Tema 2 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 11
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 19
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 Tema 2: PRINCIPIS BÀSICS DELS CULTIUS CEL·LULARS ESTABLIMENT D’UN CULTIU PRIMARI Disgregació Disgregació mecànica Si volem treballar amb cèl·lules concretes provinent de materials d’animals o persones (un fragment d’un teixit) el primer que necessitem és una biòpsia. Necessitem inicialment aïllar les cèl·lules una a una del teixit en el que estan i per tant, el que elaborarem és una disgregació mecànica.
La disgregació mecànica consisteix en introduir el teixit en una dissolució isotònica que no té nutrients però si que manté les cèl·lules vives. En aquesta dissolució tallarem el fragment en trossos més petits amb l’ajuda d’un bisturí.
La superfície que obtenim desprès dels talls és molt més gran, és a dir, augmentem la superfície total i això és important pel posterior tractament enzimàtic.
Si les cèl·lules que volem obtenir són molt sensibles al tractament amb enzims el que podem fer és posar-los en una placa de petri o flascó i posar una fina capa de medi de manera que, els fragments de teixits no estiguin surant sinó en contacte amb la superfície. Les cèl·lules s’acabaran adherint a la superfície i començaran a dividir-se, colonitzant el flascó o placa de petri. Si deixem les cèl·lules el temps suficient aquestes es desprendran del fragment i aniran colonitzant tota la superfície, el que dona lloc a un cultiu d’explant.
Disgregació enzimàtica Si les cèl·lules són resistents al tractament enzimàtic, desprès de la disgregació enzimàtica podem elaborar una disgregació enzimàtica, que habitualment s’elabora amb tripsina, que trenca les unions entre les cèl·lules i entre les cèl·lules i la matriu extracel·lular.
La dissolució en que introduïm les cèl·lules és sense calci ni magnesi perquè moltes unions intracel·lulars requereixen d’aquests elements (les calderines necessiten calci) i per tant, en absència d’aquests les unions seran més febles i el tractament serà més efectiu.
El tractament amb tripsina depèn de la concentració d’aquesta, la temperatura i la duració de tot el tractament. Generalment elaborarem un tractament a 37°C durant 3-5 minuts com a màxim ja que si ho deixem durant un període més gran les proteïnes essencials seran digerides per la tripsina i la cèl·lula morirà.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 També podem elaborar el tractament a 4°C introduint la mostra en gel o en una nevera durant tota la nit. Hem de tenir present que aquesta temperatura l’activitat de la tripsina és menor però és un tractament que funciona sense fer malbé la cèl·lula. Al endemà cal introduir de nou la temperatura de treball i redissoldre la suspensió.
Si els teixits són rics en col·lagen podem utilitzar l’activitat de la col·lagenasa, un enzim que degrada el col·lagen.
L’activitat d’aquest enzim es pot utilitzar per separat o bé en combinació amb la tripsina.
El que sol se important és que en general abans de fer un tractament si hem tingut les cèl·lules en un medi que té sèrum hem de saber que el sèrum presenta inhibidors per la tripsina de manera que hem d’eliminar el medi de cultiu de la dissolució rentant i eliminant el calci i el sodi. Així doncs normalment cal un tractament previ amb sals per tal de preparar el medi perquè sigui útil per la tripsina.
Podem utilitzar altres enzims, com observem en la taula següent: 2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 Mètodes de separació de cèl·lules Un cop ja tenim les cèl·lules aïllades les podem cultivar (sabem cultivar diferents tipus cel·lulars) però per elaborar els cultius necessitem prèviament separar les cèl·lules.
Centrifugació en gradient de densitat És un mètode senzill i és una separació per densitat; les cèl·lules les posem en un tub en que hi ha un gradient de densitat i en elaborar la centrifugació es separen en funció d’aquesta característica. És un bon mètode de separació perquè els diferents tipus cel·lulars solen tenir diferents densitats i per tant, estableix una separació entre aquests.
