Tema 7 Electroforesis (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 16
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 7 Electroforesis Introducción a la electroforesis Se trata de una técnica utilizada en proteómica que consiste en separar las proteínas mediante un campo eléctrico.
Para llevarla a cabo es necesario contar con un soporte en el que las proteínas puedan avanzar, que normalmente suele ser un gel de poliacrilamida (PAGE), agarosa, acetato de celulosa, … La poliacrilamida es el material elegido para prácticamente todas las aplicaciones.
Además, aparte del soporte físico se acostumbra a tener un tampón que ayuda a hacer llegar a la corriente desde los electrodos hasta el gel.
El gel cuenta con unos pocillos en los que se carga la muestra.
Cuando hablamos de carga, debemos tener presente que ésta depende del pH del medio y del PI (punto isoeléctrico) de cada proteína. Como ya sabemos, el PI es aquel pH al cual la carga neta de la proteína es 0, por debajo del cual tendremos carga positiva y por encima, carga negativa. El PI no es relevante en todos los tipos de electroforesis.
1 Electroforesis Preparación de muestras para la electroforesis En primer lugar, es necesario obtener una muestra biológica a partir de la cual se extraen las proteínas. Después, deben eliminarse las sustancias que puedan interferir en la separación de proteínas (en las electroforesis menos "robustas" hay muchas cosas que pueden interferir).
La regla principal a la hora de hacer una electroforesis es que todas las proteínas deben estar en forma soluble. Para solubilizar las proteínas, se suelen emplear agentes caotrópicos y detergentes.
Tipos de electroforesis Podemos encontrar fundamentalmente tres tipos: Electroforesis nativa En principio tenemos las proteínas en estado nativo y no añadimos nada que altere su estructura tridimensional ni su carga endógena. Por tanto, separamos en función del tamaño y carga de la proteína.
También existe una variante de la nativa en la que sí se altera la carga de la proteína por lo que se separa únicamente en función del tamaño.
Electroforesis desnaturalizante Se trata del tipo de electroforesis más popular. Como su propio nombre indica, las proteínas se encuentran desnaturalizadas. Se separa en función del tamaño de la proteína.
Isoelectroenfoque Las proteínas se separan en función de su punto isoeléctrico (PI).
ELECTROFORESIS NATIVA Como ya se ha dicho, en este tipo de electroforesis se separan las proteínas en estado nativo en función de su carga y su masa.
Obtenemos la solución de proteínas y la sometemos a un campo eléctrico. La idea es que las proteínas deben avanzar a través de un gel, que normalmente es de poliacrilamida.
Los geles pueden hacerse a diferentes concentraciones de poliacrilamida: la poliacrilamida forma una especie de red que opone cierta resistencia al paso de las proteínas. Cuanto más concentrada está, generará un tamaño de poro menor, por lo que a las proteínas les costará más avanzar. Como es lógico, las proteínas más grandes tendrán mayor dificultad para avanzar a través de la red de poliacrilamida y avanzarán más lento.
Además, como estamos sometiendo las proteínas a un campo eléctrico, éstas avanzarán más fuertemente (en una dirección u otra) cuanto mayor sea su carga.
Por tanto, son masa y carga los fenómenos que afectan al movimiento de la proteína.
Además, el gel tendrá un pH concreto que afectará a la carga de la proteína. En función del punto isoeléctrico de la proteína, al pH del gel tendrá carga positiva, negativa o no tendrá carga. En caso de que, al pH del medio la proteína tenga carga positiva, al aplicar el campo eléctrico se desplazará hacia afuera del gel por lo que la proteína se perderá (no la separaremos por tanto). Además, las proteínas con un PI cercano al pH no avanzarán todo lo que les corresponda por su tamaño ya que a ese pH su carga neta es casi igual a 0.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La electroforesis nativa se usa por ejemplo para la separación de proteínas del sérum.
El principal defecto de esta técnica es que no tiene una gran resolución, es decir, como puede verse en la imagen, las bandas no quedan muy definidas. Otra desventaja es que no todas las proteínas se pueden separar.
