Tema 12. Genómica (2017)

Resumen Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 3
Fecha de subida 19/06/2017
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SARA ARIAS BLANCO 17-6-17 TEMA 12. GENÓMICA Genómica I.
PROYECTO GENOMA Consiste en determinar la secuencia de una especie (orden de los nucleótidos en el DNA).
Métodos - Con BACs 1 1. Fragmentación, igestión e inserción del DNA en BACs (formación de cóntigos ) 2. Identificación y ubicación en el cromosoma con un mapa.
3. Fragmentación en trozos más pequeños para ser secuenciados Whole Genome Shot-gun (WGSA). Es una técnica más rápida.
1. Fraccionamiento del DNA en trozos de 2-50kb.
2. Subclonación en vectores plasmídicos para tener una cantidad redundante.
3. Secuenciación y ubicación.
- II.
SECUENCIACIÓN DE DNA Determinación del orden de los nucleótidos en una cadena de DNA. Existe un método químico (Maxam and Gilbert) basado en las propiedades diferentes de los 4nt pero apenas se utiliza.
A.
Método de Sanger (dideoxy) Se basa en usar dideoxidonucleótidos (cuando se incorporan a la cadena paran la síntesis de DNA).
Partimos de: ssDNA Primer marcado DNA polimerasa dATP, dGTP, dCTP, dTTP El proceso consiste en preparar 4 tubos diferentes con un dideoxidonucleótido en cada, y hacemos la síntesis del DNA.
Cada vez que se incorpore un ddnt, la síntesis se parará. Si la secuencia es 3’GGTACATGC5’, obtendremos; Tubo con ddATP: ACATGC y ATGC. // Tubo con ddGTP: GGTACATGC,GTACATGC y GC. Lo mismo en el resto de tubos; se forman muchos fragmentos de DNA de distinta longitud, porque la síntesis se detendrá en cualquiera de las posiciones donde se incorpore un dideoxinucleótido.
La concentración de los ddnt no debe ser muy alta.
Hacemos una electroforesis vertiendo el contenido de cada tubo en una columna, y miramos la diferencia de peso molecular para determinar la secuencia. La secuencia se leerá de menor a mayor peso.
Hay una variante que consiste en la fluorescencia de los segmentos de DNA copiados de la secuencia problema: los segmentos son aplicados a un gel capilar y sometidos a electroforesis.
1 Fragmento largo y continuo de un genoma, que ordenados forman un mapa físico del genoma.
Podemos secuenciar un DNA de un máximo de 200pb.
B.
Pirosecuenciación o secuenciación a gran escala Por síntesis de PCR en emulsión. Está basada en la liberación de un grupo pirofosfato, y se pueden secuenciar millones de pares de bases en 10h. Necesitamos previamente un mapa físico general.
Pasos: 1.
2.
3.
4.
5.
6.
Nebulación para fragmentar Unión con adaptadores A (complementario al primer) y B (se unirá a las esferas magnéticas, normalmente de biotina).
Inmobilización del DNA en esferas magnéticas recubiertas de Streptavidina, y obtención de ssDNA.
Con esferas de captura en exceso, conseguimos que haya un ssDNA por esfera.
Creamos microrreactores (esfera+reactivos de PCR) para amplificar el ssDNA. Después estos se rompen.
Ponemos las esferas en una capa porosa, de forma que quepa solo una por agujero.
Secuenciación: añadimos una a una disoluciones con un solo tipo de nucleótido. Si coincide con la secuencia, se unirá a una cadena unida a una esfera, y se liberará un grupo PPi. La apirasa degradará los nucleótidos no incorporados.
Con la sulfurilasa, este PPi se convertirá en ATP, y la luciferasa lo degradará y generará luz.
*Nos sirve para secuenciar genomas completos. Podemos caracterizar polimorfismos por genotipado.
III.
DNA FINGERPRINTING Se basa en la detección de STR (short tándem repeats): fragmentos de ADN que consisten en 2-5pb que se repiten varias veces y está ubicadas en los microsatélites. La variación del nº de repeticiones crea alelos.
Para determinar un alelo, se amplifica la secuencia por PCR, y después se determina la mayor longitud por electroforesis capilar.
*Nos sirve para distinguir entre individuos de una misma especie y para hacer pruebas de paternidad.
Si otra muestra, muestra del mismo perfil, es el mismo individuo. Si coincide en un 50% se trata de un hijo.
IV.
MICROARRAYS *Sirve para estudiar la asociación del genoma completo, para identificar la asociación de la expresión o un trato observable.
La técnica de microarrays sirve para ver genotipado (por ejemplo subtipos de papiloma) y consiste en una placa con agujeros muy pequeños, donde fijamos diferentes secuencias de DNA. Se usan para analizar la expresión diferencial de genes, por lo que partimos de cDNA.
Consiste en medir la hibridación de nuestro DNA con una sonda específica, mediante fluorescencia.
Podemos diferenciar por ejemplo, células sanas de tumorales: 1.
2.
3.
4.
Obtenemos mRNA de la sana y de la tumoral.
Obtenemos el cDNA por retrotranscripción del mRNA.
Hibridamos cDNA no tumoral con sonda verde (Cy3), y la tumoral con una roja (Cy5).
Eliminamos las sondas no hibridadas.
En el análisis, podremos saber la expresión diferencial del gen en una célula tumoral mediante el porcentaje de color.
2 V.
TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA CROMATINA (Chromatine inmunoprecipitation) Las modificaciones epigenéticas asociadas a la compactación de la cromatina son reversibles.
*Permiten caracterizar las interacciones proteína-DNA a lo largo del genoma, como factores de transcripción. También dónde se hacen las modificaciones de las histonas, que modifican la compactación de la cromatina.
Consiste en el entrecruzamiento de proteínas con el DNA de forma covalente (crosslink) con formaldehído, fragmentación del DNA con endonucleasas y precipitación con anticuerpos específicos.
La acetilación de histonas provoca la relajación de la cromatina, y ala metilación de citosinas de histonas hace que se compacte y reprime su transcripción.
Después podemos utilizar dos técnicas: A.
- Chip-chip: recuperamos el DNA precipitado y caracterizamos con microarray. Sirve para localizar algunas modificaciones del genoma.
B.
- VI.
ChIP-chip ChIP-Seq Chip-Seq: recuperamos, amplificamos y secuenciamos.
ESTUDIO DE LA METILACIÓN DEL DNA Podemos relacionar cambios en los patrones de metilación a enfermedades y envejecimiento.
Desmetilación → sobreexpresión de genes Hay una serie de procesos que permiten determinar si el DNA está metilado o no: - Digestión de la secuencia con endonucleasas sensibles a la metilación (hpaII). Los fragmentos hipermetilados resistirán la digestión, y serán amplificados por PCR para después ser secuenciados.
Bisulfito: convierte citosinas metiladas en U. Por la PCR, U→T, y comparamos esta secuencia con la conocida.
Inmunoprecipiración (mCIP): con anticuerpos que reconocen las citosinas metiladas. Amplificamos por PCR y secuenciamos con Microarray.
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