqüència nul·la de recombinació entre dos gens lligats és que estan físicament molt a prop, i per tant la probabilitat de que es produeixi un quiasma és tan baixa que podem dir que pràcticament és zero. Si els gens dins d’un mateix cromosoma estan molt allunyats considerarem que la seva segregació és independent i que per tant la freqüència de recombinació és tan alta com la parental (50%).
La freqüència de gàmetes recombinants ha d’estar entre 0 % (lligament total) i el 50% (segregació independent) 0% < freqüència de gàmetes recombinants (FR) < 50% 5 Exemple: exercici 5. Entrecreuament simple.
En el ratolí casolà el caràcter trembling/normal i rex/pèl llarg estan controlats cadascun d’ells per un parell d’al·lels autosòmics. Els al·lels per trembling i rex són dominants. En encreuaments de femelles heterozigòtiques per ambdós caràcters amb mascles normals de pèl llarg es van obtenir els resultats: Trembling, rex: 21 Trembling, long: 52 Normal, rex: 54 Normal, long: 22 La prova irrefutable de que els dos gens estan lligats (és a dir, que es troben dins d’un mateix cromosoma) és que l’encreuament descrit en el cas és prova, i se sap que si les proporcions fenotípiques de la descendència són diferents de 1:1:1:1. (aproximadament és 1:2:2:1 en el nostre cas).
Pot ser possible que dos individus tinguin el mateix fenotip però que els gàmetes siguin diferents. Quan en un mateix cromosoma hi ah els dos dominants o els dos recessius diem que els gens estan en configuració acoblada o en cis. Si estan al revés estan en configuració trans o repulsió. Observem en el nostre cas que els caràcters recessius (normal, long) estan en minoria. Perquè això sigui possible cal que els gens dels progenitors estiguin en fase trans o repulsió.
El percentatge de recombinació és la suma del nombre d’individus amb fenotips minoritaris dividit entre el nombre total d’individus. En el nostre cas: 21+22/ 149= 0,28  28% de gàmetes recombinants. Fins el 30% s’accepta com a un valor acceptable. Recordem que no poden superar el percentatge de gàmetes parentals.
La prova de que hi ha lligament és una desviació en les proporcions mendelianes, és a dir, que en un encreuament dihíbrid prova les proporcions seran diferents a 1:1:1:1.
Cal no confondre els intercanvis que corresponen a cromàtides de cromosomes homòlegs amb els intercanvis que es produeixen entre cromàtides germanes. Els intercanvis d’aquest últim tipus no incrementen la variabilitat en la cèl·lula (no generen cromàtides recombinants), doncs tenen la mateixa informació pels caràcters.
6 A vegades dins d’una regió cromosòmica poden aparèixer més d’un quiasma; aleshores diem que ha succeït un entrecreuament múltiple. És molt poc probable que passi. El fenomen de la interferència consisteix en què la formació d’un quiasme desafavoreix que es formi un altre quiasme a la seva vora. Quan hi ha interferència la freqüència de dobles recombinants no correspon al producte de les freqüències de recombinació senzilla.
Quan la coincidència és 1, la interferència és zero C=1, I=0 Quan la coincidència és 0, la interferència és u C=0, I=1 Si els entrecreuaments múltiples es dónen de manera independent, la freqüència dels dobles encreuaments és el producte de les freqüències dels entrecreuaments senzills 𝐶 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑖𝑛𝑐𝑖𝑑è𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝑛º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑡𝑠 𝑛º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑠 𝐼 = 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑓𝑒𝑟è𝑛𝑐𝑖𝑎 = 1 − 𝐶 Exemple: problema 2. Entrecreuament múltiple.
En el tomàquet els gens o, o s estaven al cromosoma 2. A partir de les dades obtingudes d’un entreuament prova d’un heterozigot de la F1 pels 3 gens amb un homozigot recessiu amb els mateixos gens, determineu els coeficient de coincidència: Fenotips de la progènie l’encreuament prova +++ ++s +p+ +ps o++ op+ ops o+s de Número de descendents 73 348 2 96 110 306 63 2 Què són? Recombinant simple II Parental Doble Recombinant Recombinant simple I Recombinant simple I Parental Recombinant simple II Doble Recombinant Els gàmetes parentals són els més freqüents. Per tant els cromosomes parentals seran ++s i op+.
