TEMA - 6 CULTIU DE MICROORGANISMES, MÈTODES D’IDENTIFICACIÓ I SISTEMES DE CONSERVACIÓ (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura microbiologia
Profesor M.
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 31/03/2015
Descargas 30
Subido por

Vista previa del texto

Èlia Riubugent Camps 2n Biologia 6. CULTIU DE MICROOR GANISMES, MÈTODES D’IDENTIFICACIÓ I SISTEMES DE CONSERV ACIÓ MEDIS DE CULTIU PER L’AILLAMENT DE B ACTE RIS, VIRUS I FONGS Els medis de cultiu en bacteriologia és divideixen en dos grans grups: medis Líquid → en suspensió → no es veuen colònies (tèrbol) Sòlid → es poden veure les colònies* *Les diferents espècies bacterianes donen diferents tipus de colònies → per l’aspecte de la colònia es pot identificar quina espècie és i ens permet veure si hi ha un tipus de colònia, dos o tres.
Es fan servir els medis líquids tot i així, perquè és un medi més agradable pels microorganismes. SI tenim un microorganismes que no creix bé en medis sòlids el podem recuperar sembrant-lo en un de líquid.
En una placa de petri es pot sembrar un volum petit.
Ex: persona amb una infecció a la sang, tenim 5L de sang. Si extraiem 20mL de sang, la càrrega bacteriana pot ser molt poca, com a molt en podrem sembrar 1mL en una placa, la possibilitat de que en aquest ml hi hagi precisament el bacteri que ens interessa és petita. En canvi si injectem els 20mL en un pot amb medi líquid la probabilitat augmenta de manera considerable → medi sòlid té més capacitat.
Els medis de cultiu es divideixen en dos grans grups: 1. Complexes → sabem què hi ha però no amb exactitud. Ex: Extracte de llevat, no se sap quins.
2. Definits → coneixem exactament la composició. Ex: Sabem les sals, dels elements en forma de traces, els AA, etc.
Tenim una classificació en base de l’ús del medi: 1. Usuals → agar de tripticasa de soja: medi d’agar que porta soja digerida amb enzims, carbohidrats de la soja, etc. És un medi sòlid, també es diu general o de manteniment perquè a part de la font de nitrogen que fa servir pels AA, els carbohidrats i les sals, no porta res especial, hi poden créixer els bacteris no exigents, els que no necessiten requeriments especials.
2. Rics → porten alguna cosa especial. Agar sang: porta un 5% de sang. Molts microorganismes creixen millor en medis enriquits amb sang Ex: Streptococcus, Niseries, etc.És un medi diferencial també, estem parlant de medis que quan el bacteri ha crescut podem veure alguna cosa més que ja ens permet anticiparnos i identificar el bacteri, ens estableix una diferencia.
Podem veure la hemòlisi de l’agar sang, alguns patògens tenen hemolisines, enzims, que poden lisar les hematies. Ex: foto al voltant dels bacteris hi ha uns aclariments, el bacteri secreta hemolisines i lisa les hematies. És una característica de S. Aureus.
3. Selectius → Nomes permet el creixement d’un tipus de microorganisme, la resta no poden créixer, ens serveixen per estudiar un bacteri concret.
Ex: Arriba una femta d’una persona amb gastroenteritis, suposem que sembrem una sèrie de plaques per aïllar el possible patogen. Un dels més habituals és la salmonel·la (bacteri que amb mes freqüència dona gastroenteritis al nostre ambient). Agafem una escombreta, la submergim a la merda i fem un sembrat sobre una placa, ho fem en un agar sang o usual → ens hi creixerà tota la flora fecal, la bona i la dolenta, no podrem saber qui ha produït la gastroenteritis. Si sospitem una salmonel·la, hem de sembrar un medi selectiu que nomes ens permeti el creixement de la salmonel·la o d’altres bacteris sospitosos.
Fem servir MacConkey que permet el creixement dels bacteris de la família enterobacteriaceae on hi ha la salmonel·la, E.coli, etc. Agafarem la femta, la sembrarem a la placa. Aquest agar prota una gran concentració de sals biliars, de cristall violeta, lactosa i roig neutre, substancies tòxiques per a la majoria de bacteris (les sals i el cristall, es diuen que són inhibidors).
Fiquem el sembrat a una estufa i el dia següent tenim un sembrat de dos colors, tenim dues colònies, uns que donen colònies vermelles i una altre que no agafa el color.
Les vermelles son d’aquest color perquè han interioritza el roig neutre, un indicador de pH que es vermell a pH àcid, de manera que les colònies vermelles corresponen a un enterobacteri que pot Èlia Riubugent Camps 2n Biologia fermentar la lactosa, pot fer servir la lactosa fermentant-la i produint productes àcids de manera que l’acidesa de la colònia augmenta i absorbeixi el roig neutre que li dóna el color. Aquestes son les colònies lactoses positives.
