Tema 4 - Sistemes de reparació del DNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 33
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TEMA 4 – Sistema de reparació de DNA en bacteris INTRODUCCIÓ 05/11/14 La taxa de mutació del genoma és de l’ordre de 10-3 – la DNA polimerasa s’equivoca força i habitualment. Però aquesta taxa de mutació no és la mateixa taxa d’obtenció de mutants, que està entre 10-6 i 10-9. Això vol dir que hi ha sistemes que detecten i reparen aquests errors.
TIPUS DE MUTACIONS MUTACIONS PUNTUALS – Canvis silenciosos (cap conseqüència a nivell d’AA), canvis puntuals en nucleòtids, en AA, mutacions sense sentit (codons STOP), etc.
MUTACIONS SENSE SENTIT MUTACIONS FRAMESHIFT INSERCIONS i DELECIONS – Engloba totes les translocacions. De totes, només les delecions són difícils de revertir – quan elimines del DNA un fragment molt gran, la cèl·lula no pot tornar a regenerar aquest fragment.
1 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 MECANISMES QUE PERMETEN RECUPERAR EL FENOTIP SALVATGE A PARTIR D’UNA SOCA MUTANT Revertir i suprimir una mutació són coses completament diferents.
REVERSIÓ En una soca es produeix una primera mutació – tindrem una reversió quan aquesta soca mutant pateix una segona mutació que afecta el mateix lloc que la primera i es recupera la seqüència salvatge de DNA i/o de proteïna – no tens perquè canviar els mateixos nucleòtids exactament en un triplet (a nivell de DNA), però pot codificar pel mateix aminoàcid/proteïna.
PSEUDOREVERSIÓ En una soca es produeix una primera mutació – tindrem una reversió quan aquesta soca mutant pateix una segona mutació que afecta el mateix lloc que la primera però ara no recuperem ni la seqüència de DNA ni de proteïna. Però l’AA nou incorporat permet recuperar la funció de la proteïna salvatge.
Exemple – tenim una soca salvatge, es dóna una mutació que canvia una Arg per una IsoLeu.
Una reversió seria que en aquesta soca es donés una segona mutació que col·loqués el mateix nucleòtid (obtenim el mateix triplet salvatge) o el canviés per un altre que fes que el triplet codifiqués igualment per l’Arg. Una pseudoreversió seria, en al segona mutació, col·locar un nucleòtid a la mateixa regió del triplet mutat fent que l’AA obtingut no fos l’Arg però que la proteïna obtinguda fos viable i que funcionalment s’assemblés a la obtinguda en la soca salvatge.
2 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 SUPRESSIÓ “Malament + Malament = Bé” En una soca es produeix una primera mutació – tindrem una supressió quan es produeix una segona mutació en un lloc diferent d’on s’havia produït la primera (no es recupera ni la seqüència de DNA ni de proteïna) però s’elimina de manera total o parcial l’efecte que produïa la primera mutació – el fenotip observat acaba sent el salvatge o quasi salvatge.
A nivell de fenotip, una reversió i una supressió acaben comportant un fenotip salvatge, però la forma d’obtenir això és diferent.
Trobem diferents mecanismes de supressions.
SUPRESSIÓ INTRAGÈNICA La segona mutació es produeix en el mateix gen però en un lloc diferent a la primera mutació.
CAS 1 – Canvi d’AA. Tenim una soca salvatge amb una proteïna fantàstica. Es dóna la 1a mutació i la proteïna deixa de ser funcional perquè ja no es pot plegar de manera correcta. La segona mutació es dóna en un lloc diferent però la presència d’aquest nou AA compensa la presència de la primera mutació, i la proteïna es torna a poder plegar. Genotípicament són diferents però fenotípicament no. També es considera supressió encara que la recuperació de la funcionalitat sigui parcial.
3 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 CAS 2 – Addició de bases. Es dóna una deleció d’una de les bases. El marc de lectura canvia a partir d’aquesta deleció i canvia completament la seqüència aminoacídica. Segurament començaran a haver codons stops i la proteïna acaba abans d’hora – soca no funcional. Si s’addiciona un nucleòtid en un lloc diferent de la 1a deleció però fa que recuperem el marc de lectura antic, canviaran només alguns aminoàcids i per tant si els AA afectats permeten el correcte plegament de la proteïna pot ser que la proteïna segueixi sent funcional.
SUPRESSIÓ INTERGÈNICA La segona mutació es produeix en un gen diferent al de la primera mutació.
CAS 1 – Gens compensatoris. La segona mutació es produeix en un gen diferent però la deficiència d’aquest gen compensa la deficiència del primer i s’acaba generant un fenotip salvatge tot i que genotípicament la cèl·lula tindria dues mutacions en dos gens diferents.
4 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Exemple – En la imatge, tenim l’exonucleasa V, que és la majoritària en E. coli – fa servir també altres exonucleases (com la I, que la fa servir en moments puntuals i el seu promotor està molt regulat, per tant la seva expressió és bastant baixa). Si es produeix una mutació en el gen recB, el que es genera és que la cèl·lula perdi la capacitat de degradar majoritàriament el DNA (la cèl·lula és viable però li costa reparar el DNA). Però si es produeix una mutació a nivell de promotor d’aquesta segona exonucleasa que faci que s’expressi molt més que de normal, la presència de l’exonucleasa I compensarà la manca de l’exonucleasa V.
Aquestes mutacions que afecten al promotor són mutacions que reben el nom de promoter up (incrementa l’expressió en un promotor) en contraposició de les promoter down (disminueix l’expressió en un promotor).
CAS 2 – A nivell de traducció. Hi ha una mutació en un 2n gen però aquest altre gen serà un gen que codifica per un tRNA. El que passarà és que aquest tRNA començarà a reconèixer codons que no li toquen i substituirà el codó mutat per l’AA que fa funcional la proteïna.