Separació per elutriació centrífuga Aquesta és una separació basada en la mida. Utilitzem una centrífuga específica que conté una cambra i quan la centrífuga funciona es produeix una força centrífuga que és compensada per una dissolució salina (que serveix també per mantenir les cèl·lules vives) ja que entra en sentit contrari, permetent separa les cèl·lules en funció de la seva mida i podem eluir les cèl·lules de la cambra per tenir fraccions cel·lulars diferenciades.
Aquest mètodes es fa servir per separar cèl·lules que estiguin en diferents fases del cicle cel·lular ja que les cèl·lules que s’acaben de dividir són més petites que les cèl·lules que ja estant entrant en meiosis. Les diferents cèl·lules del mateix teixit no tenen la mateixa mida i per tant aquesta metodologia també es pot emprar tot i que no és la més utilitzada.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 Afinitat de Ac per Ag (epítops) superfície cel·lular Aquest mètode es basa en la utilització d’anticossos contra proteïnes de la membrana plasmàtica; les cèl·lules de diferents teixits expressen a la seva membrana proteïnes iguals per totes les cèl·lules i proteïnes específiques per tant, si tenim anticossos específics per aquestes proteïnes els podem utilitzar per marcar les cèl·lules que contenen les proteïnes i per tant, elaborar una separació.
Existeixen diferents vies per obtenir la separació: Utilització o modificació de superfícies (placa de petri o flascó) Posem anticossos en la superfície i per tant la modifiquen de manera que les cèl·lules que continguin es proteïnes específiques seran reconegudes. Un cop afegim la dissolució cel·lular sabem que únicament s’adheriran a la superfície les cèl·lules reconegudes per l’anticòs i per tant, si elaborem un rentat tindrem les cèl·lules que volem.
Unió dels anticossos a partícules amb propietats magnètiques Aquesta tècnica es basa de la unió de l’anticòs amb una partícula magnètica com la Ferritina, que poden ser atrapades per un camp magnètic i per tant, aquelles cèl·lules reconegudes per l’anticòs seran reconegudes i arrossegades també cap al mateix camp magnètic i per tant, tindrem les cèl·lules que ens interessen unides al camp, com un iman.
Aquest pot ser un sistema molt senzill o bé amb aparells més sofisticats:  Sistema MACS: separador cel·lular amb activitat magnètica: Tenim una cèl·lula que presenta una molècula a la membrana (normalment una proteïna) que s’uneix a un determinat anticòs que hem fabricat específicament i que s’ha unit a la ferritina. Es fan passar les cèl·lules per un pistó i quan arriben a un iman les que tenen l’anticòs es queden adherides mentre que les cèl·lules sense marcatge elueixen cap a la part inferior. Un cop ja tenim les cèl·lules separades desactivem el camp magnètic i recuperem les cèl·lules d’interès.
 Sistema FACS: separador de cèl·lules amb activitat fluorescent: La base és la mateixa que anteriorment, és a dir, els anticossos reconeixen una determinada cèl·lula però aquests estan units a un fluorocrom, una molècula que emet fluorescència si la radiem amb una determinada longitud d’ona. En aquest cas, les cèl·lules passen no tant agrumollades com anteriorment (el pistó MACS no és tant fi) sinó que les cèl·lules passen d’una en una de tal manera que sobre d’aquestes incideix una llum laser, que només es refracta quan passen les cèl·lules. A més, com que incideix aquesta llum si hi ha l’anticòs amb el fluorocrom aquest s’excita i emet fluorescència. En funció d’aquest aspecte es formen unes gotes que habitualment contenen únicament una cèl·lula s’afegeix una carrega, el que permetrà separar les cèl·lules a una gran velocitat: o La cèl·lula emet llum verda se li afegeix càrregues negatives o La cèl·lula no emet llum de manera que no se li afegeixen càrregues o La cèl·lula emet un altre tipus de llum (vermella), se li afegeix càrregues positives 4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 SUBCULTIU Posem les cèl·lules en un medi de cultiu amb un flascó i les introduïm en un incubador, el que faran les cèl·lules és que si són cèl·lules que s’adhereixen, s’adheriran a la superfície i després començaran a proliferar. Arriba un moment en que les cèl·lules ocupen tota la superfície i arriben a formar una monocapa confluent, el que provoca que deixin de dividir-se i per tant, diem que pateixen una inhibició per contacte.