Per determinar quin és el marcador central en un mapa genètic de tres punts, cal observar els dobles recombinants de la descendència. La posició dels altres dos punts només té sentit si es sap la posició respecte el centròmer. A més, a vegades és possible que hi hagi entrecreuament entre el gen i el centròmer. Si el gen es troba molt a prop del centròmer: probabilitat de que l’esdeveniment succeeixi tendeix a zero. En canvi, si el gen està a una distància raonable respecte el centròmer: pot ser possible l’entrecreuament. Els gàmetes dobles recombinants són els menys freqüents ( +p+ i o+s). El marcador central és o.
La seqüència dels gens en el cromosoma serà p-o-s o bé s-o-p (és indiferent).
7 Encreuaments 𝑃 𝑠 + + +𝑜𝑝 𝑥 𝑠 + + +𝑜𝑝 𝐹1 (𝑒𝑛𝑐𝑟𝑒𝑢𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑣𝑎) 𝑠 + + 𝑠𝑜𝑝 𝑥 +𝑜𝑝 𝑠𝑜𝑝 Càlcul de les distàncies: distància s-o: f(rec.simple II)+ f(rec.doble)= 73+63+2+2 1000 distància o-p: f(rec.simple I) + f(rec. doble)= = = 14% 96+110+2+2 1000 = 21% 73+63+96+110+[(2+2)∗2] 1000 distància s-p: f(rec.simple I)+ f(rec. Simple II) +[ f(rec.doble)*2]= s o = 35%  additivitat! p Càlcul del coeficient de coincidència (c): 𝐶 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑖𝑛𝑐𝑖𝑑è𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝑛º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑡𝑠 𝑛º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑠 𝑛º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑡𝑠: 2 + 2 = 4 → 4/1000 𝑛º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑠: 𝑑𝑖𝑠𝑡à𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑠 − 𝑜 𝑥 𝑑𝑖𝑠𝑡à𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑜 − 𝑝 = 0,14𝑥0,21 = 0,029 𝐶= 4/100 = 0,14 → 14% 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑖𝑛𝑐𝑖𝑑è𝑛𝑐𝑖𝑎 0,029 Amb un valor com aquest de coincidència (baix) podem considerar que la interferència és alta.
Mapes genètics Un mapa genètic determina la distància entre gens a partir d’encreuaments i els seus recombinants. No és el mateix que un mapa físic. És més, els gens que físicament són molt propers estan genèticament allunyats.
Per elaborar-los, partim del supòsit que les freqüències de recombinació depenen de la distància entre gens, en tant que com més a prop estigui dos gens més baixa serà la freqüència de recombinació.
1 unitat de mapa (u.m.) = 1 centiMorgan (cM) = 1% de freqüència de recombinació El nombre d’entrecreuaments per divisió meiòtica per cromosoma segueix una distribució de Poisson: 8 Més distància entre gens  més alta la probabilitat d’entrecreuament Més alta la probabilitat d’entrecreuament  més recombinació Més distància entre gens  més recombinació En analitzar dos gens estem elaborant un mapa de dos punts. Però per poder analizar la distància entre ells necessitem un tercer punt. Si tinc dos punts i es dóna un quiasme, ho detecto a la descendència. Però si es dóna més d’un quiasme (entrecreuament dobre, triple, etc.) passaran desapercebuts perquè la progènie serà igual que si hi hagués hagut un sol entrecreuament; es produïrà una subestimació de la distància que és poc destjable perquè portarà a conclusions errònies.
El principi d’additivitat només es compleix en entrecreuaments simples.
Exemple. Exercici 10. Mapa genètic de tres punts.