Les Lac- són bacteris que no fermenten la lactosa i per tant, no estan en ambients àcids i encara que hagin absorbit el roig neutre aquest no vira de color vermell. Ens interessa que el medi sigui selectiu i diferencial perquè ens diferenciarà els bacteris Lac+ de Lac-. La majoria de E. Coli no patògens són Lac+. La salmonel·la és Lac- per tant és una manera ràpida de veure fent servir un únic medi de cultius, si la gastroenteritis esta produïda per salmonel·la o no.
4. Diferencials → Agar de MacConkey és tant selectiu com diferencial. El Mannitol salt agar també es un medi selectiu per staphilococcus i també es diferencial. Es fa servir quan sospitem d’una contaminació, sovint alimentaria. Porta com a inhibidors un 7.5% (els staphilococcus són sal moderats, si n’hi ha una mica els hi posa) de clorur sodi, mannitol com a sucre fermentable i el roig de fenol, pels mateixos motius que l’exemple anterior. El gran patogen dels staphilococcus és S. Aureus que pot fermentar el mannitol fent canviar l’indicador roig de fenol, que a pH àcid canvia el medi de vermell a groc. Si el que hem aïllat és S. Aureus a part de créixer al medi de cultiu farà virar el medi de Mannitol de vermell a groc.
Protozous: també formen part de la microbiologia química, és difícil cultivar els protozous, el diagnòstic es fa mirant la morfologia típica, Giardia duodenalis ens dóna diarrea. La thricomonas vaginalis ens dona vaginitis i el plasmòdium alcipar ens dona la malària.
Els virus es cultiven per fer vacunes. Ex: ous de gallina, s’agafa una suspensió de virus de la grip i es fica en un ou embrionat que creix dins del líquid amniòtic del pollet. Laboratoris encarregats de produir virus en grans quantitats poden fer servir pus, animals i línies cel·lulars.
Els virus no els podem cultivar a una placa necessiten viure dins d’una cèl·lula eucariota. En laboratoris d’anàlisi clínic es fan servir línies cel·lulars Ex: Línia de còrnia de conill o de ronyo de mona.
Es fa servir la línia patologia s’inocula a una línia cel·lular adequada i intentaríem aïllar el virus que sospitem que està provocant la malaltia. Hi ha eines basades en el cultiu de bacteris, de fong, de protozous i el cultiu dels virus en línies cel·lulars i per qüestions que no siguin d’anàlisi clínics es poden cultivar en animals.
Aquestes eines tenen com a objectiu l’aïllament del patogen, vol dir que hem extret el patogen del pacient o de l’aliment o del fàrmac i el tenim aïllat per treballar amb ell. Això son les tècniques d’aïllament.
METODES D’IDENTIFICACIO: IDENTIFICACIO BIOQUIMICA, IMMUNOLOGIA I GENÈTICA Tenen per objectiu la identificació, es fan un cop ja hem aïllat el bacteri. Ens serveixen per poder posar nom i cognoms als microorganismes. En bacteriologia per aquells bacteris que creixen be als medis habituals les tècniques són bioquímiques. És a dir, estudiem una sèrie de paràmetres bioquímics, presència d’enzims, capacitat de fermentar certs carbohidrats. Amb això podem identificar la majoria de bacteris.
- API (=Índex Analític de Perfil) → és una manera de classificar els bacteris basada en experiments, permetent una ràpida identificació. És un sistema de base estandarditzada de les proves bioquímiques existents.
- Reducció de nitrats - Panell de proves bioquímiques i antibiograma - Robot incubador lector de panells Èlia Riubugent Camps 2n Biologia Ex: Identificació d’un fong filamentós: la forma de la colònia és gran i quan s’agafa te l’emportes tota i està ple de filament → no pots fer una suspensió homogènia → no es pot fer servir la identificació bioquímica → amb un celo s’agafen els fongs que creixen fent un miceli subterrani que s’agafa a l’agar i acaben fent un miceli aeri on hi haurà les espores.
Amb el celo enganxem els que tenen les espores, els conidiòfors i conidi.
Amb el celo el fiquem a un porta amb una gota de blau de lactofenol i el celo a sobre → examen en fresc → (blau de lactofenol dóna contrast). En el cas del penicillium que creix sobre la taronja i etc. Veurem els conidiòfors en forma de pinzell. Altres fongs tenen altres conidiòfors diferents.
EFECTE CITOPÀTIC Efecte citopàtic → són els canvis bioquímics i moleculars, morfològics de viabilitat cel·lular visibles a MO, causats durant el cicle de replicació viral. Ens permet identificar el virus que ha crescut en un cultiu.