La principal ventaja es que las proteínas se mantienen en estado nativo, lo que nos resulta útil a la hora de evidenciar cuestiones funcionales de la proteína, ya que no se pierde su estructura.
En el ejemplo de la imagen, los investigadores han querido analizar la actividad de dos isoenzimas que catalizan la misma reacción enzimática pero tienen distinta localización. En el primer caso comparan la SOD (superóxido dismutasa) mitocondrial y SOD citosólica. En el segundo caso comparan la aconitasa mitocondrial con la aconitasa citosólica. Se carga el extracto celular en el gel, en el que las enzimas mitocondriales correrán distinto que las citosólicas. La idea es conseguir que se dé actividad enzimática dentro del gel para ver si las proteínas se están expresando.
Al poder separar las isoenzimas mediante electroforesis podemos comprobar si en cada cepa se está expresando la enzima citosólica, la enzima mitocondrial o las dos. Sin separación electroforética obtendríamos señal en todos los casos y no podríamos discriminar si se trata de señal por parte de la enzima citosólica, de la mitocondrial o de ambas.
Si empleamos detergentes antes de realizar la electroforesis, estos deben ser no iónicos en el caso de la electroforesis nativa ya que no deben alterar la carga de las proteínas ni desnaturalizarlas. Suele usarse el dodecyl-maltósido.
3 Electroforesis Blue-native electrophoresis (BN-PAGE) Se trata de una variante de la electroforesis nativa. La idea es añadir el compuesto azul de Coomassie antes de hacer que corran las proteínas. El azul de Coomassie es un compuesto aromático que tiene algo de carga negativa, por lo que añadirse a las proteínas les confiere algo de carga negativa.
En principio se mantiene la estructura de la proteína, es decir, se mantienen las proteínas nativas (se mantienen incluso los complejos enzimáticos).
Lo que sí que cambia respecto a la electroforesis nativa es que las proteínas ya no se separan en función de su carga endógena ya que todas adquieren cierta carga negativa. Es decir, se trata de una separación en función del tamaño de la proteína.
La electroforesis blue-native es muy útil a la hora de estudiar complejos proteicos.
*Generalmente, si hacemos una electroforesis desnaturalizante la mayoría de las proteínas resultan menores de 100 kDa; en cambio, las proteínas nativas tienen un tamaño mayor.
Existen dos variantes del colorante azul de Coomassie: la R y la G. Éstas se diferencian principalmente en las propiedades de solubilidad: G es algo más soluble en solución acuosa que R por una pequeña diferencia en su estructura.
Para teñir proteínas en un gel, la variante R se usa en presencia de solventes orgánicos mientras que la variante G, también conocida como Coomassie coloidal, se usa en presencia de soluciones ácidas pero acuosas.
ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE En este tipo de electroforesis, las proteínas son separadas única y exclusivamente por su tamaño. Se añade un detergente iónico a la mezcla de proteínas que les añade carga. Además, al tratarse de un detergente iónico, tiene capacidad de interferir entre las interacciones que estabilizan la estructura tridimensional de la proteína, es decir, tiene capacidad de desnaturalizar las proteínas (de ahí el nombre de este tipo de electroforesis).
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La electroforesis desnaturalizante tiene gran resolución.
Además de su elevada resolución, esta electroforesis cuenta con otra gran virtud: como desnaturaliza las proteínas, es posible aplicarla a proteínas de membrana, ya que nos permite emplear detergentes muy fuertes. Es por esto por lo que se trata de la técnica estrella que se usa a la hora de hacer un Western Blot.
La principal desventaja también deriva del hecho de que las proteínas se desnaturalizan, a que con la desnaturalización, éstas se inactivan.
El detergente empleado debe ser iónico, ya sea catiónico o aniónico. Normalmente se usa SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), que da carga negativa a las proteínas.
Hay gente que usa algún detergente catiónico que de carga positiva a las proteínas, pero no es lo habitual.
