TEMA 5 – PCR CONVENCIONAL (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 7
Fecha de subida 01/04/2016
Descargas 6

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera TEMA 5 – PCR CONVENCIONAL La reacció en cadena de la polimerasa o PCR és una manera de clonar DNA: 1. Thermostable DNA polymerase 2. Sequence information enabling synthesis of specific oligonucleotide primers Consisteix en l’amplificació selectiva de seqüències de DNA realitzada en un sistema in vitro lliure de cèl·lules. Permet l’obtenció d’un elevat nombre de còpies d’una seqüència de DNA a partir de petites mostres i en mal estat de conservació. Quan va sortir, va ser una revolució per la genètica forense.
Inhibidors de la PCR: moltes vegades les mostres a analitzar contenen inhibidors de la PCR (SDS, àcid húmic,...) o alguns compostos que poden interferir negativament en la reacció. Pot ser aconsellable diluir la mostra per tal de diluir aquests compostos.
A al pròpia mostra hi ha presents d’inhibidors de la PCR. Llavors, el millor que podem fer es diluir: en concentracions mes baixes obtindrem millors resultats. Com més estigui diluïda la mostra, obtenim un millor resultat. El problema ve quan hi ha un excés de quantitat de inhibidors.
Components bàsics de la reacció de PCR Què necessitem? DNA motlle, polimerasa de DNA, encebadors, dNTPs i tampó de reacció o buffer.
Polimerasa de DNA Hi ha moltes polimerases de DNA diferents.
- Klenow (1983): poc eficaç i específica; 37ºC Taq (1988): polimerasa de Thermus aquaticus; polimerasa termostable.
Es va començar amb la Klenow però comporta un problema, es desnaturalitza molt fàcilment i a més, a cada cicle en teníem que ficar de nou. Es treballava a 37ºC i labors la temperatura d’annealing era baixa.
Es va solucionar quan es va afegir la Taq polimerasa, ja que aquesta podia treballar a unes altes temperatures d’hibridació i d’annealing. Però, que sigui termostable no significa que no li faci res la temperatura: si la tenim 40 minuts a 95ºC la desnaturalitzem totalment però, com anem pujant i baixant la temperatura, no es així, encara que al llarg del temps, l’activitat de la polimerasa va baixant igualment.
Actualment venen Taqs modificades químicament que es van activant a mesura que es va arribant a 95ºC. Així al llarg de tot el procés ha la mateixa quantitat de Taq polimerasa activa.
La Tth polimerasa presenta activitat retrotranscriptàsica. Actua com a polimerasa DNA i RNA depenent i pot retrotranscriure el RNA motlle. Per tant, pot sintetitzar DNA a partir d’RNA o de DNA motlle.
Long Range PCR El límit es troba entre 3-4kb per treballar sense problemes. A partir d’aquest punt tindrem dificultats per amplificar correctament. Podem comprar en el mercat polimerases que ens permeten amplificar seqüències molt més llargues, de fins a 40kb. Però aquestes no són polimerases, sinó que són mescles de polimerases: la Taq mesclada amb un enzim o polimerasa de correcció de prova. Quan la polimerasa es dissocia per un error, l’enzim de correcció de prova ho corregeix, ja no hi ha l’error al extrem 3’ i per tant, es pot ficar a treballar una altra vegada la polimerasa i seguir sintetitzant DNA.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Per tant, el procés és aquest: - - Quan la Taq incorpora un nucleòtid erroni es dissocia del motlle de DNA i no pot continuar l’extensió.
La polimerasa amb correcció pot corregir l’error i continuar la síntesi.
Quan es dissocia del motlle de DNA pot continuar la Taq l’extensió de la nova molècula de DNA.
Magnesi i buffer - El Mg2+ és necessari per l’activitat de la Taq polimerasa (precisa una concentració mínima de Mg2+ lliure de al menys 1,2 – 1,3mM) Un defecte de Mg2+ disminueix l’eficàcia de l’amplificació mentre que un excés pot produir-ne inespecificitat Els dNTP competeixen pel Mg2+ en quantitat equimolar.