El mapa de lligament de tres gens recessius a,b,c lligats és: a 12 b 8 c Coef. De C: 0,6 Freqüències fenotípiques de l’encreuament: 𝑎+𝑐 +𝑏+ 𝑥 𝑎𝑏𝑐 𝑎𝑏𝑐 ? Gàmetes del progenitor heterozigòtic: - Parentals: a+c, +b+ Recombinant senzill I : ++c, ab+ Recombinant senzill II : a++, +bc Dobles recombinants: abc, +++ Freqüències de dobles recombinants esperades: 𝑑(𝑎,𝑏)+𝑑(𝑏,𝑐) 12+8 = 100 100 = 0,58% Freqüències de recombinants senzills: - Recombinants senzills I : d(b,c) – f.Dobles recombinants = 8-0,58= 7,42 Recombinants senzills II : d(a,b) – f. Dobles recombinants= 12- 0,58=11,42 Demostració citològica de l’entrecreuament Els cromosomes canvien de patró de tinció dins de la regió determinada on es produeixen els quiasmes .
Amb una tinció poden posar-se de manifest aquestes regions i es poden quantificar els quiasmes. La tècnica emprada s’anomena “tècnica dels cromosomes arlequinats”.
9 És possible establir la distància física entre dos gens.
La relació entre distància física i genètica no és unívoca; depèn de la dinàmica recombinatorial.
[C] – també anomenat “valor c” o contingut és el valor haploide de la mida del genoma. Serveix sobretot per comparar mides de genomes entre procariotes i eucariotes.
Cal notar que una unitat de mapa d’un bacteri serà més petita que la d’un ratolí, perquè el genoma del bacteri té molts menys parells de bases i per tant és més petit.
L’abundància de quiasmes pot indicar fragilitat cromosòmica, doncs un quiasme és un punt de ruptura.
Alhora, la fragilitat cromosòmica està associada a patologies importants. A nivell experimental es pot aconseguir amb l’aplicació de substàncies químiques o mètodes físics.
Quan s’elaboren mapes genètics d’humans, els marcadors establerts sempre corresponen a gens pertanyents a cromosoma X. Es fa per convenció històrica i per comoditat.
Anàlisi de tètrades Se sap que en la gametogènesi tenim la formació de 4 productes n, sent 2n la dotació cromosòmica total de l’organisme. En femelles d’animals superiors d’aquests 4 gàmetes sols un és viable. Altres organismes com els fongs fan espores. Hi ha un tipus de fong (ascomicets) que en fer la meiosi i obtenir les espores aquestes són guardades en paquets de 4 unitats. La meiosi sempre ve seguida d’una mitosi addicional. L’ascomicet, per tant, tindrà 8 espores. Degut a les característiques físiques d’aquest fong, podem observar com estan col·locades les espores linealment dins de l’asca (el paquet que conté les espores) i analitzar si hi ha hagut segregació a la primera o a la segona divisió meiòtica. Com que hi haurà hagut una segona divisió no tindrà una tètrada sinó una òctada. La duplicació dels productes no altera en absolut les freqüències de recombinació.
10 Entrecreuament mitòtic i càncer L’entrecreuament mitòtic es produeix en tots els organismes vius. Un exemple molt clar dels efectes d’aquest fenomen és el retinoblastoma hereditari. Veiem que hi ha diferències pel que fa a la penetrància del gen: n’hi ha que tenen el gen però no l’expressen (no ha penetrat).
No hi ha cap procés carcinogènic en el qual hi hagi implicat un sol gen. Com a mínim n’hi ha 4, 5 o 6.
Exemple - gen R : supressor de tumor. La progènie amb Rr o RR no manifestarà el tumor. Però ens trobem amb un individu Rr que sí que el manifesta. Pot ser que hagin succeït dues coses: - En alguna cèl·lula de l’ull es dóna una mutació - Procés de recombinació mitòtica.
Perquè una cèl·lula normal esdevingui tumoral hi ha d’haver més d’una mutació.
- Oncogens: quan són activats inicien el procés carcinogènic.
Gens supressors de tumors/antitumorals: si s’activen aturaran el procés carcinogènic. En autòpsies s’ha observat com hi ha nòduls potencialment tumorals que no han arribat a evolucionar degut a l’acció dels gens antitumorals.
Els gens implicats en la resposta immune reconeixen les cèl·lules canceroses com a cosos estranys; per tant les persones amb un sistema immunitari adequat poden frenar o alentir el procés carcinogènic.
Altres Alozim: són enzims que presenten diferents al·lels per a cada loci, dit d’altra manera, són enzims que fan la mateixa funció però vénen codificats per loci diferents.