La relación entre la movilidad de las proteínas y su peso molecular es una relación logarítmica. La electroforesis desnaturalizante nos puede servir por tanto para calcular el peso molecular aparente de la proteína.
A pesar de que las proteínas migran en función de su tamaño, los valores en kDa que resultan son menores a los que aparecen en la electroforesis nativa. Esto se debe a que, estando desnaturalizadas, pocas proteínas pasas de los 100 kDa (la mayoría oscila entre los 30 y los 80 kDa).
Western Blot Para hacer un Western Blot, una vez tenemos las proteínas separadas en el gel de electroforesis, se deben transferir a una membrana. Las membranas más comunes son las de PVDF o las de nitrocelulosa. En principio, hay muy pocas diferencias entre los dos tipos de membrana, aunque en ocasiones, hay alguna proteína concreta que se engancha mejor con alguna de las dos.
Una vez se ha transferido el resultado de la electroforesis a la membrana, la incubamos con anticuerpos contra la proteína. Finalmente, revelamos la membrana para localizar la proteína.
5 Electroforesis A veces, los anticuerpos funcionan mal y aparecen múltiples bandas, ninguna correspondiente al peso molecular de la proteína.
ISOELECTROENFOQUE Las proteínas quedan separadas en función de su punto isoeléctrico.
Tenemos un gel de electroforesis con una baja concentración de poliacrilamida, con la intención de que ésta solo nos sirva como soporte y no interfiera en la separación. Por otro lado, el pH a lo largo del gel no es constante, sino que tenemos un gradiente de pH.
Cuando ponemos la mezcla de proteínas sobre el gel y las sometemos a un campo eléctrico, lo que ocurrirá es que éstas se desplazarán solo hasta el punto en el que el pH del medio iguale a su punto isoeléctrico. Una vez hayan llegado a este punto, las proteínas dejarán de tener carga por tanto, dejarán de desplazarse.
Las proteínas deben cargarse en mitad del gel (donde el pH del gel es neutro) y, en función de su carga, se desplazarán hacia donde el pH sea más ácido o más básico.
Podemos tener una resolución bastante buena con esta electroforesis.
La desventaja es que se trata de una técnica muy delicada en la que pueden interferir muchos factores.
Esta técnica también es conocida como IEF o Isoelectric Focusing.
Para conseguir el gradiente de pH se emplean unos compuestos llamados anfolitos. Se trata de compuestos de bajo peso molecular de carácter anfótero que, en presencia de un campo eléctrico, en principio se ordenan en función de su punto isoeléctrico. Por tanto, ellos mismos se enfocarán y generarán un pH igual a su PI allí donde se queden . Así, se genera un gradiente de pH que se mantiene siempre y cuando mantengamos funcionando el campo eléctrico . Una vez se detiene el campo eléctrico, los anfolitos se mueven y se dispersan.
Los propios aminoácidos pueden ser empleados como anfolitos. (Normalmente, los anfolitos son derivados del ácido sulfónico, poliaminas y aminoácidos).
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Hoy en día, existen compañías que se dedican a fabricar y vender mezclas de anfolitos. Suelen ser mezclas de entre 30 y 50 compuestos diferentes. El fabricante ya indica el gradiente que la mezcla puede formar.
Una mejora que se ha ido desarrollando con los años es la posibilidad de comprar directamente un gel que ya tiene el gradiente de pH hecho. La casa comercial que los vende ha inmovilizado químicamente los anfolitos a la red de poliacrilamida. Así, el gradiente de pH ya está prefijado y es más estable.
Problemas del isoelectroenfoque Como ya se ha comentado, se trata de una técnica muy delicada. En primer lugar, generar gradiente de pH preciso y estable ya es un paso complicado.
La segunda cuestión es que los geles de baja concentración de poliacrilamida (4%) son muy lábiles y se rompen fácilmente.