Tenim una soca salvatge on el tRNA reconeix un codó determinat (GUC) amb el seu anticodó (complementari a CAG) i carrega l’AA gln. Es dóna una primera mutació sense sentit i enlloc de CAG tenim UAG (és un codó stop) – la soca no pot produir la proteïna. Ara es dóna una segona mutació, una supressió intergènica a nivell de traducció – es dóna la mutació en un gen del tRNA (l’anomenarem tRNA supressor) i ara aquest tRNA deixa de reconèixer el codó GUC i reconeixerà UAG, que és un codó stop (ara l’anticodó és complementari a UAG)! Per cert, és una mutació àmbar i és una soca supressora àmbar. Ara, en aquesta soca, a nivell de genotip tindríem 2 mutacions i seria mutant pel gen en el qual s’ha incorporat la mutació sense sentit.
Però fenotípicament seria salvatge perquè la proteïna al final sé que s’obté; el ribosoma no es desestructura, sí que troba un tRNA que reconeix el codó stop – incorpora el tRNA mutat i continua amb la traducció.
Aquest és el concepte. Ara venen preguntes de oi oi oi que dice la loca.
Tenim tRNAs que reconeguin codons STOP? NO! Un ribosoma quan arriba a un codó stop es desancora perquè no hi ha cap tRNA que entri allà per continuar transferint la cadena peptídica, i per avorriment fa plum i es desancora (no és una senyal, és per avorriment).
Això és fantàstic per la proteïna mutada, però totes aquelles proteïnes que acabin amb el codó stop què? Totes les proteïnes que tenen gln amb el codó real no es poden sintetitzar? Un mateix AA és carregat per diferents triplets, però cada gen és codificat per un triplet. La idea és 5 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 que tenim més d’una còpia d’un tRNA, per tant tindrem tRNAs mutats i tRNAs no mutats.
Tenim uns gens que enlloc de gln tenen un codó stop. Tenim que un tRNA del gln es muta.
Però la resta de tRNAs no mutats podran unir-se a altres gens no mutats que codificaran per aquest tRNA.
FACTORS QUE DETERMINEN LA VIABILITAT DE LES SOQUES Su+ - Número de codons de fi de traducció Ara tots els stops seran reconeguts? Tots els codons que s’havien de llegir ara no es llegeixen? La idea és que un cistró normalment no té un codó STOP, en té més d’un en tàndem – de normal, si mirem la seqüència d’un gen, tenim codons STOP on ha d’acabar la transcripció però també passat aquest primer STOP. Per tant aquestes soques supressores allargaran un parell de nucleòtids més la transcripció d’una proteïna però acabaran la seva transcripció igualment gràcies a aquests altres STOPS que tenim més enllà del STOP principal (aquesta addició de pocs nucleòtids de més no tindrà conseqüències, les cèl·lules són viables).
- Número de còpies dels gens dels tRNAs A més, tenim més d’una còpia d’aquell tRNA – no tots els tRNAs per un mateix aminoàcid poden reconèixer un codi fi de traducció, hi ha forces còpies de cada gen tRNA. La resta de proteïnes amb aquest codó es podran traduir.
Si no passés això, parlaríem d’un efecte pleiotròpic – efecte en el qual un canvi dóna lloc a multitud d’efectes. Si totes les proteïnes amb aquest codó es veiessin afectades, la cèl·lula es veuria afectada a molts nivells.
Les soques que muten el seu tRNA s’anomenen Su+ o soques supressores. Si no té cap mutació en el tRNA, s’anomenen Su0 o soques salvatges.
6 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Tenim una mutació en el tRNA, però clar ara hem vist que l’AA mutat era el mateix que el que es posava després. Però una mateixa mutació supressora pot generar que hi hagi al supressió de tots els codons stop que reconegui. Si, per exemple, enlloc de gln tinguéssim Ala, la cadena aminoacídica enlloc de recuperar la Ala incorporaria un gln que podria fer funcional la proteïna (supressió) o no (pseudoreversió).
De canvis puntuals que donin lloc al reconeixement de codons stop es poden produir per recuperar tots 3 codons stop – mutacions que permetin supressions àmbar, ocre i sèpia; supressions dels diferents codons que codifiquen per l’stop. Inclús tenim supressions que fan que els tRNAS, enlloc de reconèixer 3 nucleòtids en el seu anticodó, en reconeixen 4, i això permet que se superin els canvis en els marcs de lectura. Si tens un nucleòtid de més, tindríem un corriment i la proteïna no sortiria, però si tenim un tRNA que reconeix 4 nucleòtids s’anul·la aquest efecte.
Molts virus utilitzen aquestes mutacions supressores que fan que un tRNA reconegui 4 nucleòtids com a sistema per codificar moltes proteïnes en el seu genoma – diferents marcs de lectura en el mateix segment.
EFICIÈNCIA DE LES SUPRESSOS I DE LES PSEUDOREVERSIONS L’eficiència de les supressions i de les pseudoreversions, depèn de la recuperació de l’activitat de la proteïna. Si recuperes el 100%, serà una proteïna totalment salvatge a nivell fenotípic.
Però recuperant un % menor a vegades el fenotip, sense ser igual al salvatge, deixa de ser defectuós. Potser no és suficient, però si ho és, la cèl·lula tindrà més fitness que les cèl·lules mutants inicials, s’adaptaran millor.
7 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Exemples de tRNAs supressors 8 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 AGENTS MUTÀGENS La polimerasa s’equivoca quan replica i això genera canvis, però altres canvis són produïts per la presència de compostos – tenim compostos que afecten directament el DNA i generen lesions que són reparades i acaben en mutacions.
Podem tractar un cultiu amb coses exògenes per obtenir mutacions, però la cèl·lula també produeix coses endògenes mutàgenes; a més en procariotes el DNA no està protegit per cap membrana nuclear, està en el citoplasma, per tant la generació de compostos en el citoplasma també pot generar lesions en el DNA – presència de radicals lliures (radicals oxigen), presència de radicals O-Fe, agents alquilants que es van produint al llarg de processos metabòlics, etc. És a dir, no cal irradiar una cèl·lula per mutar-la, ella soleta també ho fa. Les toxines secretades a l’exterior també poden afectar les cèl·lules que les reben.