La major part de les observacions que s’han fet, les cèl·lules infectades en cultiu perden adherència al substrat, inhibició per contacte, agregació cel·lular, arrodoniment cel·lular, formació de sincitis, cossos de inclusió citosòlics, transformació cel·lular, lisi, etc.
Tots els virus produeixen un efecte citopàtic característic (ens permet identificar el virus) però hi ha una diversitat de manifestacions molt grans.
EX: VIRUS DE LA POLIO → fa que es desenganxin les cèl·lules que formaven la monocapa i queden arrodonides EX: VIRUS RESPIRATORIS → donen refredats donen la formació de grans cel·les multinucleades, produeix la fusió de la membrana cel·lular.
EX: VIRUS DE LA VARICEL·LA – zòster → el nucli de la cèl·lula s’altera hi ha una estructura que no es pròpia de la cèl·lula i que es material del virus.
IDENTIFICACIÓ PER DETECCIÓ D’ANTIGEN Hi ha tècniques immunològiques que es poden fer servir tan per la detecció d’antígens (mètodes directes) com d’anticossos (mètodes indirectes). EN el cas de la detecció d’antígens, es fa servir un anticòs específic antiviral (IgG normalment) que ha estat conjugada amb una molècula marcada.
Pel procediment indirecte (detecció d’anticossos) es fa servir un anti-anticòs marcar i la reacció es realitza sobre un cultiu cel·lular infectat per el virus a estudiar.
Si detectem específicament els antígens estem identificant el patogen. Es va desenvolupar una sèrie de tècniques que encara fem servir avui en dia. Una d’elles son les tècniques d’aglutinació. Com distingir els diferents serotips de Vivrio Colera.
TÈCNIQUES D’AGLUTINACIÓ Un test d’aglutinació és un mètode simple, d’un sol pas, que a vegades es fa servir per la detecció d’antígens virals en mostres clíniques. Els assajos d’aglutinació, depenen de la fixació inicial d’anticossos antivirals específics sobre eritròcits o partícules de làtex. Aquest reactiu s’incuba amb la mostra clínica en la quan s’investiga l’antigen i les partícules s’aglutinen entre elles si l’antigen adequat es troba present.
- Ràpid i barat.
IMMUNOFLUORESCÈNCIA Les proves antigèniques algunes estan dissenyades per poder-les aplicar directament sobre de la mostra de manera que no cal fer l’aïllament.
IMMUNOFLUORESCÈNCIA DIRECTA Èlia Riubugent Camps Mostres clíniques apropiades son recol·lectades si col·locades sobre el portaobjectes on es deixen assecar i fixar. S’agreguen anticossos específics marcats amb isotiocianat de fluoresceïna que difonen a través de la membrana cel·lular i es combinen amb els antígens vírics a l’interior de la cèl·lula.
La reacció antigen anticòs s’observa amb el microscopi de fluorescència, per l’aparició de fluorescència de color verd.
2n Biologia Aquesta tècnica es pot fer servir per una identificació rapida del virus directament sobre la mostra o es pot fer servir per la confirmació de l’efecte citopàtic observat en cultius cel·lulars.
IMMUNOFLUORESCÈNCIA INDIRECTE Aquesta tècnica permet la detecció d’un anticòs en un sèrum sense necessitat d’estar conjugat amb un fluorocrom. Els anticossos marcats son en contra d’anticossos específics d’espècies. Per saber si hi ha un antigen en la mostra es busquen els anticossos. Es pot amplificar el senyal amb el sistema de complement.
Evita la necessitat de purificar i conjugar individualment cada mosta del sèrum.
ENZIMOIMMUNOANÀLISI Es fan servir per la detecció d’un antigen. Es basen habitualment en la captura de l’antigen per anticossos específics units a una fase solida, en general el pou d’una microplaca o una petita esfera de plàstic.
L’antigen viral present en la mostra clínica, es combina amb l’anticòs fixat a la fase solida i l’antigen viral es detecta a través de l’addició d’un altre anticòs específic conjugat amb un enzim.
L’enzim conjugat sol ser una peroxidasa o una fosfatasa alcalina. El substrat per aquests enzims varia.
En la reacció amb la peroxidasa el substrat és un peròxid capaç d’oxidar un compost químic incolor que en la seva forma oxidada te un color característic.
Ex: Tenim una superfície i en aquesta hi tenim enganxada la mostra que té el possible antigen que volem detectar. Pot ser la mostra patològica directe o una colònia en suspensió.
Hi ha dues maneres de fixar l’antigen; directament o a través d’un anticòs específic, és a dir, el suport on farem la reacció ja hi tenim un anticòs específic, quan es doni la reacció amb al colònia l’antigen ja quedaran enganxat amb la superfície →manera més segura.