Además, hay muchos compuestos que pueden interferir en la separación . Por ejemplo, cualquier compuesto cargado de la muestra interferirá en el resultado, por lo que en ningún caso se puede tratar la muestra con detergentes iónicos. También molestan mucho las sales y los tampones.
Cabe recordar que, a pH igual al punto isoeléctrico, las proteínas pueden precipitar. Como solución a este problema se puede añadir urea (agente caotrópico).
La carga del gel es limitada.
Separación de proteínas en geles bidimensionales La electroforesis bidimensional consiste en someter la muestra a dos tipos de electroforesis diferentes. Por ejemplo, podemos someter en primer lugar a la muestra a un isoelectroenfoque y después llevar a cabo una electroforesis desnaturalizante. Otras posibilidades son por ejemplo, realizar primero una electroforesis nativa y luego una desnaturalizante o realizar primero una electroforesis desnaturalizante con un detergente aniónico y después aplicar un detergente catiónico.
Como separamos las proteínas en función de dos propiedades, conseguimos una separación más resolutiva del proteoma.
La electroforesis bidimensional que mejor funciona es aquella en la que se hace primero un isoelectroenfoque y posteriormente una electroforesis desnaturalizante con SDS.
Una vez hemos separado las proteínas de la muestra mediante la primera electroforesis, cortamos en carril en el que han corrido y los situamos en la parte superior del segundo gel, que nos proporcionará la segunda dimensión. Una vez acabada la segunda electroforesis obtendremos un gel en el que cada proteína se representa como un punto (spots).
7 Electroforesis En la siguiente imagen vemos un ejemplo de electroforesis bidimensional en la que, en un lado tenemos las proteínas separadas en función de su punto isoeléctrico y en el otro lado, en función de su peso molecular. Como podemos comprobar, esta separación es mucho más resolutiva que la electroforesis monodimensional, ya que permite separar más proteínas. Es decir, permite hacer proteómica propiamente dicha.
Por ejemplo, nos permite realizar una comparación entre el proteoma de una levadura normal con el proteoma de una levadura con ataxia de Friedrich: se buscan todas aquellas proteínas que hayan cambiado su nivel de expresión en la situación patológica, que serán más abundantes en la electroforesis correspondiente a esta situación. Como tenemos cada proteína individualizada, podemos observar cosas que no podemos ver con una electroforesis normal.
Una vez se han llevado a cabo las dos electroforesis y se han encontrado las proteínas que se expresan de forma diferencial en las dos situaciones, se corta el trozo del gel donde se encuentran estos spots, se añade tripsina y, mediante espectrometría de masas, se identifica que proteínas son.
En este caso, estamos hablando de proteómica de primera generación.
En el caso concreto de las proteínas de levadura con y sin ataxia de Friedrich se identificó que las proteínas que se encontraban sobreexpresadas en la situación patológica correspondían a un mismo proceso biológico. Sin una hipótesis previa se pudo llegar a la conclusión de que se producía un estrés en la célula que inducía la expresión de ciertas proteínas.
Es frecuente que una misma proteína aparezca representada en más de un spot . Esto se debe a las modificaciones post-traduccionales (podemos encontrar diferentes poblaciones de proteína con diferentes modificaciones), a la presencia de fragmentos de degradación, … También es bastante típico que una misma proteína aparezca que varios spots que se encuentran juntos en forma de rosario (recta de spots). Esto probablemente se debe a pequeñas modificaciones.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Además, cuanto más nos acercamos a eucariotas superiores, con mayor frecuencia observamos estructuras como estas ya que tienen un proteoma más complejo y, por tanto, más modificado.
El principal problema de las electroforesis bidimensionales es que se trata de una técnica muy complicada que no siempre sale bien.
En el siguiente esquema podemos ver cuáles son los diferentes pasos a seguir cuando se lleva a cabo una electroforesis en dos dimensiones.
Primera dimensión: strips Hoy en día, una de las cosas que permiten que la electroforesis bidimensional salga mejor es llevar a cabo la primera dimensión en una pequeñas tiras o strips. Éstas consisten en pequeños geles que se compran con el gradiente de pH ya hecho, en las que se cargan las muestras.
