9. (I) Enzimologia (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Bases moleculars de la vida
Año del apunte 2015
Páginas 9
Fecha de subida 13/09/2017
Descargas 1
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 9. ENZIMOLOGIA Els enzims controlen el metabolisme accelerant les reaccions metabòliques. L’especificitat dels enzims es deu al fet que hi ha una regulació enzimàtica diferent.
DIFERÈNCIES AMB CATALITZADORS ORGÀNICS - Els enzims són més actius i reutilitzables.
- Actuen en condicions de pH i temperatura diferents. En el cas dels enzims, les condicions de temperatura i pH òptimes són les fisiològiques; si són massa elevades, es desnaturalitzen.
- Generalment, les proteïnes de massa molecular gran es troben com a mínim en estructura terciària.
- Els enzims són específics i regulables i es troben bàsicament al fetge. Si trobem enzims en sang significa que hi ha dany hepàtic.
- “In vivo”, els enzims treballen en compartiments.
COMPARTIMENTATS Els enzims es troben agrupats en compartiments i de vegades constitueixen grans complexos.
Això comporta que cada teixit tingui una sèrie d’enzims predominants. Ex: els enzims de les cisternes de l’aparell de Golgi.
- Nucli: replicar el DNA, síntesi del RNAt, del RNAm i d’algunes proteïnes nuclears.
- Nuclèol: síntesi del RNA ribosòmic.
- Reticle endoplasmàtic: síntesi de lípids, enviament dels productes biosintètics a la seva localització final.
- Ribosomes: síntesi de proteïnes.
- Microcossos: oxidació dels aminoàcids, reaccions de la catalasa i la peroxidasa, degradació dels esterols i, en les plantes, reaccions del cicle del glicoxilat.
- Membrana plasmàtica: sistemes de transport dependents d’energia.
- Complex de Golgi: maduració de les glicoproteïnes i altres components de les membranes i dels vasos secretors.
- Cloroplasts: fotosíntesi.
- Mitocondris: cicle de l’àcid cítric, transport electrònic i fosforilació oxidativa, oxidació dels àcids grassos, catabolisme dels aminoàcids, oxidació del piruvat.
- Lisosomes: segregació dels enzims hidrolítics com la ribonucleasa i la fosfatasa àcida.
- Grànuls de glicogen: síntesi i degradació del glucogen.
- Citosol: glicòlisi, moltes reaccions de la gluconeogènesi, ruta de les pentoses fosfat, activació dels aminoàcids, síntesi d’àcids grassos, síntesi de nucleòtids.
ESTRUCTURA Majoritàriament tenen una estructura proteica. Són proteïnes de massa molecular variada, però totes tenen com a mínim una estructura terciària.
També existeixen enzims no proteics, com els ribozims, que són fragments de RNA de cadena simple que actuen com enzims. Es van descobrir en microorganismes, però existeixen a tots els organismes. En ser de cadena simple, poden formar bucles per complementarietat. Actuen com a enzims quan en el seu ARN inicial no s’han eliminat els introns, però només actuen sobre àcids nucleics.
Els holoenzims són heteroproteïnes perquè no només contenen elements proteics. Estan formats per un apoenzim, que és el grup proteic, i un cofactor, que és un grup no proteic.
Els cofactors poden ser, o bé cations metàl·lics (zinc, calci, ferro, magnesi), o bé molècules orgàniques, que quan s’uneixen dèbilment a l’apoenzim formen coenzims (NAD-, FAD-), i quan s’hi uneixen fortament formen grups prostètics (grup hemo).
Molts coenzims se sintetitzen a partir de certes vitamines.
DOMINIS Els enzims es caracteritzen per tenir diferents dominis: - Centre actiu: és el punt d’unió al substrat. És una “butxaca” lliure d’aigua.
- Centre d’unió al substrat: aminoàcids del centre actiu on s’uneix el substrat.
- Centre catalític: aminoàcids del centre actiu que participen en la catàlisi. Els aminoàcids estan molt conservats i poden estar separats pel que fa a la seqüència, però una vegada l’enzim està replegat en estructura terciària, es troben a prop entre ells. Sempre es troben a la mateixa regió perquè fan la mateixa funció.
L’enzim s’uneix al substrat gràcies als aminoàcids de fixació, formant un complex enzimàtic i, gràcies a l’acció dels aminoàcids catalítics, el substrat es trenca i es converteix en producte.
ESPECIFICITAT A diferència dels catalitzadors orgànics, els enzims són específics: només s’uneixen al tipus de substrat que els correspon.