A vegades ens interessa obtenir mutants per l’estudi de gens o per la producció de proteïnes o per altres finalitats i utilitzem aquests agents mutàgens per canviar les característiques al bitxo.
- Antibiòtics (Exogen) Bacteriocines (Exogen) Radicals oxigen (Endogen) Complexes de Oxigen-Ferro (Endogen) Errors de reparació o replicació (Endogen) Agents alquilants (Endogen) o SAM o Metabolits secundaris de vies de biosíntesis o Productes derivats de la reducció de nitrats Tenim tres tipus d’agents mutàgens: - - - Agents intercalants – es col·loquen entre mig de les bases i quan passa la DNA polimerasa pel mig en la replicació, col·loca una base de més ja que es pensa que aquest agent intercalant és una base i en posa una complementària. Per tant aquests agents generen corriments – es generen insercions i de rebot delecions. També generen canvis de base, però lo més freqüent són insercions i delecions.
Anàlegs de base – produeixen canvis de bases puntuals (transversions, transicions) ja que un anàleg de base és una base modificada. Per exemple, el 5-Bromouracil és un uracil que ha canvia una mica (se l’ha afegit un radical). Això fa que la DNA polimerasa posi G enlloc de T – canviem d’una base AT a una base GC.
Agents alquilants – es produeixen canvis de bases puntuals (transversions, transicions) ja que modifiquen les bases existents i li penja diferents grups. Per exemple, la hidroxilamina hidroxila les Citosines i aquestes passen de ser complementàries amb les Guanines a ser complementàries amb les Timines.
9 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Els dos primer grups, per produir mutacions necessiten que hi hagi replicació (la mutació es donarà quan la DNA polimerasa passi per allà). En canvi en el darrer grup no és necessari, ja que modifiquen les bases existents.
Mutàgens més utilitzats: 10 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 SISTEMES DE REPARACIÓ DE LESIONS DEL DNA Tenim molts sistemes de reparació. Entre ells, trobem els que solucionen errors espontanis: - Subunitat Ɛ DNA polimerasa III (Activitat Exonucleasa 3’  5’) Sistemes reparació “missmatch” (dam, dcm) Incorporació Uracil La resta actuaran quan la cèl·lula es lesiona per algun agent mutagen: - Fotorreactivació Escissió Recombinació Reparació SOS Adaptació Agents Alquilants Llista de gens implicats: 11 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 REPARACIÓ D’ERRORS ESPONTANIS SISTEMA DE REPARACIÓ PER MISSMATCH Un missmatch és un aparellament incorrecte de bases de DNA – quan hem col·locat una G amb una A, quan hem col·locat una T amb una C. Aquests errors són habituals quan l’activitat proofreading de la DNA polimerasa no ha detectat l’error.
Aquests sistemes de reparació estan associats a l’estat de metilació del DNA. La DAM-metilasa és qui metilava els GATC marcant que la forqueta de replicació havia passat ja per una regió. El sistema de reparació per missmatch utilitza aquest estat de metilació del DNA per saber quina és la cadena nova i quina la vella, i discernir quin és el nucleòtid que està mal col·locat i quin és el que hi hauria d’haver i per tant quin han de col·locar per corregir la complementarietat.
12 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 El seu sistema d’actuació utilitza l’interval de temps en que el DNA està hemimetilat (quan la cadena nova encara no s’ha metilat).
MECANISME D’ACTUACIÓ 10/11/14 Trobem tres proteïnes que reben el nom de Mut perquè tenen un fenotip mutator (tenen mutacions en els gens Mut – la seva taxa de generació de mutants és elevada). Tenim MutS, MutL i MutH.
Tenim la proteïna (mutS) que detecta un aparellament erroni, no hi ha complementarietat entre bases – la proteïna MutS és com un anell. Si la complementarietat de la cadena és correcta, la distància que hi ha entre les dues bases de cada una de les cadenes és sempre la mateixa. Quan hi ha un missmatch, com no hi ha un pont d’hidrogen, les dues bases complementàries pateixen variacions en la distància que les separa i la proteïna detecta aquest canvi. Quan això passa, MutS s’enganxa en aquesta regió del DNA i és llavors quan apareixen mutL i mutH que s’acoblen a mutS i detecten quina de les dues cadenes és la que està metilada (quina és la correcta, la vella, la que han de copiar que té el GATC metilat) i vehiculen l’entrada d’una helicasa i d’una exonucleasa i provoquen un tall en el DNA, per tant es degrada i separa el DNA i, mitjançant la polimerasa I i una lligasa, es reomple el foradet.
13 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Què passa quan tenim un mutant DAM- (metilasa que metila els GATC)? No tenim la bandereta, no tenim el DNA ben metilat. El sistema de missmatch funciona exactament igual, però agafen qualsevol de les dues cadenes a l’atzar (no s’allunyen molt de la zona on s’havia ancorat MutS). En un 50% de les ocasions la mutació es repara de forma correcta i en un 50% de les ocasions es fixarà la mutació. Els mutants DAM- tenen, per tant, moltes més mutacions – expressió gènica diferent. A vegades el complex M-L-H es desestructura en no trobar cap bandereta i no arregla res (quan no troben cap bandereta perquè no s’acaben d’ancorar) – en una següent ronda de replicació si no s’ha reparat el missmatch es fixarà la mutació.
SISTEMA UNG Degut a la incorporació errònia d’uracils enlloc de timines en el DNA (la DNA polimerasa posa ribonucleòtids complementaris a l’adenina enlloc dels desoxiribonucleòtids complementaris a l’adenina). Un DNA no té uracils, per tant la cèl·lula ho ha d’arreglar.