RFLPs són polimorfismes en la llargada dels fragments de restricció en el DNA. Els enzims de restricció tallen en seqüències diana dins del genoma. La finalitat primera dels enzims de restricció bacterials és l’eliminació del DNA forani que hagi pogut entrar. Els talls en diferents espècies seran diferents entre ells degut a les variacions nucleotídiques del DNA o RFLPS.
DNA microsatèl·lit: seqüències curtes de DNA repetides moltes vegades i distribuïdes en tota la llargada del genoma.
11 Formació d’un heterocariont. Determinació de la posició d’un gen dins del genoma.
Les hibridacions es fan entre cèl·lules humanes i de ratolí o primat. El tipus cel·lular depèn, doncs totes les cèl·lules porten els mateixos cromosomes, tot i que usualment s’utilitzen fibroblasts.
Cèl·lula H  23 Cromosomes Cultiu mixt  les cèl·lules de diferent procedència s’uneixen i en un principi formen un heterocariont.
Cèl·lula R  Y cromosomes Per obtenir aquest híbrid (que tindrà dues dotacions cromosòmiques) hi ha dues estratègies: - Química: aplicar polietilenglicol, que permet la fusió cel·lular Virus atenuat (Sendai).
Mai aplicarem les dues alhora! L’heterocariont tindrà dos nuclis en un principi però després esdevindrà sincariont, en el qual els dos nuclis s’hauran fusionat en un de sol. Si permeto que es vagi dividint observarem (amb independència de la naturalesa cromosòmica de les dues dotacions) que els cromosomes de ratolí es mantenen però els d’humans no, fins que al cap de X divisions es quedaran molt pocs (1 o 2 com a molt).
Si arribo a la situació en la qual quedin dos cromosomes humans, puc detectar su allà hi ha el gen que vull identificar. Aquesta tècnica, per tant, serveix per saber la localització específica d’un gen dins del conjunt de cromosomes d’un organisme. També em permet saber si dos gens estan lligats o no. Nota: aquesta tècnica només és vàlida si el gen que busques fa un enzim que l’altra espècie no fabrica.
12 Tema 9 (I) – Replicació i estructura de l’ADN.
Experiment de Griffith - A l’any 1928 encara no es sabia que el material genètic era el DNA; es pensava que eren les proteïnes. Quan es feien estudis sobre això, sempre que es caracteritzava el “material transformant” l’anàlisi químic revelava que era proteïna. Un dels experiments que es va fer va ser el famós experiment de Griffith. Tenim la soca llisa (smooth, sense coberta polisacarídica) i la rugosa (rough, amb coberta polisacarídica). Aquestes són inoculades en ratolins: els infectats amb la soca S morien de pneumònia i els R vivien. S va ser inactivada per calor, i inoculada en ratolins, que evidentment no van morir. S inactivats van ser inoculats conjuntament amb R vius, i llavors els ratolins van morir de pneumònia. Hi havia alguna cosa en aquest últim inòcul (“principi transformant”) que feia que R passés a ser virulent.
Anys més tard, Avery, Mc.Carthy i Mc. Leod van descobrir que aquest principi transformant era el DNA. Hi havia 4 possibles candidats a ser el material transformant: RNA, DNA, proteïnes i coberta polisacarídica. Es va fer un experiment en el qual es van aïllar els quatre materials, i es va observar que el “principi transformant” tenia una composició química molt similar a la del DNA. Es va observar que afirmativament el DNA era el que causava la transformació dels bacteris innocus en virulents.
DNA soca no virulenta + fragment de DNA de bacteri virulent  DNA soca bacteriana virulenta Si el factor virulent és transmès és evident que es tracta de material genètic Als anys 40, les tècniques de purificació eren poc perfeccionades i encara als extractes de DNA analitzats podia quedar-hi restes de proteïnes. Per tant la hipòtesi que el material genètic estigués format per aquestes molècules no estava descartada del tot. Ja als anys 60 es va confirmar que tot el pes de la informació genètica queia en el DNA.
13 Components dels àcids nucleics Tenim dos tipus d’àcids nucleics: - Àcid ribonucleic  RNA. A diferència del DNA, té un sucre ribosa, no té timines sinó uracils i normalment és monocatenari.
