TEMA 3 - MICROSCOPIA DE FLUORESCÈNCIA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Ampliació biologia cel·lu.ar
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 22/11/2014
Descargas 14
Subido por

Vista previa del texto

Llum, foc, destrucció! TEMA 3 MICROSCOPIA DE FLUORESCÈNCIA 1. Fluorescència -Quimioluminescència⟶Reacció química. Oxidem un substrat de proteïna luciferina catalitzat per la luciferasa.
-Fosforescència⟶retard entre absorció i emissió de llum -Fluorescència⟶ propietat d'una substància d'emetre llum quan és exposada a radiacions UV de forma instantània.
• Fluorocrom: grup funcional d'una molècula capaç d'absorbir ε a una λ específica i emetre-la a una ↑λ. Permeten l'excitació. Es poden unir a anticossos per reconèixer parts concretes de la cell.
Ens va permetre veure estructures que abans només podíem deduir (cells transparents) ↑ε⟶↓λ • Tècniques de ImmunoFluorescència (IF) _Fixació del material⟶mort cell⟶només podem observar-la en un moment determinat de la seva vida.
_Permeabilització material⟶ foradar membranes⟶entrada anticossos i colorants.
_Expressió dels gens bioluminescents *estudis in vivo. Es van aïllar els gens per a la bioluminescència⟶GFP (green flourescent protein) que es troba de manera natural en meduses.
S'ha d'aconseguir que la cell incorpori el gen per la fluorescència⟶descendents tots amb el gen.
[hem de tenir en compte de quan ↓λ⟶↑ε⟶danys al nucli irreversibles!] • Molècules fluorescents -FITC = verd La fluorescència es gasta -Texas red = vermell • Nova generació de fluorocroms de colors diferents • Biomolècules fluorescents se les etiqueta amb un número que fa referència a la λ que les has d'excitar perquè emetin fluorescència.
2. Bioluminescència⟶bios(=vida)+lumen(=llum) • Producció de llum a través d'una reacció química com cuques de llum, plàncton, animals fons oceànics (medusa GFP o Coral RFP) • Green Fluorescent Protein (GFP)⟶codificada pel genoma d'un ésser viu La medusa allibera ions de Ca2+ que activen l'emissió de llum blava d'aequorina (foto proteïna), GFP absorbeix la llum alliberada per l'aequorina i produeix llum verda.
- Se'n han creat altres variants amb colors diferents, YFP, CFP, BFP...
• Producció de proteïnes fluorescents a les cells vives (seguiment possible gràcies a anticossos) La fluorescència permet detectar molècules concretes dins la cell.
_Fusió genètica entre gen GFP i gen proteïna interès⟶plasmidis(DNA esfèric) que porten el fragment de DNA que codifica per EGPF(fluorescent) i un promotor universal que sempre està expressat en la cell que ens interessa. Afegim un fragment de la proteïna que volem estudiar⟶exclusiva per l'orgànul que volem estudiar (ex. catalasa⟶peroxisomes).
_Introducció gen a la cell⟶ Pot ser permanent o temporal per transfecció⟶els plasmidis entren dins del citoplasma, si la cell entra en divisió⟶desintegració nuclèol⟶cell filla tornarà a formar embolcall amb sort haurà incorporat la seqüència. (amb el temps ↓nº plasmidis) _Producció proteïna híbrida tubulina-GFP _Incorporació de la proteïna a l'orgànul o estructura, quan els ribosomes es dediquin a fer una proteïna amb catalassa, tindran GFP i anirà a parar al lumen del peroxisoma.
_Emissió de fluorescència quan són il·luminats amb llum UV⟶mentre la cell està viva.
Llum, foc, destrucció! 3. Microscopi de fluorescència - Té una bombeta de vapors de mercuri⟶emet tot l'espectre des de UV fins a vermell. A la nostra platina hi tenim una cell que hem marcat amb fluorescència prèviament (ex.catalasa i peroxisomes). FITC(fluorocrom verd). Podrem saber si hi ha peroxisomes en la cell depenent de si emet o no fluorescència.
-S'ha de triar un filtre adequat per la fluorescència verda.