L’especificitat té graus i varia segons l’enzim: pocs enzims poden actuar gairebé sobre qualsevol substrat, mentre que la majoria tenen estereoespecificitat, és a dir, “reconeixen” especificitat òptica.
Els més específics són els estereoenzims, i els que menys, les proteases.
MOLTS TENEN ISOENZIMS Els isoenzims catalitzen les mateixes reaccions, però tenen una estructura diferent (diferent punt isoelèctric, diferent pes molecular, diferent nombre de substrats...).
Es troben en compartiments diferents, fet que permet que cada orgànul i teixit tingui una adaptació metabòlica diferent (no és igual la glucòlisi muscular que la hepàtica).
CLASSIFICACIÓ 1 - Oxireductasa: catalitza reaccions redox (cedeixen o capten electrons).
Transferasa: catalitza processos de transferència (transfereixen grups).
- Liasa: catalitza la síntesi o ruptura d’enllaços (sense energia).
Hidrolasa: catalitza reaccions de ruptura de molècules (amb aigua).
- Isomerasa: catalitza reaccions d’isomeria de tot tipus.
- Lligasa: catalitza la síntesi o ruptura d’enllaços amb la participació de molècules d’elevat contingut energètic (ATP).
1 1r número: marca la reacció; 2n i 3r: acoten la reacció; 4t: específic de cada enzim CINÈTICA ENZIMÀTICA Per tal que una reacció sigui espontània, l’energia lliure de Gibbs ha de ser negativa. Els enzims acceleren la velocitat de les reaccions energèticament possibles, disminuint l’energia d’activació, sense afectar a l’equilibri de la reacció.
Si G és positiva però hi ha una gran quantitat de substrat, la reacció pot arribar a donar-se.
La velocitat de reacció depèn del nombre de molècules per unitat de temps que estan en estat de transició.
L’enzim augmenta el nombre de molècules en estat de transició.
L’energia d’activació són es calories necessàries per portar 1 mol de molècules a l’estat de transició.
Per tant, per estabilitzar l’estat de transició, cal disminuir l’energia d’activació.
a) L’energia lliure no varia.
b) Hi ha d’haver un increment d’energia lliure  estat de transició. Aquest increment d’energia és l’energia d’activació.
c)L’estat de mitja cadira és intermedi i inestable. Correspon a un estat d’energia superior, ja que nosaltres aportem una força.
L’estat de transició és inestable, però és necessari.
És un estat intermediari. Com més molècules hi hagi a l’estat de transició, més ràpidament es dóna la reacció.
En reaccions catalitzades, l’energia lliure de Gibbs és més petita (energia d’activació).
cada muntanyeta: estat de transició.
TPI loop mutant: enzim mutat TPI: triosa fosfat isomerasa wild type: enzim no mutat a) MECANISMES DE CATÀLISI ENZIMÀTICA O MECANISMES PELS QUALS ELS ENZIMS ESTABILITZEN L’ESTAT DE TRANSICIÓ Són mecanismes no excloents (un enzim en pot fer servir diversos).
I. Mecanisme de proximitat i orientació La presència de l’enzim fixa les molècules en la posició correcta per tal que es produeixi l’enllaç. Per tant, l’enzim estabilitza l’estat de transició.
Aquesta reacció es podria donar sense l’enzim, però hi hauria una probabilitat de xoc molt petita i l’enzim la facilita.
II. Adaptació o ajustament induït Tant l’enzim com el substrat estan en conformacions diferents. L’enzim va canviant i, en un moment donat, quadra amb el substrat. Gràcies a l’atracció electrònica s’estabilitza aquesta conformació.
III. Catàlisi àcida o bàsica Els aminoàcids del centre catalític són aminoàcids àcids o bàsics que participaran aportant o captant electrons.
Així, el substrat es trencarà per un enzim que segueixi aquest mecanisme de catàlisi.
IV. Mecanisme de catàlisi covalent Succeeix quan es forma un enllaç covalent entre l’enzim i l’aminoàcid del centre catalític del substrat.
Els aminoàcids que aporta el grup àcid han de ser hidrofòbics per poder unir-se a la butxaca hidrofòbica formant interaccions hidrofòbiques.
1. El substrat polipeptídic s’uneix de manera no covalent amb les cadenes laterals de la butxaca hidrofòbica.
2. H+ és transferit de la serina a la histidina i s’arriba a l’estat de transició.
3. H+ és transferit al fragment C-terminal, que és alliberat. L’N-terminal es lliga a la serina 4. Una molècula d’aigua s’uneix a l’enzim, al lloc del polipèptid alliberat.