Si comprem el buffer en una casa comercial, tot ve optimitzat. Sols haurem de modificar la concentració de Mg2+, ja que aquesta depèn de cada reacció i la casa comercial no el pot optimitzar. El Mg2+ és essencial per la Taq polimerasa, i normalment es 1,2 – 1,3mM lliure. El Mg2+ és un catió divalent, que s’unirà a tots els ions que trobi. Llavors, els dNTPs o el DNA segrestaran el magnesi lliure que hi hagi. Llavors, hi ha que ajustar el Mg2+ perquè la Taq pugui funcionar de forma òptima.
Si hi ha poc Mg2+, la Taq no actua de manera eficaç i l’amplificació serà deficient. Però, si ens passem, com estabilitza molt, es formarà quasi qualsevol unió inespecífica dels encebadors amb el motlle (augmenta la estabilitat, la unió) i per tant, tindrem varies amplificacions inespecífiques. Com es divalent, estabilitza molt mes que els ions monovalents, com el K+ o el Na+.
Les cases comercial de vegades fiquen glicerol i altres components en el buffer. Aquests poden funcionar per estabilitzar la Taq i per solucionar altres problemes que ens podem trobar en la PCR.
- El glicerol redueix les estructures secundàries que es formen en les regions riques en GC.
Dimetil sulfòxid (DMSO): redueix la incidència de depurinacions i redueix les estructures secundàries.
Encebadors o primers Els encebadors permeten definir els límits (extrems 5’ de cada un d’ells) de la seqüència específica del DNA motlle a amplificar.
Si no hi ha encebadors, no podrem amplificar res. Són necessaris perquè l’enzim trobi un extrem 3’OH que estigui estable en el DNA motlle. L’encebador el delimita l’amplicó, l’extrem 5’P dels amplicons, de cada cadena. Cadascun d’ells han d’hibridar en Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera una cadena complementaria i també en sentit contrari. Sempre formen part de l’amplicó. Tot el producte que amplifiquem, en l’extrem 5’P estaran els encebadors.
Per tant, si marquem els encebadors, marcarem el producte que amplifiquem. A més, si marquem els dos encebadors de manera diferent, marcarem de forma diferent cada cadena. Després podem modificar els producte de amplificació en funció del que ens interessi.
A mes, després apareixen unes bandes petitetes, d’unes 50pb, dímers d’encebadors, els quals poden hibridar entre sí i per tant donarien lloc a un producte que no ens interessa però, que també està marcat, ja que els encebadors poden ser complementaris en els seus extrems 3’OH. A més dímers hi hagi en la PCR, l’eficàcia serà menor perquè es destinen més productes a amplificar els encebadors.
Es poden formar dímers entre l’encebador 1 i el 2, o d’un encebador amb un mateix. Quan fem una PCR múltiple amb més de 2 encebadors, mes d’un parell d’aquests, hi ha que evitar que es formen els dímers, però hi ha que evitar que es formin dímers d’un encebador amb ell mateix i amb cap dels altres. Llavors, cada parell hi ha que fer-los de diferents grandàries perquè així en la electroforesi distingim de quin parell d’encebadors, de quin amplicó, estem parlant. A més encebadors, més difícil serà el disseny.
Molècules de DNA en una PCR En l’eppendorf tenim unes molècules de DNA motlle que volem analitzar. A cada cicle la quantitat d’aquest DNA es manté constant, no es modifica. El DNA motlle et permet sintetitzar altres cadenes de DNA de llargada variable, el qual anirà augmentant de forma lineal al llar dels cicles. Aquest serveix de motlle de mida definida per a l’amplicó i el producte específic creixerà de manera exponencial. Per tant, tenim tres “tipus” de molècules de DNA: - DNA motlle inicial, en quantitat constant.
DNA de mida variable que es genera a cada cicle i va augmentant de forma lineal a cada cicle.
DNA de mida especifica que augmenta de manera exponencial.
Al final tenim m*2n molècules de DNA. Llavors, veiem un creixement exponencial de DNA, que ve determinat de DNA inicial. La PCR te una eficàcia, que no es sempre del 100%.
𝑸 = 𝒎(𝟏 + 𝑬)𝒏 - - Q: quantitat de DNA que tenim m: DNA inicial E: eficàcia. Si fos 1, al final tindríem m*2n, però no es així mai. Entre 80-90% ja es una eficàcia bona. A més, els amplicons petits s’amplifiquen de manera molt mes eficaç que els grans, i segresten els components. Llavors, en una PCR múltiple, els amplicons petits surten mes intensos que els més grans.
n: nombre de cicles.