Aquest sistema és diu UNG perquè presenta un Uracil N gicosidasa que reconeix la presència d’Uracils, els elimina i afegeix timines.
En un nucleòtid tenim la base nitrogenada i la part que fa l’enllaç amb les altres bases. El que fa aquest enzim és eliminar la base nitrogenada però no l’enllaç. Ara la cèl·lula agafa la AP endonucleasa que detecta la presència d’un nucleòtid sense base nitrogenada (A pirimidina – A purimidina) i produeix un tall. En aquest tall trenquem l’enllaç fosfodièster entre les bases – generem un extrem 3’ on s’ancora la DNA polimerasa I que té activitat polimerasa 5’3’ i exonucleasa 3’5’, i per tant anirà eliminant els 14 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 nucleòtids de davant i anirà copiant ella nucleòtids per restaurar i tornar a omplir el fragment que faltava. Un cop ha caminat una estona (no tenen molta estabilitat sobre el DNA, acostumen a substituir 20-30 nucleòtids), pararà i tindrem un espai on no tindrem enllaç fosfodièster – ve una lligasa i ho relliga.
FOTOREACTIVACIÓ Ajuda a solucionar enllaços entre pirimidines. Els enllaços entre pirimidines connecten pirimidines entre elles, deixen de fer ponts d’H amb les bases complementàries. Per tant la cèl·lula no veu dues timines normals perquè estan unides covalentment (poden unir-se en la mateixa cadena i una en cada cadena, intercatenari).
Com es va descobrir el sistema? Si irradiem plaques de cultiu amb llum UV i una de les plaques la deixem en llum visible i l’altra la guardem sense llum, el que s’observa és que les primeres cèl·lules sobreviuen més que les altres; les cèl·lules procariotes tenen sentiments i se mueren por depresión.
Per què la presència de llum visible els afecta? Perquè tenim un enzim fotoliasa que es carrega amb la llum visible i detecta la presència de dímers de pirimidina i s’hi uneix. Quan hi ha llum solar, l’absorbeix, es carrega d’energia i desfà l’enllaç covalent entre pirimidines retornant la posició al seu estat original. Només ho pot fer si es carrega amb llum solar; si no, és un enzim no funcional.
15 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 SISTEMES DE REPARACIÓ PER ESCISSIÓ REPARACIÓ PER ESCISSIÓ DE BASES – BER És un sistema que serveix per resoldre els canvis de bases (quan una posició de la cadena no és complementària amb la base que hi ha a l’altra cadena – en la imatge, X).
Abans teníem la Uracil glicosilasa. Ara en tenim vàries ja que són específiques – cada una reconeix un canvi determinat. Exemples de canvis que detecta una N-glicosidases determinada: Uracil, Hydroxymethyluracil, Methylcytosine, Hypoxanthine, G-T mispairs, 3methyladenine, 7-methylguanine, 3-methylguanine, formamidopyrimidine, 8-hydroxyguanine, 5,6-hydrated thymine, pyrimidine dímers.
Aquesta N-glicosilasa s’emporta la base nitrogenada, deixa l’enllaç fosfodièster, apareix una AP endonucleasa, degrada el DNA, vindrà una DNA polimerasa que refarà el trosset i la lligasa ho lligarà.
També trobem l’enzim desoxiribofosfodiesterasa; en l’interval de temps des que actua la AP endonucleasa fins que actua la DNA polimerasa, retirem l’enllaç fosfodièster – la AP només talla a un nivell que no inclou l’enllaç fosfodièster, i s’ha de treure. L’enzim per tant elimina l’enllaç fosfodièster i fa el forat gran deixant zero rastre de l’anterior ribonucleòtid.
En funció del microorganisme i de a quins agents mutàgens acostumen a estar exposats, els s’han adaptat pe reconèixer més ràpidament unes modificacions que unes altres.
16 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 REPARACIÓ PER ESCISSIÓ DE NUCLEÒTIDS – NER És un sistema d’escissió de nucleòtids. Involucra vàries proteïnes, però bàsicament les que intervenen específicament són les Uvr perquè els mutants en aquests gens són més sensibles a la radiació ultraviolada.
El sistema detecta la presència de lesions i elimina un fragment de DNA perquè torni a ser copiat més tard.
Tenim una lesió (dímer de pirimidines – deixen de fer unions amb ponts d’hidrogen i formen una protuberància en el DNA [OBRIM PARÈNTESI – tot i que les glicosilases detecten específicament un determinat canvi, un mateix canvi pot ser arreglat per diversos sistemes – sistemes redundants – TANQUEM PARÈNTESI]); les proteïnes UvrB i UvrA (formen un complex, concretament tenim una B i 2 A) van pul·lulant pel DNA i detecten les modificacions en les cadenes. Quan ho detecten, s’ancoren al DNA. Quan el complex s’ha ancorat vehiculen (ajuden, nucleen, permeten, afegeixen, adéu pinça de la Susana) la incorporació de l’element UvrC en el complex. Quan UvrC s’incorpora al complex, UvrA se’n va, i queda el complex C-B ancorat al DNA. Quan això passa, B i C tenen activitat endonucleasa, per tant cada una d’elles genera un tall a banda i banda de la lesió (aquest tall és un tall característic en funció de cada proteïna; en E. coli la C talla a 8 nucleòtids i B a 4/5, en funció de la seva pròpia grandària). Així deixen un tros de DNA que no hi ha res – la DNA polimerasa I detecta un extrem 3’ lliure, copia i la lligasa torna a donar continuïtat al DNA.
17 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Mateix esquema però més bonic i difícil.
Figure 1. Recognition and repair of DNA damage by UvrABC. In the global repair pathway, UvrA and UvrB form an ATP dependent heterotrimer or heterotetramer (see text) that directly recognizes damaged DNA. In the transcription coupled repair pathway, Mfd (TRCF) recruits UvrA to the site of DNA damage marked by a stalled RNA polymerase. In both pathways, UvrA loads UvrB onto the damaged DNA and subsequently dissociates, leaving behind a stable UvrB:DNA preincision complex. UvrC binds to the preincision complex and mediates the incisions on both the 3¢ and 5¢ sides of the DNA. UvrD (DNA helicase II) removes the incised oligonucleotide and UvrC.
