Tema 15. Precesamiento de muestras (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Patología celular y molecular
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 03/05/2016
Descargas 3
Subido por

Vista previa del texto

2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PATOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR TEMA 15. Procesamiento de muestras y tejidos para el estudio en patología molecular y celular Estas muestras son válidas tanto para el diagnóstico - se emplean en el servicio de anatomía patológicacomo para la investigación. Tipos de muestras: - Biopsias: se trata de la obtención de un trozo (muestra) del tejido u órgano de cuya función se quiere elaborar un diagnóstico, es decir, se quiere ver si hay patología (e identificarla en caso de que la haya). Por ejemplo, un aspirado endometrial.
- Pieza quirúrgica: se extrae un trozo o muestra del tejido cuando ya se ha elaborado el diagnóstico de la patología. Por ejemplo, en casos de cáncer de útero se lleva a cabo una histerectomía.
- Citologías: citología cervical, PAAF, … - Otros tipos: sangres, aspirados de médula ósea, de líquido cefalorraquídeo, … es decir, muestra de cualquier fluido líquido.
Después, para elaborar la muestra se seleccionan las partes del tejido que más nos interesan - en caso de que se trate de una biopsia nos interesa todo el tejido extraído, ya que se trata de una muestra pequeña.
A partir de aquí, con las biopsias y las piezas quirúrgicas pueden seguirse dos caminos: - Congelación . no se fija el tejido. Normalmente, para poder después hacer secciones del tejido, se coloca encima una especia de resina o pegamento - OCT, líquido a tª ambiente y sólido cuando se congela. Las muestras se congelan con nitrógeno líquido o hielo seco.
Para obtener láminas de tejido que puedan ser analizadas, se secciona con el criostato.
- Fijación e inclusión en parafina Primero, el tejido se somete a un proceso de deshidratación para poder infiltrar con parafina. Estas piezas se cortan con microtomo.
Las muestras se emplean para tinciones, ensayos de inmunohistoquímica, de inmunofluorescencia, FISH, RT-PCR, PCR 1 Patología celular y molecular Cada una de estas vías tiene técnicas asociadas que se realizan preferencialmente con una u otra. Por ejemplo, para tinción de hematoxilina-eosina, conviene usar tejidos parafinados, ya que conservan mejor la arquitectura del tejido (porque están fijados).
Por otro lado, a partir de tejidos parafinados no es recomendable hacer una extracción de RNA, ya que se trata de un producto muy lábil  se rompe durante los procesos de fijación, deshidratación e inclusión en parafina. Tampoco es aconsejable partir de estas muestras para hacer una extracción de DNA que va a ser empleada en una PCR muy larga ya que se rompe.
La congelación se recomienda para extracción de ácidos nucleicos (se obtiene DNA y RNA de bastante buena calidad). También es mejor emplear la congelación si se quiere realizar una inmunofluorescencia, ya que la fijación con formol enmascara muchos antígenos.
Con estas muestras pueden buscarse alteraciones a diferentes niveles: - Histopatología - tinción hematoxilina-eosina.
- Análisis a nivel molecular de proteínas - inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, Western Blot, ELISA, técnicas de espectrofotometría de masas,...
- Análisis de RNA - análisis de transcriptasa reversa y PCR.
- Análisis de DNA - FISH, PCR, secuenciación Muchas veces es necesario llevar a cabo más de un análisis, ya que en cualquier patología hay afectación a todos los niveles. Deben integrarse los datos de histológicos, moleculares, bioquímicos y genéticos para saber qué ocurre con la muestra y poder conocer los mecanismos de patogénesis.
Además, es necesario correlacionar los datos clínicos con los datos de análisis.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Con la histopatología se realiza un análisis del fenotipo/morfología.
En la imagen podemos ver una tinción hematoxilina-eosina de un endometrio en fase secretora.
Para realizar diagnósticos morfológicos, la rutina es la tinción hematoxilina-eosina.
Hay una serie de colorantes que se emplean para poner de manifiesto otras estructuras o tipos celulares  tinciones especiales.
INMUNOHISTOQUÍMICA Esta técnica se emplea mucho tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación. Puede hacerse a partir de tejido fresco o a partir de una muestra parafinada.
Si se parte de una muestra incluida en parafina, lo primero que hay que hacer es desparafinar y rehidratar la muestra. Muchas veces, se aplican procedimientos de antigen retrieval, es decir, desenmascaramiento de antígeno. Esto debe hacerse ya que la fijación con formol enmascara muchos antígenos que no podrán ser reconocidos por el anticuerpo.
Antes de echar sobre la muestra los anticuerpos, deben bloquearse los lugares específicos de unión (normalmente albúmina). Después, suele aplicarse un anticuerpo primario y, posteriormente, el anticuerpo secundario conjugado con alguna enzima. Estas enzimas suelen ser la fosfatasa 3 Patología celular y molecular alcalina o la peroxidasa  se emplean enzimas que catalicen reacciones cuyos productos tengan color para poder detectar dónde se da la reacción enzimática (y por tanto, donde se encontraba el antígeno).
PATOLOGÍA MOLECULAR Para realizar estudios a nivel molecular suele requerirse la extracción de ácidos nucleicos. A partir del DNA aislado pueden aplicarse técnicas de diagnóstico molecular.
Se aplican por ejemplo, técnicas de hibridación in situ, como FISH.
APLICACIONES DE LA PATOLOGÍA MOLECULAR - Diagnóstico: identificación del agente causante de la patología.
- Pronóstico: valor predictivo de la evolución.
- Prevención: identificación de factores genéticos de riesgo.
- Tratamiento: identificación de dianas terapéuticas.
4 ...

Comprar Previsualizar