Àcid desoxiribonucleic  DNA  es considera de forma general (exceptuant virus) que és la molècula que forma el material genètic.
Els seus components principals són [fosfat + sucre (ribosa/desoxiribosa) + base nitrogenada (púrica/pirimidínica)] 14 La molècula de DNA té una estructura bicatenària (funcional), amb les cadenes antiparal·leles 3’ → 5’ 5’ ← 3’ RNA DNA 15 Regles de Chargaff Proporció de purines = proporció de pirimidines A=T Estructura doble hèlix del DNA El treball de Watson i Crick (1953) va ser publicat al Nature. Ells només van fer una síntesi dels treballs que s’havien publicat anteriorment i a partir d’això van deduïr l’estructura del DNA. Les dues línies d’evidència van ser: - Regles de Chargaff Fotografies de difracció de raigs X. Linus Pauling havia estudiat cristalls de moltes proteïnes, i tenia molt clara la forma d’hèlix alfa. Rosalind Franklin va aplicar aquesta tècnica al DNA i va obtenir un difractograma de la molècula.
G,C i estabilitat del DNA Es va observar que en augmentar la temperatura, el DNA es desnaturalitzava, és a dir, es trencaven els ponts d’hidrogen i es separaven les dues cadenes. Si una regió concreta del DNA tenia més alt percentatge de G i C costava més de separar i necessitava més temperatura.
Si desnaturalitzo suaument el DNA, aquelles parts de les cadenes que són complementàries es tornaran a unir i podrem re-naturalitzar el DNA.
Un pont d’hidrogen és un enllaç feble. El que otorga la força i estabilitat és el gran nombre d’aquest tipus d’enllaços que hi ha en la molècula.
Ponts d’hidrogen entre bases complementàries: 16 G≡C A =T La informació genètica pròpiament són les bases nitrogenades. Alguns autors afirmaven que estaven encarades cap a l’exterior, la qual cosa va ser refusada per la teoria de Watson i Crick.
Sentit de gir de l’hèlix La forma “DNA B” és la forma activa del DNA i és una doble hèlix dextrògira.
Se sap que les formes W i C del DNA no són les úniques formes que presenta el DNA. Dels diferents models que s’han descrit hi ha una forma anomenada DNA Z (“zig-zag”). Apareix en regions concretes dels nostres cromosomes. Aquest DNA Z gira en sentit levògir i pot estar associat amb la pèrdua de funcionalitat d’aquesta molècula.
PARÀMETRES DEL DNA B Distància entre bases adjacents: 3,4 A Pas de rosca: 34 A Diàmetre: 20 A 17 Procés de transcripció/replicació del DNA Perquè les cadenes puguin participar en la transcripció cal que s’obrin, produïnt-se una nova doble cadena perfectament complementària. L’estabilitat de la doble cadena es manté per ponts d’hidrogen febles però com que n’hi ha molts és fort. Si els enllaços fossin covalents s’hauria de consumir massa energia per obrirlos i no seria viable.
Possibles models de replicació Un cop ja sabem com és el DNA, hem de saber com es replica. Com es sintetitza el DNA en la nova cèl·lula? Es van establir diverses hipòtesis o teories.
Abans de que es demostrés que la replicació era semiconservativa també es creia que era conservativa o bé dispersiva.
Experiment de Meselson i Stahl Van demostrar la validesa del model semiconservatiu de replicació gràcies a aquest experiment. Van cultivar bacteris E.coli durant moltes generacions en medi amb N-15. Tot el material genètic dels bacteris cultivats en aquest medi és nitrogen marcat. Després alguns bacteris d’aquest cultiu van ser transferits a un medi amb N-14. La primera mostra de DNA (generation 0) és obtinguda directament del pot de N-15; la mostra és molt 18 densa. A mesura que es van desenvolupant generacions de bacteris al medi amb N-14 la densitat del DNA va disminuïnt progressivament, perquè el DNA de nova síntesi conté N-14 (isòtop lleuger).
Replicació del DNA a nivell molecular La síntesi de DNA no té per què estar restringida a l’etapa S del cicle cel·lular. Podria ser que la cèl·lula necessités sintetitzar un tros de DNA en algun altre moment de la seva vida; per exemple omplir un buit generat per un procés de reparació. És el que anomenem síntesi no programada.
