Seminario 3 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 21/04/2016
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Biología Celular.
Héctor Escribano Seminario 3 Inmunocitoquímica La inmunoglobulina (IgG) es un anticuerpo de 4 subunidades, dos grande y dos pequeñas en forma de Y, con dos regiones variables por las que se unen a los antígenos. La parte Fc es invariable y es constante en toda una especie. La parte Fv es la región variable, y donde están las subunidades pequeñas unidas a las subunidades grandes mediante puentes disulfuro (líneas rojas). Aproximadamente por la línea verde se encuentra el punto de corte de una proteasa que separa la parte Fc de la otra.
Cuando un anticuerpo se une a un antígeno, no se vería en el microscopio. Por lo que es necesario que el anticuerpo lleve un marcador.
Existen diversos métodos.
Método de detección directo: El antígeno lleva el marcador asociado y se une al antígeno directamente.
Método de detección indirecto: Se usa un primer anticuerpo (anticuerpo primario) que carece de marcador, pero que reconocerá el antígeno. Después se utiliza un segundo anticuerpo que ya lleva asociado el marcador y que reconoce la región Fc del anticuerpo primario. Permite un marcaje más intenso, debido a que se pueden unir más de un anticuerpo secundario a cada anticuerpo primario; mientras que en el directo es solo un marcador por antígeno.
Marcadores empleados Enzimas (Peroxidasa o Fosfatasa Alcalina), Fluorocromos y Oro coloidal (Microscopio electrónico de transmisión).
Respuesta inmune Ante un antígeno en el organismo, se desencadena una respuesta inmunológica creando anticuerpos para ese antígeno determinado. Un antígeno puede estar compuesto por diferentes componentes. El antígeno es digerido por un macrófago en sus diferentes partes y los expone en su superficie mediante transportadores ABC (del tipo TAP) que los fuerzan a seguir la ruta secretora. Por eso los macrófagos se denominan células presentadoras de antígenos, no muestran el antígeno entero sino pedacitos de él. Los Linfocitos T reconocerán cada una de las partes de los antígenos, y producirán anticuerpos (Inmunoglobulinas) cuya región variable estará dirigida contra la porción de antígeno que el Linfocito T.
Diferentes Linfocitos reconocerán diferentes pedazos y, por tanto, diferentes anticuerpos. Cada linfocito se especializa en un anticuerpo determinado. Estos anticuerpos irán al torrente sanguíneo y se unirán al Biología Celular.
Héctor Escribano Seminario 3 antígeno circulante favoreciendo su marcaje y señalización y posterior eliminación por macrófagos.
Tendremos, entonces, diferentes anticuerpos que reconocerán diferentes partes pero del mismo antígeno.
Este tipo de anticuerpo es llamado anticuerpo policlonal, las Inmunoglobulinas que se han producido son diferentes entre sí pero reconocen un mismo antígeno. Hablamos en singular, porque el anticuerpo es la suma de las diferentes Inmunoglobulinas.
De manera artificial se podrían fabricar anticuerpos monoclonales, aislando uno de los tipos de Linfocitos T especializados en un solo tipo de inmunoglobulinas, que en el laboratorio se puede perpetuar su vida y que sintetice Inmunoglobulinas indefinidamente. Aunque solo haya un tipo de Inmunoglobulinas, reconocerán igualmente al antígeno, aunque solo por uno de los Epitopos.
El marcador policlonal es siempre secundario, ya que se ha cogido el Fc de una especie, se ha introducido en un organismo de una especie diferente que fabricara anticuerpos policlonales mediante la vía de los macrófagos-linfocitos T para esa región. Los linfocitos se aislaran y se crearan anticuerpos policlonales en el laboratorio contra la Fc original. Por eso, cuando se utiliza un anticuerpo con esa Fc contra un antígeno determinado, y se utiliza el segundo anticuerpo policlonal que lleva asociado una molécula de marcador.
Si el secundario es policlonal se amplifica la señal; si fuera monoclonal sería lo mismo que utilizar un primario monoclonal marcado. El método indirecto amplifica mucho la señal, y si el secundario es policlonal aún mejor.
El monoclonal nunca da tanta señal como el policlonal (ya sea directo o indirecto).
En una inmunodeteccion se permite el marcaje múltiple, utilizando anticuerpos diferentes, y cada cosa debe tener un marcador diferente. La limitación es el número de marcadores. En el método indirecto, aparte de estar limitado por la cantidad de marcadores, se necesitan anticuerpos con Fc diferentes (de especies diferentes) para cada uno de los antígenos que queramos reconocer. Si su Fc fuera igual, el anticuerpo secundario no podría diferenciar.
Antígeno marcado Se utiliza cuando la cantidad de antígeno es grande. Usamos un anticuerpo dirigido al antígeno, sin marcar.
Después, se incuba la muestra con antígenos marcados que serán reconocidos por la segunda región de los anticuerpos (que son bivalentes, de dos brazos solo utiliza uno la primera vez).
Métodos puentes de Inmunoglobulinas Se utiliza un anticuerpo fabricado en la especie A, que reconocerá el antígeno diana. Luego se utiliza un anticuerpo fabricado en la especie B que reconoce la Fc de la especie A, y se unirá a él. Se utiliza una tercera capa de anticuerpos A unidos a antígenos marcados que serán reconocidos por los anticuerpos de B.
Biología Celular.
Héctor Escribano Seminario 3 También se puede utilizar un anticuerpo doble, de dos caras PAP en la tercera capa. Entonces quedara una región Fc libre, que podrá volverse a detectar con anticuerpos B y así formar un doble puente o triple, o cuádruple....
Marcaje con enzimas Se utiliza Peroxidasa o Fosfatasa Alcalina. La Peroxidasa reduce el agua oxigenada en agua y oxígeno.
Cuando se utiliza este tipo de marcadores se tiene que poner los sustratos de la enzima. Para que la Peroxidasa reduzca necesita electrones, que le serán cedidos por un compuesto que cambie de color en sus diferentes estados de oxidación o que emitan Luz como el Luminol. En la Fosfatasa, se usan el BCIP (molécula fosforilada) que se desfosforila y se transforma en un compuesto azul que precipita. También se podría utilizar un marcaje quimioluminiscente para la Fosfatasa Alcalina como el CPD-Star.
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