Cuanto más grande es el gel de electroforesis, más resolución obtenemos. Nos encontramos ante una cuestión importante de tamaño ya que, si el proteoma es grande, necesitaremos geles más largos. Las tiras más grandes que podemos encontrar son de 24 cm (no las hay más grandes).
En principal problema que nos encontramos respecto al tamaño es que el gel donde se lleva a cabo la segunda dimensión debe tener el mismo tamaño que el gel donde se ha llevado a cabo la primera.
9 Electroforesis Detección de proteínas en gel Una vez hemos separado las proteínas, es necesario teñirlas para poder verlas, ya que no tienen color.
Hay diferentes tipos de tinciones: colorimétricas, fluorimétricas, tinción con nitrato de plata, … La alternativa a las tinciones es realizar un marcaje antes de la muestra antes de la electroforesis. Para ello, se añade a las proteínas un fluoróforo o un isótopo radioactivo.
Tinción - Azul de Coomassie. Como ya sabemos, existen dos variantes de este colorante: R y G, ambos más o menos igual de sensibles. La principal diferencia es su solubilidad, y es por lo que la tinción con la variante G se hace en presencia de soluciones acuosas ácidas mientras que la tinción con R se hace en presencia de solventes orgánicos. La variante G también es conocida como biosafe ya que, al no utilizar soluciones orgánicas resulta menos contaminante.
El azul de Coomassie tiene es una tinción con una gran sensibilidad y es compatible con la espectrometría de masas.
- Tinción de plata. Es prácticamente la tinción más sensible que hay (tiene una sensibilidad mucho mayor que la del azul de Coomassie). El principal problema de esta tinción es que se satura en seguida, es decir, tiene un rango dinámico muy limitado lo que hace que, cuantitativamente, no sea una buena tinción.
Otro inconveniente de la plata es que es poco compatible con la espectrometría de masas ya que el proceso de tinción a menudo implica un entrecruzamiento entre proteína y gel, lo que conlleva a que muchas veces no sea posible extraer las proteínas.
- Tinción fluorimétrica. Como cada casa comercial asigna un nombre concreto a su tinción, podemos encontrar diversas tinciones fluorescentes, como por ejemplo, SPYRO, Ruby o Flamingo. Estas tinciones presentan elevada sensibilidad y elevado rango dinámico (hasta tres órdenes de magnitud).
Son muy compatibles con espectrometría de masas. Su principal problema es su elevado precio.
Tanto el azul de Coomassie como la tinción con plata necesitan un densitómetro para cuantificar. En el caso de las tinciones fluorescentes es necesario utilizar un aparato que detecte fluorescencia.
En la siguiente imagen podemos ver un cuadro resumen con las características de los tres tipos de tinción comentados.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Equipos de imagen En la siguiente imagen podemos ver distintos aparatos y equipos de imagen que se pueden usar para visualizar las proteínas una vez teñidas.
En primer lugar tenemos un densitómetro de 12 bits. El número de bits indica la cantidad de intensidades de grises distintas o la cantidad de luz que puede detectar el equipo de imagen.
Por ejemplo, que un aparato tenga 12 bits quiere decir que tiene capacidad de distinguir entre 212 (4096) niveles de gris.
El ojo humano tiene capacidad de distinguir entre 80 niveles de grises.
Para medir la fluorescencia de una tinción o cuantificar es mejor cuantos más niveles de grises podamos reconocer ya que la máquina se saturará con menos dificultad y la cuantificación será mucho más precisa.
Los equipos de imagen que se usan normalmente tienen entre 2 y 16 bits.