El procés de replicació o duplicació del DNA és un procés ideat per a la divisió cel·lular: s’ha de duplicar el DNA per moder mantenir la constància cromosòmica.
En els diferents processos de transcripció, replicació, etc. hi participen enzims específics. El més important és la DNA polimerasa, que s’encarrega de la síntesi de DNA, dit en altres paraules, de la polimerització dels dNTPs.
Afegeixen els nucleòtids en sentit 5’  3’. Entre altres, les funcions que té inclouen la capacitat de corregir errors.
Diferències entre les polimerases procariotes i eucariotes Tot i que tenen els seus equivalents funcionals, distingim uns tipus de polimerases o altres en funció del tipus cel·lular. Nota: les lletres gregues en polimerases indiquen que són eucariotes. Per exemple, la DNA polimerasa I de bacteri té el seu equivalent de DNA polimerasa α en eucariotes: Procariotes - DNA polimerasa I: s’encarrega d’omplir els buits in vivo si hi ha errors. In vitro podem sintetitzar tot un cromosoma bacterià sols amb aquest enzim.
DNA polimerasa III i II són les encarregades de fer la síntesi del DNA bacterià in vivo. La II s’utilitza si la III no funciona bé. Aquestes dues polimerases requereixen un extrem 3’OH lliure on poder afegir els nous nucleòtids en sentit 5’ 3’.
Eucariotes En eucariotes, algunes poden tenir també funció exonucleasa: Funció primasa Nom Alfa – α Beta – β 5’  3’ síntesi Funció exonucleasa 3’  5’ Funció principal comença la síntesi de les cadenes capacitat de reparació i recombinació. En precursors recombinacionals hi ha eliminacions de cadena i els hem d’omplir amb ajuda d’aquest enzim.
primasa sí exonucleasa no sí no eliminació 19 Gamma – ϒ Delta – δ Epsilon – ε Eta – ƞ és un enzim DNA polimerasa que participa activament en la replicació del DNA mitocondrial. El mitocondri no porta informació per reparar errors.
participa en la replicació del DNA en ambdues cadenes participa a través de la síntesi de la cadena avançada (no polimeritza la retardada molt específica per reparar lesions causades per la llum UV (radiació no ionitzant). En incidir aquest tipus de radiacions es formen dímers de timina,que bloquegen la replicació. L’única solució és que es talli el dímer i s’elimini.
sí sí sí sí sí sí sí sí Les polimerases α i β són els principals enzims implicats en la reparació. Encara que el procés és molt fidel, per algun motiu podria donar-se que les polimerases posessin un nucleòtid incorrecte. Llavors el mateix enzim s’adonarà de l’error, tornarà enrere i repararà l’error. Els valors mitjans són: 1 𝑏𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑟𝑟ò𝑛𝑖𝑎 1 𝑏𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑟𝑟ò𝑛𝑖𝑎 → 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑐𝑖ó 𝑑𝑒𝑙 𝐷𝑁𝐴 → 5 10 𝑏𝑎𝑠𝑒𝑠 107 𝑏𝑎𝑠𝑒𝑠 Avanç de la síntesi de les cadenes En la cadena avançada, la replicació es farà de forma contínua; en la cadena retardada es farà en trossets, que anomenem Fragments d’Okazaki.
La cadena discontínua necessita sempre una petita molècula de 60 pb de RNA anomenat primer o encebador. Aquest és incorporat a una primasa o RNA polimerasa. És la que facilita la inserció de nucleòtids nous per part de la polimerasa III a l’extrem 3’ OH.
Els fragments d’Okazaki tenen una llargada variable.
En un bacteri són 10 vegades més grans que els humans.
F. d’Okazaki Procariota  1500 pb F. d’Okazaki Eucariota  150 pb 20 La polimerasa elimina el primer i el buit és omplert amb nucleòtids.
En qualsevol procés hi ha moments en què es produeixen discontinuïtats. Si aquesta no és corregida no serà funcional; per tant és molt important la participació de les DNA lligases. Els organismes deficitaris de lligases no poden reparar els danys del DNA. No és un enzim específic de replicació; sols serveix per reparar talls o “nicks”.