5. La molècula d’aigua transfereix el seu protó a la histidina, i l’OH al substrat restant. Es torna a arribar a l’estat de transició.
6. S’allibera el segon fragment peptídic. L’enzim torna a estar disponible per interactuar amb un substrat.
Que es desprengui el producte és el més difícil. Si mirem la velocitat al llarg del temps, totes les etapes duren molt poc, però la darrera etapa (la de despreniment del producte) dura molt, en comparació.  és l’etapa limitant.
Com que la darrera velocitat és la més lenta, és aquesta la que utilitzarem a l’hora de fer els càlculs, per tal de simplificar.
* En l’estat de transició s’assoleix un nivell energètic superior.
V. Mecanisme de clau i forrellat El substrat canvia la seva conformació.
b) CINÈTICA ENZIMÀTICA (MICHAELIS-MENTEN) NO SEMPRE LA PODEM APLICAR! El pH, la força iònica, la concentració d’enzim total i la concentració de substrat afecten a la velocitat inicial.
Aquestes reaccions es fan in vitro: hi ha unes quantitats fixes d’enzim i de substrat determinades per nosaltres. És un tub d’assaig amb [Et] on les condicions com el pH o la temperatura són òptimes.
Les velocitats sempre són v0: l’enzim total que es posa quan comença la reacció es presentarà en dues formes: lliure o unit al substrat (ES). Cal veure com augmenten o disminueixen les concentracions al llarg del temps.
Durant la reacció trobarem l’estat estacionari. La cinètica de l’estat estacionari és [ET]=[Elliure]+[ES]. L’estat estacionari es produeix quan la concentració d’ES és constant.
La velocitat màxima: s’hi arriba quan tot l’enzim està en forma ES. La velocitat d’una reacció és proporcional al nombre de molècules que estan en estat de transició. La velocitat d’una reacció catalitzada per enzims és proporcional al nombre de molècules en forma ES (estat de transició).
La VT (de tot el procés) és igual a la V2.
a) Hi ha un punt en què es desnaturalitzen b) pH òptim (punta) A) En aigua destil·lada molts enzims no funcionen degut a la poca concentració de sals: poca velocitat.
*La PCR permet replicar el DNA i per desenganxar les dues cadenes s’augmenta la temperatura. Si es baixa la polimerasa replica un altre cop.
Com més gran sigui KM, el complex ES serà més inestable perquè les constants de dissociació seran més grans que les de formació.
Que la [ES] sigui constant no vol dir que estigui saturat.
En l’estadi estacionari, la [ES] és gairebé constant.
Quan s’acaba el substrat, [Elliure] tornarà a augmentar.
1) Quan tot l’enzim està saturat per substrat: [S]>>> Km 2) [S] <<< Km: funció lineal 3) [S] = Km : la velocitat és la meitat de la velocitat màxima.
- La velocitat varia linealment amb la concentració d’enzim.
- Podem determinar Km, però no sabem segur que sigui la Km d’aquell enzim, perquè intervenen reguladors, inhibidors, etc. Per saber-ho, repetim l’experiment en diferents concentracions d’enzim total, si es manté constant, és correcte.
c) REACCIONS BI-SUBSTRAT a) Seqüencials: 1) A l’atzar: hi haurà dues Km (una pel substrat A i l’altra pel B).  dues cinètiques diferents, poden tenir afinitats diferents.
Vmàx depèn de la sortida del producte, que pot ser diferent per P i per Q.
2) Ordenat: Passa el mateix tant si és a l’atzar com ordenat.
b) De desplaçament: ping-pong En aquest tipus de mecanisme, després de la unió del primer substrat s’allibera un dels productes en una reacció parcial en què es genera una forma modificada de l’enzim (acil enzims, fosforil enzims).
Aquesta forma s’uneix al següent substrat, catalitzant la formació del segon producte amb regeneració de la forma nativa de l’enzim.
Aquest tipus de mecanisme és molt comú en les reaccions en què un grup químic es transfereix des del substrat A al B, és a dir, en reaccions de transferències. (transferases) - La fenilalanina és el substrat que funciona millor de la taula per l’enzim.
S’enganxarà millor amb la butxaca hidrofòbica de l’enzim, ja que és l’aminoàcid més hidrofòbic.
c) LINEALITZACIÓ DE LINEWEAVER-BURK (Només aplicable a Michaelis-Menten) - El punt de tall de la discontínua amb les coordenades=1/Km (negatiu quan s’extrapola cap als negatius).
- Per trobar la Vmàx fem la inversa del punt de tall amb les ordenades - Com més gran sigui la Km, menor serà l’afinitat.
...

Comprar Previsualizar