El siguiente aparato (Versadoc MP 4000) tiene 16 bits y permite detectar fluorescencia o quimioluminiscencia (Western). El problema del Western Blot es que se hace sobre un film, un sistema muy discutible cuantitativamente, ya que no permite saber si la señal está o no saturada. Hoy en día contamos con estos aparatos que tienen una cámara con capacidad de detectar luz y que nos permiten ajustarnos mucho más a la realidad y saber si la señal está saturada. Además, los equipos más modernos están equipados con LEDs, que permiten excitar fluoróforos a diferentes longitudes de onda. Antes, la única manera de excitar fluoróforos específicos era con láser, que eran muy caros, o con filtros de luz.
Los equipos con láser, como el que se muestra en la imagen (Pharos FX) han ido desapareciendo con la llegada de los LEDs.
Marcaje fluorescente Se trata del marcaje que se realiza antes de correr el gel. Este puede ser radioactivo (poco habitual hoy en día) o fluorescente.
Para el marcaje fluorescente se marca la mezcla de proteínas con un fluoróforo. Para ello, se conjuga el fluoróforo con un grupo reactivo, como las yodoacetamidas (que se enganchan a grupos tiol).
11 Electroforesis A continuación, se lleva a cabo la electroforesis bidimensional y, una vez ha corrido el gel, lo ponemos directamente en un equipo que nos permita obtener la señal de las proteínas.
Este tipo de aproximación ha permitido llevar a cabo la técnica DIGE (Different Gel Electrophoresis). La idea de esta aproximación es utilizar una estrategia de marcaje de este tipo con un fluoróforo conjugado con un grupo NHS-éster, que se engancha sobre todo a las lisinas. Desarrollaron tres reactivos diferentes conjugados con NHS-éster, llamados Cy2, Cy3 y Cy5. Los tres son prácticamente idénticos: tienen dos zonas con anillos aromáticos y se diferencian en la separación entre estos. Al estar en unos reactivos los anillos más separados que en otros, tienen características espectrométricas distintas.
Tenemos dos muestras distintas para comparar: el extracto 1 se marca con Cy3 y el extracto dos se marca con Cy5. Después, se marca una mezcla de los dos extractos con Cy2, que servirá como referencia interna. A continuación se mezclan los tres extractos marcados y se hace una electroforesis bidimensional. Al revelar los resultados, adquirimos de forma separada cada fluoróforo. Se realiza un análisis cuantitativo para intentar encontrar proteínas que estén más presentes en uno de los dos extractos.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Una vez se han visualizado los resultados, se hace un análisis de imagen para encontrar las diferencias entre las dos muestras. Si hablamos de geles grandes, podemos obtener entre 400 y 500 spots, por lo que es necesaria la ayuda de un software.
En principio, con la técnica DIGE se consiguen resultados más fiables y se gana reproducibilidad.
Electroforesis en soportes no convencionales ELECTROFORESIS CAPILAR Como su propio nombre indica, consiste en llevar a cabo una electroforesis dentro de un capilar. En la siguiente imagen podemos ver un esquema del sistema de la electroforesis capilar: En primer lugar, tenemos un capilar, que tiene en los dos extremos unos electrodos bañados en un buffer. Entre los dos electrodos se establece una diferencia de potencial que acostumbra a ser bastante alta (alrededor de 30kV).
En el corte transversal del capilar vemos que este está formado por una pared de silicio con una abertura en el centro, normalmente bastante pequeña. Por esta abertura es por donde circularán los analitos.
Aparte de esto, en este tipo de electroforesis tenemos un detector cerca del cátodo. Los analitos que circulan por el interior del capilar van en dirección hacia el cátodo y, antes de llegar, pasan por el detector. Cada vez que pasa un analito, el detector detecta una señal.
Normalmente, acostumbra a tratarse de un detector de fluorescencia.
13 Electroforesis A partir del siguiente esquema en el que se representa la luz del capilar, podemos ver cómo se produce el fenómeno de la separación y el movimiento hacia el cátodo.
Dentro del capilar tenemos toda una serie de grupos Silanol. Los analitos se introducen en el interior del capilar en un tampón con cationes, que se alinean en contacto con estos grupos Silanol.
Al establecer una diferencia de potencial entre cátodo y ánodo, estos cationes tenderán a avanzar hacia el cátodo, generando un flujo que arrastrará todos los analitos inmersos en el buffer.