Però, com podem suposar, el creixement exponencial no dura per sempre. Només hi ha un nombre de cicles on hi ha creixement exponencial, després arriba a un màxim i ja no hi ha amplificació. Açò és degut a que els recursos són limitats. En fiquem de sobra, però a cada cicle es van gastant i cada vegada en queden menys: queden menys encebadors lliures i dNTPs, la Taq es va desnaturalitzant al llarg del temps... Llavors, es van produint desequilibris en la reacció i arriba a un moment on ja no hi ha amplificació. No dura més de 35-40 cicles.
Al final, l’últim pas seria deixar-ho a uns 4ºC per conservar-lo be quan s’acabi la reacció.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Inespecifitats Els encebadors que dissenyem, poden trobar certa complementarietat en altres regions del genoma, sobretot si són genomes grans. Però, en aquest cas sí que la Tm serà menor, encara que igualment podríem amplificar regions inespecífiques. La Taq sol tenir el seu òptim als 72ºC però a temperatures properes també està activa. Llavors, també es fàcil, sobretot a la fase inicial, sobretot quan es desnaturalitzava tot el producte que estava a l’eppendorf, i quan va pujant la temperatura, que la Taq podria sintetitzar inespecificitats.
Mètodes per evitar les inespecificitats degudes als primers cicles: 1. Touch-down PCR: reduir progressivament al llarg dels cicles la temperatura d’hibridació.
2. Hot-start PCR: mesclar, introduir o activar la polimerasa de DNA en el moment de la primera desnaturalització.
3. Nested PCR: realitzar una segona reacció de PCR amb encebadors interns del fragment amplificat en la primera PCR.
Touch-down PCR Si sintetitzem seqüències inespecífiques, hi haurà en l’extrem un encebador. I quan fem la copia, copiarem la seqüència complementaria de l’encebador. Llavors, podrem amplificar sense problemes i les inespecificitats aniran augmentant.
Aquest tipus de PCR intenta que no es generen aquestes inespecificitats: s’utilitza una major severitat, elevades temperatures. Primer, els encebadors no hibriden per la elevada severitat, però anem baixant un-dos graus cada cicle fins que els encebadors hibriden sols específicament. Llavors, no hi haurà inespecificitats i conservarem només el producte. Per tant, cada cicle anem baixant 1-2 graus la temperatura d’annealing. Exemple: si la temperatura òptima és 58ºC, comencem per 65ºC i anem baixant poc a poc.
Hot-start PCR És la tècnica més freqüent per evitar inespecificitats. Les cases comercials et venen les polimerases (Taq hot-start) preparades per açò, encara que són un poc més cares que les normals. Al principi estem a temperatura ambient. Fiquem els eppendorfs al termocicladors, pugem a 95ºC i la polimerasa mentre pot anar sintetitzant DNA a partir d’encebadors que han anat hibridant específicament. Però, la qüestió és que la polimerasa no estigui activa fins els 95ºC. Llavors, si comencem la PCR en calent, ens estalviarem les possibles inespecificitats.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Es pot fer de diferents formes: - - Manual: algun dels components que no s’introdueix del principi, com el magnesi, s'afegeix quan la temperatura ja és superior a 70ºC. Llavors, quan el termociclador arriba a 70-80ºC, parem, obrim els eppendorfs, fiquem la Taq i tanquem. Però no es recomanable, ja què l’aigua s’evapora.
Separació física amb boletes de cera: els components de la reacció es divideixen en dues mescles separades per una barrera, com la cera. Fiquem a l’eppendorf diferents components, afegim la boleta de cera, es puja la temperatura i es fon la cera. Llavors, tenim els components alliberats (alguns dels que estaven a la boleta).
Ara fiquem la Taq, i tornem a tancar. La cera es perquè no s’evapori l’aigua; així no es barreja la Taq amb els altres components, encara que al següent cicle ja es barreja tot. Les inespecificitats dependran del disseny de la PCR.
Polimerases amb anticossos que bloquegen el centre actiu: la polimerasa de DNA s’afegeix unida a anticossos inactivants termosensibles. Però l’anticòs es termolàbil, i quan puja la temperatura, s’allibera.