DNA polymerase I fills the gap and triggers the release of UvrB. The newly synthesized ends are sealed to the parental strands by DNA ligase.
LESIONS QUE REPARA NER (UvrABC) - Qualsevol protuberàncies” en el DNA Llocs AP (Baixa eficiència) Glicols de Timina Enllaços creuats intra- i intercatenari Algunes estructures “intercalants” Imatge – s’eliminen fragments més llargs (16pb) si les protuberàncies són més grans.
18 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 SISTEMA DE REPARACIÓ ACOBLAT A TRANSCRIPCIÓ Els sistemes de reparació també estan acoblats a la transcripció. A vegades, la primera en detectar-ho és la RNA polimerasa en no saber quina base posar ja que no hi ha complementarietat (si hi ha dues timines juntes, no ho entén). Per tant, s’encalla i això és senyal d’error.
Un cop s’encalla, es va tancant el complex i la RNA polimerasa s’acabarà desestructurant. Però abans de saltar, la cèl·lula detecta que aquesta RNA polimerasa està anant més a poc a poc del normal, i el complex Mfd (Multifactor depression) detecta aquesta desacceleració i s’acobla a la RNA polimerasa abans que salti, i també s’enganxa en la regió del DNA on es troba encallada. Aquest factor s’acobla al complex UrvAB (reconeix Mfd); s’escindeix A, ve C i passa tot lo descrit abans. Per tant, Mfd vehicula el sistema Ner.
Figure 1. Recognition and repair of DNA damage by UvrABC. In the global repair pathway, UvrA and UvrB form an ATP dependent heterotrimer or heterotetramer (see text) that directly recognizes damaged DNA. In the transcription coupled repair pathway, Mfd (TRCF) recruits UvrA to the site of DNA damage marked by a stalled RNA polymerase. In both pathways, UvrA loads UvrB onto the damaged DNA and subsequently dissociates, leaving behind a stable UvrB:DNA preincision complex. UvrC binds to the preincision complex and mediates the incisions on both the 3¢ and 5¢ sides of the DNA. UvrD (DNA helicase II) removes the incised oligonucleotide and UvrC.
DNA polymerase I fills the gap and triggers the release of UvrB. The newly synthesized ends are sealed to the parental strands by DNA ligase.
19 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 REPARACIÓ PER RECOMBINACIÓ Quan tenim situacions com: - - Aturada de la forquilla de replicació per lesions – tenim un pollo gordo perquè tenim la forqueta oberta i la polimerasa III no pot avançar.
Reparació de enllaços intercatenaris – tens com a motlle l’altre cadena, és relativament fàcil arreglar-la; en el moment en que tens problemes en les dues cadenes, si elimines coses ja no tens un motllo que copiar.
Reparació de talls de doble cadena – com sap què ha d’enganxar si no tenim motlle.
Les polimerases que actuen en la cèl·lula quan es troba en situació d’estrès són qualsevol menys la III (és la de replicació habitual) i la I (ajuda la replicació en Okazaki i és la de reparació habitual) s’anomenen error prom i són la II, IV i V – són polimerases que s’equivoquen molt, de baixa fidelitat de còpia. Quan troben una lesió en el DNA, no saben què posar i posen alguna cosa por poner algo i la cèl·lula va acumulant errors.
11/11/14 Tenim una forqueta de replicació intentant replicar i ens trobem, per exemple, amb un dímer de pirimidina (TT). La polimerasa no sap què posar i es desestructura perquè s’alenteix. Això és un pollo enorme, perquè tornar a muntar tot això és pollo.
Els sistemes de la cèl·lula poden actuar d’emergència – substitueixen la polimerasa III per una d’emergència com pot ser la II(error prom). Però clar, tenim un fragment en el qual no hi hem posat res, ni sabem què hi hem de posar. Els sistemes de reparació tampoc poden actuar, ja que si tallen allà, no hi ha res a l’altra banda perquè no tens una cadena motlle (la cadena està oberta). Per tant no podem utilitzar cap dels sistemes de reparació comentats, ni la fotoliasa (no tenim DNA de doble cadena) ni el sistema NER perquè talla a banda i banda, i si tallem i no tenim res a copiar, trenquem la continuïtat del DNA.
20 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 El primer que actua és la proteïna RecA, que detecta DNA de cadena senzilla; s’hi uneix i l’embolcalla, i això el protegeix de l’acció d’exonucleases, mecanisme que la cèl·lula té per tallar DNA que detecta que és de cadena senzilla, i això no és el que volem (això també ho pot fer la proteïna Ssb, de la forqueta de replicació, que també detecta DNA de cadena senzilla i l’embolcalla, però no fa res més). RecA fa més coses – intenta buscar homologia en altres llocs del DNA que puguin ser complementaris d’aquesta regió que ha quedat sola i desemparada.
RecA és una celestina, busca la mitja taronja de la monocadena.
I qui és homòleg a la cadena trencada? Estem replicant la cadena groga direcció 3’  5’, per tant estem fent una nova cadena groga direcció 5’3’, que és exactament igual que la cadena original complementària a la que estem sintetitzant, la negra 5’3’. Per tant RecA fa que aquesta cadena groga que no sap com completar perquè no té motllo que copiar envaeixi la cadena negra homòloga, que és l’altra còpia de la cadena groga i té un fragment complementari. Però trios no, la complementarietat ha de ser 2 a 2. Per tant quan RecA detecta la complementarietat, el que fa és desplaçar la cadena groga perquè interaccioni amb la negra però com a resultat desplaça la cadena negra que estava sintetitzant la forqueta que també era complementària a la negra amb la qual RecA vol complementar la seva groga desemparada. Capbum.