El substrat és una molècula que quan entri en contacte amb l’enzim canviarà de color, el substrat entra en contacte amb l’enzim i canvia de color, groc o blau i podem determinar si hi ha més o menys quantitat d’antigen en funció del color.
Amb un espectrofotòmetre podem mesurar la intensitat del color i d’antigen i de patogen que hi ha a la mostra.
IMMUNOCROMATOGRAFIA És una de les tècniques més modernes i les seves principals avantatges son la simplicitat i la rapidesa de la prova (minuts). Es pot realitzar mitjançant un dispositiu simple portat a terme per detectar la presència o absència d’un compost objectiu a la mostra (la matriu). Es presenta en format de tira, en la qual la mostra problema flueix per un substrat sòlid mitjançant acció capil·lar.
Èlia Riubugent Camps 2n Biologia La immunocromatografia es basa en la migració d’una mostra a través d’una membrana de nitrocel·lulosa.
La mostra és afegida en la zona del conjugat, el quan està format per un anticòs específic contra un dels epítops de l’antigen a detectar, i un reactiu de detecció (metall pesant, per ex.) unit a l’anticòs. Si la mostra conté l’antigen problema, aquest s’unirà a l’anticòs conjugat formant un complex immune i migrarà a través de la membrana de nitrocel·lulosa. Sinó migraran el conjugat i la mostra sense unir-se.
La zona de captura està formada per un segon anticòs específic contra un altre epítop de l'antigen. A l'arribar la mostra a aquesta zona, els complexos formats per la unió de l'antigen i el conjugat quedaran retinguts i la línia s'acolorirà (mostres positives). En cas que no canviï el color de la banda seran mostres negatives.
La zona control està formada per un tercer anticòs que reconeix el l'anticòs específic de l'antigen, unit al reactiu de detecció. Quan la resta de mostra arriba a aquesta zona, l'antianticòs s'unirà al conjugat lliure que no ha quedat retingut a la zona de captura. Aquesta línia és un control de que l'assaig ha funcionat bé ja que s'acoloreix sempre, amb mostres positives i negatives.
INTERPRETACIÓ IMMUNOCROMATOGRAFIA Mostra positiva: Observem dues marques de color en la membrana, una corresponent al complex d’antigen amb l'anticòs marcat amb el reactiu (línia de test) i l'altre la interpretem com a l'anticòs lliure que no s'ha unit al antigen problema (línia de control).
Mostra negativa: Només observem una marca de color que correspon al anticossos lliures marcats amb el reactiu. És important que aquesta ratlla estigui en el lloc corresponent de la membrana, és a dir, a la línia de control.
Si la marca d'anticossos lliures està en el lloc on ens hauríem de trobar la del complex antigen-anticòs (línia de test), acceptarem que hem realitzat malament el test i el tornarem a fer, en el cas que no ens aparegui cap marca també haurem de repetir la prova.
IDENTIFICACIÓ PER DETECCIÓ DE MATERIAL GENÈTIC El mètode més precís de classificació dels bacteris és l’anàlisi del seu material genètic. Encara que inicialment els microorganismes es classificaven segons la seva relació guanina/citosina, aquest procediment s’ha abandonat en gran mesura a favor d’altres mètodes amb major poder de discriminació.
Encara que la hibridació del DNA es va fer servir en un principi per establir la relació existent entre les soques bacterianes (per determinar si dues soques pertanyien a la mateixa espècie o gènere), recentment aquesta tècnica s’ha fet servir per aconseguir una ràpida identificació dels microorganismes a través de l’ús de sondes moleculars.
S’extrau el DNA del microorganisme a identificar i s’exposa a unes sondes moleculars especifiques d’unes espècies concretes. La fixació de la sonda al DNA permet confirmar la identitat del microorganisme. La sonda pot estar marcada amb enzims o amb fluorescència.
MÈTODES DE CONSERVACIÓ Depenen del temps en què volem conservar: Curt termini → podem anar fent sembres Mig termini → podem fer congelació en per exemple llet desnatada i així no es formen cristalls. Es pot fer en composicions riques en proteïnes o glicerol. Poden estar a -20, -40 ...
Llarg termini→ Liofilització, passant tot l’estadi sòlid a gas. Es pot guardar a temperatura ambient. Per fer-la es congela en solucions riques en proteïnes o glicerol. Quan esta congelat (estat sòlid) s’activa la bomba de buit. Després s’apaga el congelador. La bomba de buit expira el vapor d’aigua. Això forma un medi deshidratat o no hi podrà créixer res. Després es tanca el tap i això pot durar anys, anys i anys. Per rehidratar es posa aigua o medi de cultiu.
Èlia Riubugent Camps Fins aquí el primer parcial ☺ 2n Biologia ...