Hem de tenir present que les cèl·lules en cultiu creixen formant una monocapa sempre però que les cèl·lules transformades tenen, entre d’altes, la capacitat de sobrepassar aquesta limitació i créixer les unes sobre les altres. En els teixits les cèl·lules creixen amb estructures tridimensionals però en cultiu aquesta estructuralitat no la poden reproduir.
Si hem establert un cultiu primari a partir d’un teixit el que volem són moltes cèl·lules i per tant, s’han de tornar a cultivar resuspenent-les i llavors sembrant-les en una solució salina sense calci ni magnesi per elaborar el tractament amb tripsina el que permetrà que les cèl·lules es desenganxin. Per aturar l’acció de la tripsina podem afegir medi, el que ens permetrà retornar a la situació inicial.
En aquest cas, en retornar a la situació inicial tenim moltes cèl·lules perquè ja partíem d’una monocapa. Al establir una línia cel·lular el que hem de fer sempre és una expansió del cultiu per tenir moltes cèl·lules i això s’aconsegueix anant subcultivant repetidament.
Definirem com cultiu primari al cultiu que obtenim a partir del teixit i tota la resta dels cultius que elaborem a partir d’aquest seran anomenats subcultius.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 Fases de creixement de les cèl·lules en subcutliu Observant el gràfic (esquema esquerre) veiem que inicialment totes les cèl·lules tenen una fase LAG en la qual el nombre de cèl·lules no augmenta i això és perquè al introduir les cèl·lules al cultiu aquestes no estan adherides i doncs, primerament existeix un període de temps en que les cèl·lules s’adhereixen a la superfície i desprès comencen a proliferar. La fase LAG depèn, entre d’altres, de la quantitat de cèl·lules que afegim, és a dir, de la densitat cel·lular:  Si posem molt poques cèl·lules en un cultiu normalment per trobar increments trigarem més temps perquè en cultiu les cèl·lules produeixen factors autocrins i paracrins per estimular-se a elles mateixes i a les cèl·lules veïnes. Si tenim poques cèl·lules els factors quedaran més diluïts en el medi i per tant, l’estimulació és més lenta.
 Si posem moltes cèl·lules, els factors esmentats anteriorment estan en gran quantitat i per tant, poden actuar sobre moltes cèl·lules de manera que hi ha un creixement més ràpid.
La fase LAG va seguida sempre d’una fase LOG en que hi ha un creixement exponencial de les cèl·lules en cultiu i això dura fins que ocupen tota la superfície en que s’arriba a la fase PLATEAU, les cèl·lules es veuen inhibides per contacte i com que no tenen més espai per ocupar per molt de temps que les deixem en cultiu no es dividiran.
Generalment totes les cèl·lules segueixen la corba explicada anteriorment i acostumen a trigar 7 dies per arribar a aquesta fase, en els quals normalment hem afegit medi nou.
Si volem que el cultiu proliferi correctament el que hem de fer és anar a subcultivar (veure esquema dreta) i és important subcultivar abans que les cèl·lules arribin a la fase de PLATEAU (amb els microscopis òptics es pot seguir el creixement i veure quan estant a punt d’arribar a la formació de la monocapa) i per tant, és necessari agafar les cèl·lules abans que es vegin inhibides. Si esperem que les cèl·lules assoleixin la fase esmentada anteriorment els cultius provinents d’aquest seran menys vigorosos inicialment perquè les cèl·lules arribaran a un estat de “stop, no proliferació” i per tant, les hem de tornar a activar el que requereix d’un temps i per tant, és més pràctic agafar les cèl·lules abans d’assolir la fase.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 Evolució de la línia cel·lular La corba que observem en el gràfic és una corba ideal en la qual nosaltres anem subcultivant tots els flascons i per tant, el nombre de cèl·lules a mesura que passen les setmanes va augmentant. Hem de tenir present que això no es pot continuar més de 3 setmanes perquè el nombre de cèl·lules és molt elevat i no podem treballar amb tantes de manera que el que s’elabora normalment és congelar les cèl·lules per tenir un reservori.