Però ara, per ajuntar un que estava sol, la cadena groga que s’estava sintetitzant com a complementària de la que té l’error amb direcció 5’3’ també es queda sola. Torna a ser una cadena senzilla, així que RecA, que ja s’ha desenganxat de l’altre perquè en el moment en que tenim doble cadena RecA se’n va, torna a embolcallar aquesta cadena i li torna a buscar complementarietat, i la troba justament en la cadena que ha estat desplaçada com a conseqüència de l’anterior parejita – la cadena negra que s’estava sintetitzant de novo en direcció 3’5’ és complementària a aquest tros de cadena groga direcció 5’3’. Per tant, RecA detecta homologia, se’n va i la DNA polimerasa fa la còpia en el trosset que no hi ha res de la cadena groga utilitzant com a motllo aquesta negra.
21 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Com veiem en la imatge, la cadena negra desplaçada és un motlle per la cadena groga que ha deixa un gap, i com tenim un extrem 3’ lliure en la cadena groga (era on s’havia quedat bloquejada la replicació perquè en la cadena motlle tenia el dímer de timines), s’enganxarà la DNA polimerasa, la que toqui (és una situació estressada, per tant pot ser qualsevol, la III no) i començarà a copiar perquè té una cadena motlle que permetrà fer la còpia.
En aquesta situació tenim un pollo de DNA. Tenim dues estructures de Holliday, un creuament de les dues cadenes que sortien de la forquilla de replicació. La cèl·lula pot triar diferents camins per solucionar-ho.
El primer problema de base (el forat de la cadena groga 5’3’) ja l’ha omplert. Però encara no hem reparat la lesió.
Resolució per migració de la branca – la primera solució passa per deslligar les estructures de Holliday simplement tornant la cadena negra al seu lloc original i la cadena groga també al seu lloc original. Un cop es donés, els sistemes de reparació de la cèl·lula repararia el trosset de còpia en negre discontinu de manera normal.
Però seguim tenint el dímer.
22 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Resolució per trencament – la segona solució passa per deslligar les dues Holi sóc una estructures de Holliday (és el mateix que diapo del tema en la segregació de cromosomes , un tall 1 de les estructures). El trencament pot ser horitzontal o vertical. En funció de com tallem tindrem possibilitats diferents, fins a 4 – si tallem vertical, tallem les cadenes externes, l’estructura gira (isomeritzacions); si tallem horitzontal, tallem les internes, es dóna una recombinació. Les altres 2 possibilitats passen perquè una de les dues unions Holliday pot resoldre’s vertical i l’altra horitzontal – es resolen de manera independent l’una de l’altra.
Què fa que es repari d’una forma o d’una altra? En funció de quines proteïnes s’associen primer – depenem de la concentració relativa de certes proteïnes en l’entorn cel·lular. Si venen les proteïnes RuvABC, es repararà per trencament – són resolvases que reconeixen les unions Holliday (XerDiC també eren resolvases que actuaven en les regions dif però eren especifiques de lloc i reconeixien una seqüència en concret). Si s’associen helicases (com ara RecG) i tal es repararà per migració – separaran les estructures trencant els ponts d’hidrogen a banda i banda i faran que retornin amb les cadenes que toca, del mismo colorito.
Com hem dit, les combinacions poden ser múltiples perquè depèn de com s’ha inserta el sistema RuvABC. Les combinatòries són les del full quadriculat molt mono que posaràs després d’aquesta pàgina.
La teoria semiconservativa del DNA en les estructures de Holliday no té perquè mantenir-se – les regions on s’ha resolt Holiday hem pogut intercanviar cadenes noves amb velles.
23 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Quan resolem una estructura de Holliday en el cromosoma bacterià, tens resolvases que funcionen a priori, funcionen abans que qualsevol sistema de reparació.
Però l’error no s’ha solucionat – simplement la presència de RecA ha solucionat el GAP i ara hem reparat amb els sistemes habituals les lesions que hem provocat a conseqüència.
Però aquest sistema també permet reparar enllaços de pirimidines entre dues cadenes diferents (intercatenaris). Les lesions entre dos nucleòtids poden enganxar covalentment dues cadenes. Si el dímer de pirimidines afecten dues timines que afecten dues cadenes diferents, quan el sistema UvrABC detecta la lesió tallarà el DNA i l’helicasa traurà els ponts d’hidrogen – però si l’enllaç es covalent, ens quedarà “penjant” un tros de DNA. Això vol dir que en aquesta posició la cèl·lula no sap què hi ha (allò per la cèl·lula no és una timina, i tindrem un GAP). Ara el sistema UvrABC si talla no tenim motllo. Per tant, RecA es torna a unir al DNA de cadena simple, la torna a embolcallar i torna a buscar homologia – ara troba homologia en l’altra còpia del DNA (la cèl·lula pot tenir dues còpies d’un cromosoma bacterià quan s’està replicant – és més probable del que sembla).
24 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TRENCAMENTS DE DOBLE CADENA Una altra lesió/error que detecta i repara el sistema de reparació per recombinació són els talls de dues cadenes. Això és un desastre, ja que la cèl·lula pot no saber com allò funciona.
Fa temps es pensava que en procariotes la única manera de reparar aquestes lesions era per recombinació. Després es va veure que hi havia grampositius que són capaços de fer rejoining, un rejuntao. Després s’ha vist que molts més procariotes ho poden fer. Per tant, existeix un mecanisme en concret per resoldre talls de doble cadena – just quan es dóna el trencament, una proteïna reconeix el trencament de l’enllaç fosfodièster de les dues cadenes (discontinuïtat en el DNA), diu hòstia que van junts, i uneix els extrems.
El que també se sabia que feien la majoria de procariotes era una reparació per recombinació homòloga.
De què depèn que actuï un sistema o altre? Si tenim les proteïnes del rejoining a prop, actuarà aquest mecanisme que és molt més senzill. Però si el DNA ja s’ha separat i les proteïnes no detecten que aquells dos fragments de DNA formen part de la mateixa molècula de DNA, actuen els mecanismes de reparació per recombinació.