Els fragments d’Okazaki s’uneixen entre ells gràcies a les lligases.
21 Replicació del cromosoma bacterià El cromosoma bacterià és circular bicatenari. Quan es va estudiar quina era la seqüència per on siniciava la replicació es va veure en bacteris que existeix una seqüència coneguda que correspon a aquest origen de replicació  oriC. Un oriC d’ecoli te uns 245 pb, i el nombre en altres espècies bacterianes és si fa no fa el mateix. Dins d’aquest oriC existeix sempre una sequencia rica en A-T. Perquè hi ha hagi replicació les cades s’han d’obrir. Un origen ric en G-C seria mes dificil d’obrir perquè per naturalesa són més estables. En un replicó bacterià se sap que la replicació a partir de l’origen va en doble sentit.
NOTA: bidireccional  Des del punt de vista fisic es incorrecte (1 direcció, 2 sentits)  ERROR!!! 1 cromosoma bacterià = 1 origen de replicació = 1 unitat de replicació= 1 replicó Una de les maneres que van ajudar a interpretar la replicació van ser estudis fets amb timina tritiada. Quan el cromosoma repliqui, cada cadena existen servira de motlle. Si el cromosoma parental té timina i el medi té T tritiada (isòtop radioactiu) la cadena de nova síntesi incorporarà aquesta timina i podré observar la progressió del proces de repliciació. L’estratègia experimental s’assembla a la que van utilitzar Meselson i Stahl per demostrar que la replicació era semiconservativa.
La forqueta de replicació es forma quan el proces està avançat. La seva forma recorda la lletra grega theta (és com una o, i vol dir que gairebé s’ha arribat a la meitat del procés de replicació.
De la mateixa manera que tenim seqüències d’inici oriC també hi ha seqüències de terminalització anomenades TER.
Nota: Aquest model no és vàlid en eucariotes! Un cromosoma eucariota pot tenir varis origens de replicació. A més, poden tenir més d’un cromosoma. Els replicons eucariotes no treballen simultàniament. En eucariotes no hi ha seqüències terminals. La replicació es pararà quan es trobi amb el següent replicó i no pugui continuar. La velocitat amb la qual avancen aquests replicons és menor que la velocitat a la qual avancen els replicons bacterians. Però com que n’hi ha molts és en conjunt va molt més ràpid.Durant un cicle es produeix un senyal de que ja ha estat activat i s’ha replicat i ja no s’ha de tornar a replicar. (1 cicle de replicació= 1 replicó= 1 sola còpia).
22 En el cas d’un bacteri el cromosoma és DNA “nu”, no hi ha estructura superior d’empaquetament. En eucariotes el DNA i les proteïnes estan formant una superestructura enrotllada superior que anomenem cromatina. Això és un dels factors que alenteixen la replicació del material genètic eucariota.
En un bacteri pot haver-hi material genètic extra (plasmidis) que tenen la mateixa forma que un cromosoma bacterià però són més petits. Hi ha plasmidis que s’integren al cromosoma principal en un procés recombinant.
Si el bacteri es replica, també es replicarà el plasmidi. El plasmidi bacterià també pot “marxar”. A vegades quan es desintegra s’emporta el DNA del cromosoma principal , de manera que el plasmidi guanya informació.
Un plasmidi també és un replicó.
Replicació del DNA.
El replisoma és el conjunt d’enzims necessaris per coordinar o participar a la síntesi del DNA en ambues cadenes. Dins d’aquest distingim: - Primosoma: o Primasa o ARN polimerasa: sintetitza els primers de RNA necessaris per fer els fragments d’Okazaki.
o Helicasa és la topoisomerasa més important. S’encarrega d’obrir les dues cadenes del DNA perquè puguin ser replicades. Les topoisomerases poden ser de dos tipus:  i : talla una cadena i permet que la molecula d'ADN giri al voltant de l'enllaç fosfodiester, alliberant la tensió producte del superenrotllament de l'ADN  ii: talla les dues cadenes i passa una cadena a través d'aquest forat. Dins d’aquest grup hi ha l’helicasa.
o Proteïnes ssb (Single Stranded Binding Protein): s’uneixen a cadena senzilla i fan que no es pugui tornar a tancar.
23 24 ...