Observem que podem augmentar el nombre de cèl·lules que provenen d’un teixit fins un determinat punt, en que per molt que cultivem les cèl·lules en les mateixes condicions no es reproduiran i això és perquè entren en un procés de senescència i moren. Les cèl·lules estan programades per elaborar un nombre de divisions determinades; una explicació possible és l’escurçament dels telòmers, tal com s’ha dit anteriorment o bé altres investigadors afirmen la implicació d’una determinada proteïna en el procés.
Un cop les cèl·lules entren en senescència generalment les cèl·lules del cultiu s’acaben morint però de tant en tant, hi ha alguna cèl·lula que pot superar aquesta fase i llavors esdevé una cèl·lula immortalitzada, que es pot mantenir en cultiu el temps que vulguem. Sabem que moltes cèl·lules que provenen de tumors són cèl·lules immortalitzades.
En l’esquema observem dos termes que no són el mateix i cal fer una distinció entre ells:  Inmortalització: capacitat d’una cèl·lula de proliferar en un cultiu indefinidament  Transformació: proporciona les mateixes característiques que té una cèl·lula tumoral: inmortalització, desaparició de la inhibició per contacte (les cèl·lules poden créixer les unes sobre les altres), al injectar-les indueixen a l’aparició de tumors.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 CLONATGE Hem de fer un cultiu a partir d’un teixit però pot passar que no estiguem segurs perquè el teixit tenia diferents tipus cel·lulars de manera que podem tenir diferents cèl·lules epitelials (per exemple) que provenen de diferents orígens i a vegades, ens pot interessar una línia cel·lular en que inicialment totes les cèl·lules siguin idèntiques, en sentit de població.
El procediment que sempre seguim és diluir i semblar en densitats molt baixes de manera que estem casi segurs que quan una cèl·lula caigui en el flascó no estigui rodejada d’altres cèl·lules. Les cèl·lules que han caigut aïllades que són capaces de proliferar sense adherir-se (com les cèl·lules del os, les sanguínies o les transformades) ho faran. Si volem formar colònies però, hem de fer una dissolució i les hem de fixar posant una capa de medi semisòlid com agar o metofer, de tal manera que hem fet la dissolució igual que en el primer cas (en que no cala que s’adherissin) però en aquest cas hem afegit una capa que quan es solidifiqui servirà per tenir les cèl·lules separades i per tant, el creixement cel·lular es donarà en una zona concreta.
En aquest cas s’han format colònies que provenen d’una única cèl·lula i per tant tindrem cèl·lules genèticament idèntiques.
Podem recuperar les colònies i expandir-les però aquest procediment varia en funció del lloc on han crescut.
 Han crescut utilitzarem un (esterilitzat sobre sobre flascons: anell metàl·lic silicona) i el posarem sobre la colònia de manera que tindrem allà totes les cèl·lules. És l’anell el que introduirem en el flascó de respusensió.
 Han crescut en suspensió: han format colònies en un medi sòlid i per tant, podem xuclar les cèl·lules per dispersar-les i tornar-les a cultivar.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 CONGELACIÓ CEL·LULAR Si fem les expansions arriba un moment en que hem fet una extensió i tenim un gran nombre de cèl·lules de manera que el que necessitem és un reservori cel·lular, un reservori que puguem utilitzar quan ho necessitem. Aquest, només s’aconsegueix congelant les cèl·lules en un procés de congelació que ens permeti, al descongelarles, mantenir la viabilitat de la cèl·lula i per tant, hem d’impedir que les cèl·lules es morin durant el procés per la formació de cristalls en l’interior. Aquest aspecte ens fa utilitzar un crioprotector (que no permet la formació d’aquests cristalls) en el medi que pot ser: DMSO (dimetilsulfoxi) o glicerol.
Es fa una dissolució homogènia i una congelació fins a -70/-80 °C on sempre la disminució de la temperatura a de ser de 1°C/min. Després d’aquest procés introduïm les cèl·lules en nitrogen líquid (es poden posar directament però han d’anar recobertes per una escuma que permeti que el fred arribi gradualment) el que ens permetrà la seva congelació durant anys.