25 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 La idea és – es dóna un tall bicatenari. Tenim dos extrems lliures de DNA. En aquests extrems s’uneixen una sèrie de proteïnes que es diuen Rec de recombinació (RecB, C i D) que degraden el DNA tras tras tras (només degraden una de les dues cadenes – la 5’; deixen la 3’ protuberant, overhang). Fins on tallen? Fins que arriben a una seqüència de reconeixement Chi (seqüència petita de nucleòtids molt freqüent per combinatòria). Llavors, el complex de Recs es desenganxa i ens quedaria: Com el complex de Recs han degradat l’extrem 5’, tenim DNA de cadena senzilla, el reconeix RecA, va a buscar cadenes homologues, anirà a envair altres dobles cadenes, permetrà que hi hagi replicació i resoldrà les unions Holliday que es generin per migració de branca o per trencament.
26 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 La resolució en 2 o en 1 de una Holliday junction dóna lloc a diferents fragments de DNA però la informació de DNA serà la mateixa – el contingut serà el mateix, però l’origen del DNA serà diferent (referint-nos a si ve de la mateixa cadena que ja teníem o d’una que s’ha sintetitzat de novo).
TALLS EN 2 – Procés conservatiu. TALLS EN 1 – Procés amb recombinació REPARACIÓ S.O.S.
Les cèl·lules procariotes tenen mecanismes que detecten si el seu grau de lesió és molt alt.
Quan la quantitat de lesions en el genoma és molt alta, la cèl·lula passa de fer incisions i talls del DNA per després reomplir fragments ja que tens molts fragments i talls alhora – desintegres el DNA. Per tant, la cèl·lula moriria.
27 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Qui va al rescat? Les proteïnes SsB i RecA protegeixen de l’acció de les exonucleases els fragments de DNA de cadena senzilla generats en els moments en que s’intenta reparar el DNA. Però si comences a tenir molt DNA de cadena senzilla, la cèl·lula també mor perquè no arriba a reparar-ho mai. Per tant, el que tenen en aquestes situacions són sistemes de reparació d’emergència. Qui avisa d’aquestes situacions? La proteïna RecA – es troba en abundància quan tenim moltes lesions que provoquen DNA de cadena senzilla. Aquesta resposta està vehiculada també a través d’un regulador negatiu (repressor) anomenat LexA.
Es tracta d’un sistema d’expressió gènica global (poden haver milers de gens canviant el seu patró d’expressió). Quan parlem d’estrès, parlem de lesions múltiples en el DNA.
Quines coses indueixen aquesta resposta de salvament global? 28 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 SISTEMA SOS EN E. COLI Himne de vida – vaig a sobreviure perquè he de sobreviure. L’objectiu és superar les lesions.
És un exemple clàssic de resposta coordinada amb un control negatiu per inducció – resposta global de la cèl·lula davant de lesions en el DNA. L’objectiu és superar les lesions i permetre la viabilitat cel·lular.
Aquest sistema està estretament lligat amb que potser no conserves el DNA tan íntegre com la cèl·lula desitjaria – a costa de mutacions, acabarem podent dividir la cèl·lula però potser aquests canvis acaben matant a la cèl·lula. Per tant en aquesta situació podem sobreviure i ser viables però els canvis introduïts per aconseguir-ho ens acaben matant.
En E. coli el que agrupa més de 40 gens implicats en funcions diverses (recombinació, reparació, replicació, divisió cel·lular, etc.). El sistema té dos principals protagonistes – LexA (repressor del sistema) i RecA (activador del sistema). El sistema SOS és un sistema de control negatiu per inducció, on trobem el sistema reprimit per LexA (bloqueja l’expressió dels gens que està regulant) fins que arriba RecA i l’activa, l’avisa que està en situació d’estrès, ja que és l’activador del sistema.
Dins el reguló LexA, tenim el LexA, tenim a RecA i altres gens involucrats en la reparació del DNA – LexA regula la seva pròpia expressió, la de RecA i la d’altres gens que seran els gens SOS involucrats en el sistema.
Què fa LexA com a regulador (repressor) transcripcional? Actua de forma dimèrica sobre els promotors d’aquests gens que regula. En una cèl·lula normal, tot això es troba en un estat basal en el qual tenim un dímer de LexA reprimint els 3 promotors que trobem.
Ara la cèl·lula s’estressa i s’indueix el sistema SOS – es produeixen lesions en el DNA, es bloquegen replicació i transcripció, etc. i es genera ssDNA, cosa que provoca que es generi RecA, ho detecti i s’hi uneixi. Quan RecA nucleofilamenta el DNA de monocadena, canvia a nivell conformacional. Aquest RecA amb el canvi conformacional s’anomena RecA*. Ara, RecA adquireix una nova funció – indueix el trencament de la proteïna LexA – actuarà com a coproteasa facilitant el trencament de LexA (no el trenca ella però ajuda – RecA agafa un protó a LexA i això indueix el trencament, una serina i una lisina troben a faltar el protó, li roben a un altre AA i es trenca tot – es una historia muy triste la de LexA).
29 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Quan LexA es trenca es trenca, es separen els dos dominis, i en aquesta situació de trencament LexA ja no pot dimeritzar, i el dímer era el que permetia la unió als promotors, per tant ja no s’uneix a promotors i s’indueix l’activació del sistema (control negatiu perquè LexA és un repressor i per inducció, perquè el ssDNA acaba provocant el trencament de LexA).