Polimerases químicament modificades: la polimerasa de DNA s’afegeix unida a un grup químic bloquejant termosensible. Són polimerases que es van activant a mesura que es va pujant la temperatura. Llavors, sempre es va mantenint la mateixa quantitat de Taq activa.
La hot-start PCR ens servirà per quan tinguem petites quantitats de DNA i així ens assegurem un bon resultat.
Nested PCR Es pot emprar per varies coses. Pot ser que no tinguem amplificació o que hagi sigut una amplificació molt dèbil perquè partim de molt poques molècules de DNA inicial.
O sigui que, després de 40 cicles i de ficar la polimerasa i tot, no ha sortit una caca. Si tornem a fer una segona PCR, sé que haurem amplificat una mica però, també apareixeran altres seqüències per les inespecificitats. A més de tenir més còpies inicials de l’amplicó que ens interessa, també tenim més seqüències inespecífiques per amplificar; ho amplifiquem tot.
Llavors, en la Nested, fem una nova reacció d’amplificació però, amb uns nous encebadors que reconeixen perfectament l’amplicó que ens interessa; llavors, sols amplificarem aquest. La quantitat de inespecificitats serà molt menor que si amplifiquéssim com hem dit abans. Els segons encebadors podran crear inespecificitats en el genoma del que partíem, però no en el que ja havíem amplificat; llavors, no en veurem. Per tant, el que farem serà augmentar la quantitat de DNA amplificat i reduir el nombre d’inespecificitats.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Deurem dissenyar 3 o 4 encebadors: - Niuada: dos externs per la primera tanda i dos interns per la segona: es una PCR dins de una PCR anterior.
Seminiuada: simplement introduïm un nou encebador: enlloc de dissenyar 4, en dissenyem 3, ens estalviem 1. En aquest cas seria un intern però, sols per un costat de l’amplicó.
PCR a partir de petites quantitats de DNA: és millor partir de poc DNA però que sigui únic.
- DNA d’una o poques cèl·lules: DGP o DP no invasiu Poques molècules de DNA dintre d’una població major: infeccions, cèl·lules canceroses o transplantament de moll d’os.
Exemple: si treballem amb un transplantament de moll d’os, treballarem amb molta barreja de DNA, i el que no volem competirà pels nostres encebadors. Llavors, farem un Hot-Start que ens ho solucionarà.
Anàlisi dels RNA per PCR - La PCR precisa d’un motlle de DNA Se pot obtenir DNA còpia d’RNA per poder-lo utilitzar com a motlle inicial de la PCR El cDNA s'obté per retrotranscripció (RT) És una tècnica ràpida i sensible que permet d’analitzar l’RNA de petites mostres biològiques.
La Taq o la polimerasa que utilitzem són DNA dependents, no podem amplificar directament RNA però, si que pot generar copies de DNA a partir de cDNA que obtenim per retrotranscripció a partir d’RNA. Llavors, a partir d’aquest cDNA s’amplificarà el RNA: serà una RT-PCR.
A partir de la mostra aïllem el RNA, fem la retrotranscripció, i fem la PCR sobre aquest cDNA. La retrotranscripció la podem fer prèvia a la PCR o si no, usarem la Tth de Thermus thermofilus, la qual a més té activitat retrotranscriptasa.
En el buffer la vindrà el manganès per fer la retrotranscripció. La bo d’açò és que ho fem tot en el mateix eppendorf i en un sol.
Retrotranscriptases i polimerases que podem utilitzar: - M-MLV: Retrotranscriptasa del Virus de la Leucèmia Murina AMV: Retrotranscriptasa del Virus de la Mieloblastosi Aviar Tth: DNA Polimerasa de Thermus thermofilus. L'enzim replica el DNA a 74°C i té una vida mitjana de 20 minuts a 95°C. L’activitat polimeràsica de DNA depenent de DNA de Tth precisa magnesi i la depenent d’RNA de manganès.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Es poden usar diferents encebadors: - Hexàmers generats aleatòriament: els utilitzarem si volem amplificar qualsevol RNA.
Oligo-dT: només es formarien còpies dels mRNAs amb cua poliA.
Encebadors específics: si sols volem un missatger específic.
Ja en el primer cicle tenim cDNA que servirà de motlle pel segon encebador i ja podrem amplificar.
...