La descongelació ha de ser ràpida (mentre que la congelació havia de ser lenta), les cèl·lules s’introdueixen a 37°C i seguidament ja poden ser cultivades.
AVANTATGES I LIMITACIONS DELS CULTIUS CEL·LULARS Avantatges Limitacions Cultivar en l’ambient que vulguem (pH, temperatura, osmolaritat, hormones....) Cal certa experiència en e maneig del material per evitar les contaminacions Conèixer si la població és homogènia Despesa econòmica per controlar la contaminació Generació de reservoris Generalment els cultius a llarg termini es desestabilitzen genèticament (no se sap perquè) Validar l’origen cel·lular Conèixer el nombre de divisions que han patit Elaborar experiments reproduïbles 9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 CREIXEMENT DELS CULTIUS CEL·LULARS Sempre que hem parlat de cultius hem parlat de cèl·lules que creixen adherides però també hi ha cultius que creixen en suspensió com per exemple les cèl·lules sanguínies o les cèl·lules transformades. Sabem doncs que hi ha cultius que es poden adaptar per créixer en suspensió, el que pot tenir una sèrie d’avantatges o inconvenients: El cultiu es pot aturar i podem obtenir els productes que generen les cèl·lules (suposem que les hem modificat perquè secretin insulina). Quan el cultiu s’acaba podem recuperar els productes generats i les cèl·lules, el que ens permetrà obtenir molts lots d’aquest producte. Aquest és un sistema molt ben adaptat a la producció a gran escala.
Quan treballem amb cultius adherents també podem treballar a gran escala però hem de tenir present que la superfície s’ha d’incrementar notablement per tenir més cèl·lules i per tant, tenir una producció millor. L’avantatge de treballar amb aquest mètode és que només hem de recuperar el medi per tenir el producte en qüestió i al introduir un altre medi nou les cèl·lules seguiran produint. La gran limitació seria la superfície (els altres tindrien una limitació de volum però no és tant important).
CÈL·LULES NORMALS VS TRANSFORMADES La següent corba és com la corba que hem vist en el creixement bacterià en que sempre tenim la fase LAG, LOG i PLATEAU. Quan comparem les cèl·lules normals (marcades amb blau) amb les transformades (marcades en vermell) observem que aquestes últimes tenen una saturació més elevada perquè no tenen la inhibició per contacte, de manera que, poden créixer les unes sobre les altres, formant una espècie de “capes” anomenades foci, de manera que al visualitzar el cultiu veuríem una espècie de grumolls de manera que s’arriba a la situació de saturació a densitats més elevades.
Si observem les dues rectes, la de les cèl·lules transformades tenen un pendent més pronunciat de manera que, es podria sobreentendre que tenen una velocitat de proliferació més ràpida. Ens ha de quedar clar que la velocitat de proliferació depèn únicament de l’espècie cel·lular però es creu que les cèl·lules transformades creixen de forma més rapida que les cèl·lules normals suposant que són del mateix teixit.
Propietats de les cèl·lules transformades  Immortals, es poden mantenir en cultiu indefinidament  Taxa de limitació espontània elevada  Són tumurogèniques  Creixent formant un foci en cultiu  Generalment no cal que les sembren a densitats tant elevades com les normals perquè tenen molts factors autocrins que produeixen estímuls  La velocitat de creixement normalment és més elevada 10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T2 Anàlisis cromosòmic Imaginem que agafem limfòcits, trobarem que la gran part de les cèl·lules tindran 46 cromosomes. Per tant, si elaborem un anàlisi la gran majoria de cel·lules tindran aquest nombre de cromosomes però hi haurà algunes que tinguin més o menys (minoritàries) per errors en l’experimentació.
Si parlem però de cèl·lules transformades podríem trobar dues situacions diferenciades:  La campana és molt més ample perquè hi ha una inestabilitat genètica.
 El nombre de cromosomes de la línia canvia i per tant, el nombre modal (major nombre de cèl·lules) es situa amb un número diferent de cromosomes.
11 ...