Amb aquesta activació estem incrementant moltíssim (fins a 10,15 20 vegades) l’expressió dels gens que estaven reprimits – incrementem la quantitat de RecA (cada cop tenim més ssDNAs, necessitem RecA per la reparació per recombinació) i també incrementem la síntesi de tots aquells gens SOS, com ara ssB, RuvABC, UvrABC, VRD (és la polimerasa V), la polimerasa IV, i més proteïnes implicades en la reparació. També, en E. coli, s’incrementa l’expressió de la proteïna SulA, que és un inhibidor de la divisió cel·lular. SulA el que aconsegueix inhibint la divisió cel·lular són dues coses: permet que la cèl·lula només es divideixi quan te el DNA íntegre sense lesions i permet a la cèl·lula tenir còpies des d’on poder reparar futures lesions (tenim DNA que s’estan dividint, tenim més d’una còpia del cromosoma, llavors es bloqueja transitòriament). El que fa SulA concretament és unir-se al septe que separa les dues cèl·lules filles. És a dir, SulA interacciona amb el septe fent que no pugui dividir-se. Però aquesta unió és reversible, i quan ja no hi ha inducció de la resposta SOS i el sistema es restaura, el septe es pot tornar a formar.
Si tot funciona bé i reparem les lesions, deixarem de tenir RecA activat, LexA es tornarà a dimeritzar i s’ancorarà a nivell de promotor i restaurarem el sistema tornant a un estat basal.
30 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 GENS CROMOSÒMICS DEL SISTEMA SOS D’ E. coli Coses que veurem en relació al sistema SOS - Inhibició divisió cel·lular (pot disminuir rendiment del creixement de cultius).
Inducció de fags atenuats (profags) en cèl·lules lisogèniques (pot provocar la pèrdua de “litres” de cultius).
Increment de la mutagènesi (facilita la millora genètica de soques).
INHIBICIÓ REVERSIBLE DE LA DIVISIÓ CELULAR Com hem dit, LexA incrementa l’expressió de SulA que interacciona amb el producte genic FtsZ (tots els gens Fts són gens relacionats al septe), s’hi uneix i això inhibeix que FtsZ polimeritzi el septe i les cèl·lules no es divideixen. Quan es restaura el sistema i torna a haver-hi repressió per part de LexA, SulA és degradada (vida mitjana curta), tenim concentracions molt baixes de SulA i FtsZ és lliure de formar de nou el septe.
31 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Ens ha portat una foto dels filaments en un macròfag – tenim centímetres i centímetres de cèl·lula (és un fantasma mentre no es pot dividir, botifarrons de DNA). Es van produint septes i quan es torna a un estat basal tallen tot això en cachitos fent que la cèl·lula torni a una mida normal.
CICLE DE BACTERIÒFAGS ATENUATS RecA* també indueix el cicle lític dels bacteriòfags atemperats (bacteriòfag – lítics, lisen la cèl·lula i atenuats, viuen en estat latent en al cèl·lula). El sistema SOS és un sistema acoblat entre aquests paràsits patògens extracromosòmics, ja que usen aquest sistema com a senyal de qualitat de la vida que els espera dins la cèl·lula. A nivell molecular, els bacteriòfags utilitzen el sistema SOS per veure si el lloc on estan vivint en forma latent és bo, i si no ho es, lisen la cèl·lula i marxen per no morir junt amb la cèl·lula. Hi ha bacteriòfags que tenen repressors del cicle lític, que està apagant la part de lisi del bacteriòfag atemperat i que permet que estigui estable dins el cromosoma; aquest repressor es trenca igual que LexA; és a dir, RecA* també roba un protó a aquest repressor del cicle lític i així deixar de reprimir el cicle lític, per tant estem activant el cicle lític, estem produint bacteriòfags pa largarse, ja que pensen hò0stia, si el bacteri on estic vivint m’està dient que està estressat, pues casi que me largo.
Altres bacteriòfags tenen un repressor regulat pel LexA del bacteri. És a dir, l’activador del cicle lític està controlat per LexA. Si tot va bé, LexA bloqueja l’expressió de l’activador de cicle lític i no es dona el cicle lític. Quan LexA no hi és, deixa de reprimir aquest cicle, es produeix el cicle lític i es lisa la cèl·lula i l’alliberació de bacteriòfags. És a dir, el bacteriòfag acobla el seu activador del cicle lític amb el repressor del bacteri.
32 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 UmuDC Les polimerases II, IV i V són de baixa fidelitat de còpia, per tant el sistema SOS, en augmentar l’expressió d’aquestes error prom polimerases, acaben augmentant la mutagènesi de les cèl·lules.
La II i la IV són polimerases que se sobreexpressen en presència de lesions.
La polimerasa V (UmuDC) és una mica especial – està formada per diferents unitat. Quan la cèl·lula la produeix, és inactiva ja que és de les que més s’equivoca. Només funciona quan a la subunitat de l’UmuD se li trenca un trosset – aquesta polimerasa escindida si que és activa. Això té relació amb RecA*– quan RecA està associat a ssDNA també indueix el trencament d’UmuD cosa que acaba produint una polimerasa activa que posa qualsevol cosa per tal d’omplir forats, donar integritat al DNA per fer que deixi d’estar RecA unit. Un cop tenim dsDNA ja es repararan les mutacions incorporades.
Ara bé, aquí poden passar dues coses. Si les mutacions incorporades afecten gens essencials, la cèl·lula mor igualment. Però si tota aquesta sèrie de mutacions incorporades acaben donant lloc a una seqüència millor de nucleòtids, podem trobar bacteris que en sortir d’una situació d’estrès són millors del què havien entrat.
Un bacteri porta milions d’anys evolucionant i té un DNA que en aquell moment és el millor.
Però si ha arribat a una situació d’estrès potser és que ja no estem tan bé. Per tant aquests canvis sense consens a l’atzar poden acabar generant una millora que no té perquè produir-se en tots els individus. Però potser algun sobreviu i li va de puta mare. Quan es retorna a l’estat basal, la fidelitat de còpia de les polimerases que queden dins la cèl·lula tornar a ser basal, i tornem a una taxa de mutagènesi normal. Per tant la cèl·lula reté aquestes polimerases que ho fan de puta pena per quan necessitem un canvi radical porque nos estamos muriendo.
33 ...