1. Filtre barrera⟶ deixa passar la llum emesa amb λ 450-490 la fem servir per excitar la mostra. [hem d'excitar a una λ↓ del color que volem veure. λverd=500nm (FITC⟶498) necessitem una ↓λ a 498, blau~λ de 470nm] Cada filtre deixa passar unes λ diferents.
2. Mirall dicroic⟶desvia la llum blava fins a la mostra perquè la λ és ↓510nm. Impacta amb la mostra i aquesta al ser excitada emet llum de λ↑ 510nm, de manera que el mirall dicroic la deixa passar i aquesta es captada pel 3. Filtre d'emissió⟶deixa passar λ d'entre 520-560(específic pel color verd). Si es vol veure ↑λ⟶canvi de filtre.
[hem de tenir en compte les 3D de la cell, de manera que se'ns exciten tots els peroxisomes. Hi ha filtres molt bons que ens deixen veure més d'una λ, (ex. llum verda- λ= 500- i vermella- λ~600nm- a la vegada⟶filtres dobles⟶↑↑car ⟶hi ha microscopis de fluorescència invertits⟶revòlver sota de la mostra⟶cells o mostres en flascons, plaques de cultiu⟶cells vives] • Limitacions -En general⟶mostres fixades, es fa servir el mètode anticòs, no podem veure cells in vivo.
-Fadding⟶pèrdua de fluorescència degut a l'excés d'observació⟶fluorescència finita.
-Imgatge borrosa⟶totes les molècules de tots els plans que contenen fluorocroms estan emetent llum⟶superposició⟶mala qualitat d'imatge.
4. Microscopi làser scanning confocal (CLSM) -Làser⟶únic feix de llum que il·lumina un punt concret de la mostra⟶↓pèrdua de fluorescència⟶només la zona excitada emetrà fluorescència cap al detector.
Tenim: 1. filtre excitació 2. filtre d'emissió 3.Pinhole⟶diafragma que serveix per regular el ⦰ del feix de llum. En tenim 2⟶només rebem la imatge d'un pla⟶pinhole proper al detector només deixa passar un gruix de làser que prové del nostre pla. La resta no entrarà pel pinhole⟶no surten a la imatge obtinguda amb el microscopi.
Obrir em pinhole quan ↓fluorescència. Com ↑⦰ +=microscopi de fluorescència, ↓⦰ més confocal.
No s'ha de tallar la mostra amb micròtom⟶talls òptics⟶podem observar cells vives.
4.detector ⟶el gruix del feix que ens arriba al detector ve marcat pel tall òptic.
5.mirall dicroic _rastreig⟶tres moviments possibles amb un micromètric ens podem moure en els plans z,y i x⟶3D.
• Avantatges - ↑contrast -↓fadding⟶↑nitidesa Llum, foc, destrucció! -observació cells vives -Rastreig horitzontal i vertical -reconstrucció 3D⟶diferents talls òptics -mostres vivies amb GFP o equivalents [es pot programar el microscopi perquè faci una foto cada 515min⟶seguiment. Es pot instal·lar un incubador per mantenir les cells a 37ºC i el 5%de CO2 si no fos així⟶mort cells. ] 5. Microscopi làser scanning multiotó (MPLSM) ↑UV⟶mort cell, podem arribar a trencar el DNA. Per superar aquest impediment neix el MPLSM.
-es fan coincidir 2 fotons(↓ε però sumats tots 2 poden excitar la molècula) en una mateixa molècula. (ex. λvermell d'uns 600nm⟶danys. fotó de 300+fotó de 300=600 ⟶no provoca danys).
El primer fotó eleva la molècula i el segon encara més.
• Inconvenient -↓↓↓probabilitat de que 2 fotons coincideixin en una mateixa molècula ⟶en aquest microscopi en el punt d'enfocament la probabilitat de que 2 fotons es trobin és màxima -necessitem un tècnic que el sàpiga fer anar • Avantatges - es poden fer servir λ que no fan mal a la cell.
-no es necessita pinholes⟶no veiem borrós.
-↓fadding -↑λ no s'absorbeix.
...