Tema 15 Proteínas tirosín-kinasa Src y Abl (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura Cáncer
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 03/05/2016
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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CÁNCER TEMA 15 Principales vías de señalización en cáncer Proteínas tirosina kinasa citoplasmáticas. Src y Abl En este tema hablaremos ya de proteínas que se encuentran en el interior de la célula, en concreto de proteínas kinasas citosólicas. El genoma humano contiene 518 genes que codifican para kinasas (aprox. 1,7% del total) de entre las cuales las tirosina kinasas constituyen el 17%.
Las proteínas con actividad tirosina kinasa se pueden dividir entre las que tienen actividad receptora (que se encuentran en la membrana) y las no receptoras, que son las citosólicas.
Las proteínas no receptoras pueden a su vez agruparse en función de su homología de secuencia.
Encontramos 4 familias: la familia JAK, la familia FAK, la familia CSK (a la que pertenece Abl) y la familia Src Todas las familias tienen en común los dominios tirosina kinasa y otros dominios que, generalmente suelen ser dominios de reconocimiento de tirosinas fosforiladas, como SH2.
De entre todas las kinasas citosólicas, destacan dos como oncogenes muy reconocidos: Src y Abl.
Src En la imagen tenemos un esquema histórico de los avances que se han producido con la proteína Src desde su descubrimiento. Src fue descubierta gracias a un virus. De hecho, fue el primer oncogen descubierto como oncogen que forma parte de un virus.
La proteína Src fue descubierta por Peyton Rous que descubrió que había un virus cuya infección acababa causando cáncer (sarcoma) a gallinas.
Rous extrajo el sarcoma de una gallina y lo rompió en pequeños trozos de tejido. Mezcló los fragmentos con arena creando un homogeneizado del tejido con pasó por un filtro (de poro muy fino). Inyectó el filtrado en otra gallina que desarrolló el mismo sarcoma que la primera.
1 CÁNCER Curso 2015/2016 El nombre que se dio al agente causativo fue Virus del Sarcoma de Rous (RSV), en honor a su descubridor.
Otros investigadores (Howard Tenin y Harry Rubin) vieron que, cogiendo el mismo stock de filtrado del homogeneizado del tumor de las gallinas podían transformar células en cultivo. Las células perdían su morfología normal para adoptar la morfología característica de las células tumorales. Las células del cultivo adquirían un fenotipo transformado: podían proliferar independientemente de sustrato, tenían pérdida de la inhibición por contacto (no dejaban de crecer cuando el cultivo se saturaba) y tenían más capacidad proliferativa en ausencia de factores de crecimiento.
Después se supo que lo que realmente contenía el homogeneizado era un virus, que transformaba las células.
El virus del sarcoma del Rous (RSV) es un retrovirus (virus RNA). Debemos comprender su estructura a nivel de genoma para saber cómo funciona. El virus tiene proteínas en la cápsida que lo ayudan a completar el ciclo (como la trancriptasa reversa) y en el interior de la cápsida tiene el material genético, que incluye los genes GAG, POL y ENV que codifican de forma secuencial todas estas proteínas.
Ciclo vital del retrovirus El virus entra dentro de la célula huésped donde, gracias a la enzima vírica transcriptasa reversa, el RNA se convierte en DNA. El DNA se integra dentro del genoma del huésped de forma estable (permanece para siempre). Las moléculas del DNA vírico se transcriben junto a las moléculas del DNA del huésped, y se sintetizan las proteínas necesarias para formar las nuevas partículas víricas.
2 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Una vez se consiguió entender el ciclo vital del retrovirus, se descubrió que los virus oncogénicos transformaban las células porque, en algún momento del ciclo el virus coge una copia mutada de uno de los genes del huésped.
Los retrovirus infectan a la célula e integran su material genético en el genoma del huésped, de manera que el DNA vírico comienza a expresarse. Lo que ocurre es que, en un momento determinado, un retrovirus que inicialmente no era oncogénico, integra su genoma al lado de un gen que, en el caso del virus del sarcoma de Rous es el gen Src. Por la forma en la que se integra, cuando se transcribe el DNA vírico, la transcripción no se detiene cuando acaba el material genético del virus si no que, por error, continúa transcribiendo. Se genera un material genético que contiene el virus y un trozo del DNA endógeno del huésped que tiene el gen Src.
A partir de aquí, se generan nuevos virus que tienen un trozo del genoma del huésped que corresponde a la tirosina kinasa Src. La siguiente célula infectada por este virus incorporará todo el genoma del retrovirus, ahora llamado virus del sarcoma de Rous, más el gen Src. Por tanto, al integrarse el genoma del virus en la nueva célula infectada, se integra una copia de Src.