Independientemente de su carga, todos los analitos se desplazan hacia el cátodo, y por tanto hacia el detector, gracias a este flujo. Este tipo de flujo generado por una diferencia de potencial eléctrico, se llama flujo electrosmótico.
Los analitos, presentes en el buffer, sufrirán dos fuerzas: la del flujo electrosmótico y la de su propia carga. Si tienen carga negativa, intentarán desplazarse en dirección al ánodo. Como el flujo es mucho más fuerte que esta segunda fuerza, acabarán en el cátodo igualmente, aunque les costará más tiempo. Por tanto, llegarán al cátodo mucho antes aquellos analitos cuya carga les empuja a desplazarse a favor del flujo electrosmótico. Por tanto, este tipo de separación electroforética separa los analitos en función de su carga.
Antes de poner en marcha el campo eléctrico, los cationes se disponen de manera muy ordenada.
Estos hace que, al conectar el campo eléctrico, el flujo generado avance de manera muy uniforme.
En la siguiente imagen podemos ver una comparación entre el flujo hidrodinámico y el flujo electrosmótico. En el flujo hidrodinámico, propio de la cromatografía, la zona de contacto con la pared lleva cierto retraso respecto a la luz más interior del tubo. En el flujo electrosmótico en cambio, como se parte de una disposición muy ordenada de los cationes, el flujo avanza de manera muy homogénea dentro del tubo, lo que permite obtener una gran resolución.
Una columna de electroforesis capilar puede llegar a tener unos 92000 platos teóricos, mientras que una HPLC por ejemplo, consigue unos 4100.
La electroforesis capilar puede usarse para separar proteínas, para DNA, … Por ejemplo, muchos secuenciadores de DNA tienen como base la electroforesis capilar.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En el campo de las proteínas, la electroforesis capilar se utiliza con aplicaciones clínicas para la separación de proteínas del sérum. De hecho, la separación de proteínas del sérum por electroforesis es una técnica bastante antigua. Las proteínas se separan en condiciones nativas.
Del patrón de separación que se obtiene se pueden extraer datos con gran relevancia clínica: por ejemplo, el primer pico corresponde a la albúmina. El último pico que aparece en la gráfica se corresponde con las inmunoglobulinas, en caso de tener una muestra de un paciente con un linfoma, el pico será más elevado.
ELECTROFORESIS AUTOMÁTICA EN SISTEMAS MICROFLUÍDICOS Hay empresas que han comenzado a lanzar unos aparatos que contienen unos chips con pocillos en los que poner la muestra. Se pone la muestra en los pocillos y se coloca el chip dentro de la fuente de electroforesis.
La muestra avanza por una serie de canalillos que tiene el propio chip, en los que se produce la separación electroforética.
Este tipo de electroforesis puede llevarse a cabo para separar tanto proteínas como ácidos nucleicos (DNA o RNA).
15 Electroforesis Podemos ver cómo es el interior del chip en el siguiente esquema. El chip tiene un sistema de canales que están llenos de gel. Se establece una diferencia de potencial en el chip que provoca el movimiento de las proteínas de la muestra por los canales. Los analitos avanzan por éstos hasta llegar al canal central donde se produce la separación.
En el caso de las proteínas se trata de una electroforesis desnaturalizante.
Al final de los canales hay un detector, que detecta la fluorescencia de las proteínas, que deben marcarse previamente con fluorescencia.
En la gran mayoría de ocasiones en las que se hace una electroforesis, ésta se necesita para realizar un Western Blot. La empresa ProteinSimple ha desarrollado el sistema Simon, capaz de llevar a cabo un Western Blot en un sistema fluídico.
Las proteínas se separan en un capilar en el que, tras la separación, son inmovilizadas. Se echan los anticuerpos en el capilar.
Por tanto, esta empresa ha desarrollado la capacidad de hacer Westerns sin necesidad de emplear geles ni membranas.
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