tema 3 (1) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura evolución humana y diversidad molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 26/06/2017
Descargas 1
Subido por

Vista previa del texto

RLFPs Hay MGM proteicos y MGM del DNA.
La proteína es un producto de expresión genómica. Lo que interesa no es la proteína en si, lo que interesa en ver que ocurre en la variabilidad de ese genoma, con fines totalmente prácticos. Yo tengo productos de expresión genómica y tengo la opción de ir directamente al genoma.
Cuando hablamos de marcadores de DNA están los FLRP, los CNVs, SNPs y otros (marcadores no autosómicos y extranucleares) EXTRACCIÓN DE DNA Todos los marcadores pasan por un análisis previo a partir de muestras biológicas que tienen DNA, una vez aislado el DNA el siguiente punto es la selección.
Primero tenemos que ver que células contienes DNA. Hay fluidos corporales que no tienes DNA como el líquido pleural o lagrimal. La saliva lleva células de descamación de las pareces bucales que si son células. El plasma no tiene DNA y los eritrocitos tampoco tienen DNA, son células anucleadas. Cualquier tejido o fluido que pueda contener células completas si va a ser una fuente de DNA.
Incapacidad patológica de empatía es lo que caracteriza a los asesinos en serie A partir de que tengo células nucleadas tengo que obtener un buen DNA.
- - La extracción clásica por solventes orgánicos es un proceso sencillo y con buen rendimiento Por resinas quelantes. Las partículas de la resina atrapa las moléculas de DNA y se liga a esta molécula, este DNA queda ya en la resina. Entonces se toma la solución con resina quelante cada partícula del DNA está en cada una de estar resinas quelantes.
Esta quelación cuando yo lo someto a un choque térmico a una elevada temperatura se produce la ruptura, de tal manera que voy a encontrar libre las moléculas de DNA mientras que las partículas de la resina quedan libres. Si hago una centrifugación, yo entonces las partículas pesadas van al fondo y queda el sobrenadante con el DNA. Se tranfiere a otro tubo que contiene un tampón.
Sílice diatomeas. Tiene un formado similar al anterior. Primero captura y después liberación por choque térmico.
Columnas de extracción, lo que hacen es un proceso que es la filtración en gel. Yo tengo una columna rellena de una sustancia porosa, a esta sustancia se incorpora la solución (muestra biológica), va a ir pasando y las moléculas de DNA que pasan va a ir se capturadas. El líquido que llega al final no tiene DNA. La siguiente fase es la liberación, y se produce por cambio de pH. Inyectamos una solución a otro pH que permita la liberación de las moléculas de DNA, las moléculas del DNA se van a liberar y van a ser recogidas en un ependorff.
TEMA 3 RLFPs 1 - Otros: precipitación salina, por una cuestión de carga….
POLIMORFISMOS DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN NATURALEZA MOLECULAR Y PRINCIPIO TEÓRICO Yo tengo el DNA de dos individuos, es posible que para un fragmento va a haber una gran similitud de toda la secuencia sin embargo podemos encontrar diferencias nucleotídicas puntuales. ¿Cómo se diferencias estas diferencias? Mediante enzimas de restricción, son endonucleasas que lo que hacen es reconocer una secuencia específica en el genoma y se acoplan al genoma, a esa región, y una vez que se acopló corta el DNA y origina un fragmento.
Estos fragmentos de restricción van a ser reconocidos por las endonucleasas, y por lo tanto va a ver diferente tamaño de los fragmentos Diana de restricción: refleja las mutaciones nucleoítidicas Mapa de restricción Los patrones de la longitud de las bandas están reflejando las variaciones nucleotídicas a partir de dianas de restricción. La presencia o ausencia de cortes está indicando la presencia o ausencia de dianas de restricción y por consiguiente la presencia o ausencia de variaciones nucleotídicas TEMA 3 RLFPs 2 La presencia o ausencia de una variante nucleotídica es detectada finalmente a nivel de análisis electroforético METODOLOGÍA GENERAL Tenemos que partir de células nucleadas y aislar el DNA. Incorporamos a cada DNA de individuos diferentes el mismo enzima de restricción (endonucleasas) que reconoce secuencias nucleotídicas concretas originando dianas de restricción. Cada diana de restricción determina un punto de corte y origina dos fragmentos, pero si otro individuo presenta una mutación nucleotídica diferente que no es reconocida por esa endonucleasa no origina fragmento de restricción y da lugar a un único fragmento. Esto se distingue a nivel electroforético.
¿Los fragmentos de restricción se pueden ver directamente? No, porque tenemos todo el DNA del individuo de cada muestra, pero en todo el DNA hay miles de puntos de corte con la misma secuencia, tendremos miles de fragmento y uno de ellos será el que tenga la mutación concreta que interesa analizar.
Si hacemos electroforesis, encontramos que cada individuo tiene la misma eletroforesis porque analizamos todo el genoma, pero dentro de uno de esos fragmentos están los fragmentos que queremos analizar por tinción estándar, de manera que no podemos distinguirlos porque teñimos todo el DNA. Esto se conoce como smear.
TEMA 3 RLFPs 3 Si tenemos la electroforesis, tenemos que distinguir y diseñar una técnica específica que permita reflejar específicamente las bandas que interesa visualizar frente a todo el sumatorio de bandas.
Una vez que efectúo la electroforesis tengo que efectuar una transferencia, un bloting. Las bandas que están en el gen, dando que el gel es una materia porosa pueden transferirse a la membrana (nitrocelulosa, son muy frágiles, y PVC, son las que se utilizan ahora). Tengo lo mismo que tenía en el gen (una manchurrón, pero contiene los fragmentos que yo quiero).
Se coge una parte, la mutación nucleotídica va a estar en esa región. Se diseña un cDNA que acote la región, es una sonda complementaria. La sonde presenta un DNA que cuando se encuentre con la región que es complementaria se hibridará selectivamente y formará una estructura estable, el resto del genoma pasa desapercibido. Lo que interesa es una sonda marcada, por un acoplamiento de marcaje terminal se le acopla un ligando.
Tengo la membrana que contiene miles de fragmentos. En una siguiente etapa lo que efectúo es una transferencia de la membrana a un líquido, y en ese líquido se incorpora una cantidad de la sonda radioactiva. Se deja hibridar. Allí donde la banda que me interese reflejar e encuentre con la sonda formará un complejo bicatenario estable, además ese complejo va a estar marcado radiactivamente. Pero esta radiactividad no se ve. Se necesita la estrategia final de visualización, implicar tomar la membrana y allí donde esté la sonde incorporada estas bandas van a ser radioactivas y se ve por autoradiografía. Así, obtenemos una impronta porque donde hay radiactividad hay impresión en la película radiactiva y obtenemos bandas, TEMA 3 RLFPs 4 ...