Unos investigadores identificaron Src como un oncogén (cogido por el virus desde nuestro propio genoma). Ellos llevaron a cabo una serie de experimentos en los que aislaron mutantes del virus. En primer lugar, se aislaron mutantes sensibles a la temperatura: estos virus a 36oC replicaban normalmente y transformaban las células y a 41oC los virus replicaban normalmente pero no transformaban las células.
Estos virus sensibles a la temperatura además tenían una serie de mutaciones en Src que hacían que no fuera oncogénico a temperatura elevada.
La sensibilidad a la temperatura sugería que Src codifica para una proteína requerida para el mantenimiento del estado de transformación.
3 CÁNCER Curso 2015/2016 Algo más tarde, aisló otro virus defectivo para transformar células pero capaz de replicar. A este mutante le faltaba el 15% del genoma. En concreto, este mutante había perdido parte del dominio tirosina kinasa de Src.
Por tanto, se comprobó que la inactivación del Src hacía que el virus dejara de ser oncogénico pero no afectaba al ciclo vital del virus.
Mediante hibridación de ácidos nucleicos se vio que, al hacer hibridación in situ con las secuencias que causaban la oncogénesis también hibridaba con las células normales (del huésped). Esto implicaba que el oncogen tenía un homólogo en la célula.
Es así como se supo que el gen Src había pasado del genoma humano al genoma viral.
Cómo transforma Src a las células infectadas Cuando se transfecta un plásmido con Src celular y se infectan las células de un cultivo, las células no se transforman. En cambio, cuando se transfectan las células con un plásmido con la forma viral de Src, sí se produce la transformación.
Esto quiere decir que el oncogen Src no afecta por dosis, sino que afecta por mutación. Por tanto, el Src viral es una forma mutada del gen.
Función de Src SI incubamos Src con un plásmido radiactivo y un sustrato, se puede ver que Src es capaz de fosforilar al sustrato. Es así como se supo que Src tiene actividad kinasa.
4 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La actividad kinasa basal de Src es muy baja. En un cultivo de fibroblastos infectados por el virus y que tenían la copia de Src viral (además de la suya propia), se comprobó que la forma viral tenía mucha más actividad que la copia normal. Es decir, la copia mutada de Src tiene actividad constitutiva o al menos más actividad que la copia normal.
Src tiene en el extremo carboxi-terminal unos residuos que codifican para una tirosina. La forma viral es exactamente igual salvo por esta región, que no está presente en la forma mutada. Esto se debe a que, a pesar de que el virus se lleva el gen por error, no lo incorpora entero.
Teniendo en cuenta que la única diferencia a nivel estructural entre la proteína del virus y la proteína normal es esta región del C-terminal, se llegó a la conclusión de que esta región es extremadamente importante para controlar la actividad de Src.
Esta tirosina (del C-terminal) regula a la baja la actividad tirosina kinasa de Src. Es decir, se trata de una tirosina inhibitoria cuya fosforilación inhibe la actividad kinasa de la proteína.
La tirosina fosforilada es reconocida por un dominio SH2 de la propia Src, lo que conlleva la formación de un puente dentro de la propia proteína que la mantiene plegada e inactiva.
Al no haber extremo C-terminal en la forma mutada, no hay tirosina y no se forma este puente, por lo que no hay inhibición.
Hay varias proteínas encargadas de fosforilar esta tirosina y, por tanto, de regular la actividad de Src Una de estas proteínas es Csk.
A pesar de que se conocen los aspectos generales de la regulación de Src, aún no se conoce la regulación profunda ya que es una kinasa extremadamente compleja.
Uno de los modelos propuestos de regulación más aceptados dice que la tirosina C-terminal hace puentes intramoleculares cuando está fosforilada y que, cuando se desfosforila, deja de tener afinidad por SH2 y Src se abre. Además de esto, también es necesaria la fosforilación de otras tirosinas para completar la activación. La forma viral de Src no conserva la tirosina de C-terminal, pero sí la otra tirosina necesaria para que se produzca la activación, por lo tanto, Src vital no se inactiva pero sí tiene capacidad de activarse.
5 CÁNCER Curso 2015/2016 Para saber qué ocurre exactamente cuando la función normal de Src se encuentra alterada es necesario comprender cuál es la función de Src normal.
Src tiene múltiples sustratos e incluso hoy en día continúan encontrándose sustratos nuevos debido a la gran cantidad de investigación que hay en torno a Src. Los sustratos más importantes conocidos, a los que Src fosforila, son: - p120 catenina, que modula la adhesión célula-célula.
- Cortactina A, que regula la polimerización de la actina.
- FAK o Focal Adhesion Kinase, que regula la adhesión de las células al sustrato. Cuando FAK se encuentra fosforilado, las células se adhieren menos al sustrato y adquieren una mayor capacidad migratoria, asociada a la capacidad de producir metástasis. Es decir, cuando Src está sobreactivada, las células tienen mayor capacidad de migrar.
- Src también regula la angiogénesis ya que participa en la fosforilación directa o indirecta de muchas proteínas implicadas en este proceso.
- Src también interacciona de forma recíproca con receptores con actividad tirosina kinasa. Es decir, los receptores activan Src pero Src puede activar a los receptores desde el interior celular. Por tanto, Src puede activar vías reguladas por receptores tirosina kinasa como la vía JAK/STAT, Ras, … que están implicadas en supervivencia, proliferación y angiogénesis.
Terapia Se están desarrollando nuevos inhibidores de Src que están en varias fases de ensayos clínicos para diferentes tipos de tumores. Algunos de ellos ya están aprobados para el uso clínico.
Realmente se trata de fármacos cuya eficacia se ha demostrado.
6 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Podemos ver ejemplos de estos fármacos en la siguiente tabla: ABL La proteína ABL fue identificada de forma muy similar a Src. Se identificó como un gen que estaba dentro de un virus que provocaba linfosarcomas en ratones.
Era un retrovirus que había integrado la forma mutante de ABL.
Abelson fue el primero en identificar ABL como el oncogen que llevaba el virus Abelson de la leucemia, que causa leucemia de células pre-B en ratones.
El virus infecta la célula y se integra en el genoma y, de la misma forma en la que ocurría el proceso con Src y el virus del sarcoma de Rous, se lleva una copia mutada de ABL a la que falta el extremo N-terminal.
Por tanto, este virus de la leucemia de ratones (Abelson murine leukemia) acaba teniendo todo el genoma vírico más una copia mutada de ABL sin extremo Nterminal. En el caso de ABL es la región amino-terminal de la proteína la región fundamental para controlar la actividad tirosina kinasa.
7 CÁNCER Curso 2015/2016 Posteriormente se descubrió (Nowell y Hungerford) que en los casos de leucemia mieloide crónica humana el cromosoma 22 era extremadamente corto, es decir, se descubrieron alteraciones cariotípicas.
Más tarde (J. Rowley) se descubrió que lo que sucedía exactamente era que se producía una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 que generaba un cromosoma llamado cromosoma Filadelfia que se encontraba muy frecuentemente en los pacientes de leucemia mieloide crónica (la enfermedad homóloga a la leucemia de ratón causada por el virus ABL).
El breakpoint en el cromosoma 22 se produce en el locus en el que se encuentra el gen que codifica para la proteína Bcr mientras que el cromosoma 9 se rompe justo por el lugar en el que se encuentra la kinasa ABL.
En la translocación se genera un gen que da lugar a una proteína de fusión que tiene el extremo N-terminal de Bcr y el extremo C-terminal de la proteína ABL. Esta proteína de fusión dimeriza constitutivamente, por lo que tiene actividad kinasa constitutiva ya que ABL no tiene el dominio N-terminal necesario para regular su función.
Esta proteína de fusión (y por tanto, el cromosoma Filadelfia) se encuentra en el 95% de los pacientes de leucemia mieloide crónica y en 10-30% de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda.
El breakpoint puede producirse en muchos puntos diferentes, es decir, no todos los cromosomas Filadelfia que se originan son idénticos. Lo que todos tienen en común es que tienen el extremo Nterminal de Bcr y el extremo C-terminal de ABL.
Además, ABL se ha encontrado en otras translocaciones diferentes, fusionada con otras proteínas.
ABL siempre pierde el extremo N-terminal.
8 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV ABL es una proteína de regulación compleja ya que tiene una serie de tirosinas fosforilables que son importantes para regular su actividad, aunque tampoco se conoce exactamente cómo se regula.
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Como la translocación de ABL es tan frecuente en leucemias, se han desarrollado muchas técnicas diagnósticas de detección.
- Mediante hibridación in situ (FISH): se hace una sonda de un color para ABL y otra sonda diferente que hibride con Bcr. Si hay translocación habrá cromosomas en los que ABL y Bcr coexisten y se encuentran juntos (las señales de ambos colores estarán juntas).
- Mediante PCR: se diseña un primer sobre ABL y el otro primer sobre Bcr. Si hay translocación cromosómica habrá producto de PCR (amplificación).
Función de ABL Es una kinasa citosólicas de la que se han descrito muchos sustratos que regulan diversos procesos. Entre ellos, ABL está implicada en migración celular ya que fosforila proteínas del citoesqueleto.
También participa en el turnover de células madre, está implicada en el aumento de la proliferación y la diferenciación y en la disminución de la apoptosis.
9 CÁNCER Curso 2015/2016 Los sustratos de ABL explican por qué es oncogénico.
Agentes quimioterápicos Uno de los primeros quimioterápicos que se desarrolló fue un inhibidor competitivo contra la proteína de fusión Bcr-ABL. En concreto, se unía al lugar de unión al ATP, bloqueando su unión. Sin ATP, ABL no podía llevar a cabo su actividad kinasa.
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