Tema 5 Purificación de proteínas (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 17
Fecha de subida 08/04/2016
Descargas 4
Subido por

Vista previa del texto

2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 5 Purificación de proteínas Cuando realizamos una extracción de todas las proteínas de una muestra biológica, obtenemos una gran cantidad de proteínas diferentes. Purificar una proteína consiste en conseguir, a partir de la mezcla compleja resultante de la extracción proteica, aislar una de estas proteínas.
En la imagen tenemos el resultado de una separación de proteínas en un gel de electroforesis. En el carril 1 tenemos un patrón smear que se corresponde con una muestra biológica, es decir, contamos con un extracto de proteínas que contiene muchas proteínas diferentes. A partir de ésta, se han ido haciendo preparaciones en las que se ha aumentado el grado de purificación hasta obtener una única proteína (carril 4).
La purificación de proteínas tiene muchas aplicaciones. Podemos, por ejemplo, aislar una única proteína con fines terapéuticos, como la insulina. También se purifican proteínas para estudios funcionales, para estudios estructurales, … Como se muestra en la siguiente tabla, en función de para qué necesitemos la proteína pura, necesitaremos mayor o menor cantidad y mayor o menor grado de pureza.
Por ejemplo, si aislamos una proteína con fines terapéuticos, necesitamos un elevado grado de pureza, ya que no nos interesa inyectar en un paciente sustancias que puedan resultar tóxicas. Además, necesitaremos grandes cantidades (se administran varias dosis además de necesitar para muchas personas).
A la hora de realizar estudios estructurales, la cristalización de la proteína será mejor cuanto más pura sea la proteína.
Si, por ejemplo, queremos obtener anticuerpos contra la proteína, no hace falta tener tanta pureza. El procedimiento consiste en inyectar la proteína en un animal y esperar a que éste produzca anticuerpos contra la proteína. Lo peor que puede pasar si la proteína no es lo suficientemente pura es ésta resulte tóxica para él y provoque su muerte. A pesar de que la muerte del animal supone un gran contratiempo, no es tan grave como lanzar al mercado un producto terapéutico tóxico. Si la proteína no es demasiado 1 Purificación de proteínas pura también puede ocurrir que el animal produzca anticuerpos contra dos proteínas en lugar de contra una sola, pero esto no nos supone un problema (el anticuerpo contra la proteína deseada se ha obtenido de todas formas).
Otro aspecto a tener en cuenta, aparte del grado de pureza y la cantidad, es si el proceso de purificación nos permite mantener la estabilidad, la funcionalidad y las tener modificaciones post- traduccionales correctas de la proteína. También es importante que la proteína purificada sea soluble, ya que, en caso de no serlo, formará agregados proteicos.
Como las proteínas son químicamente son muy diferentes entre sí, y tienen estabilidad y condiciones muy diferentes, no todos los procesos de purificación van bien para todas las proteínas. Algunas proteínas son fáciles de purificar, mientras que en otras, este proceso resulta altamente complicado.
TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Podemos purificar la proteína de su propia forma endógena o expresarla de forma exógena, mediante técnicas de biología molecular, en un sistema biológico diferente del que procede. La expresión en otros sistemas es el método que más se utiliza.
un reducido número de casos, interesa purificar la proteína de forma endógena. Se trata de casos muy concretos en los que interese estudiar alguna cuestión funcional (como cambios post-traduccionales).
Sistemas de expresión En la siguiente tabla aparecen los diferentes sistemas de expresión, ordenados en función de su grado de complejidad (de más sencillo a más complejo): Aparte de los sistemas mostrados en la tabla, actualmente también se emplean las plantas.
Bacterias La bacteria más utilizada normalmente para expresar proteínas heterólogamente es la Escherichia Coli.
El gen de interés se clona en un plásmido bajo el control de un promotor que permita sobreexpresar el gen. Se acostumbra a emplear promotores regulables, como el promotor T 7, inducible por el compuesto IPTG. Este promotor permite aumentar la expresión en un momento determinado. Cuando queramos expresión del gen, basta con añadir al medio IPTG.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Normalmente, antes de añadir el inductor se hace crecer la población bacteriana hasta una densidad óptica determinada, ya que la sobreexpresión de la proteína suele resultar algo tóxica para la bacteria e inhibe el crecimiento. Si añadiéramos el inductor antes de obtener un crecimiento mínimo no obtendríamos suficiente cantidad de proteína.
Aparte del tipo de promotor, los vectores también se pueden diferenciar en el tipo de etiqueta (tag). Para purificar la proteína podemos basarnos en un sistema cromatográfico o emplear la cromatografía de alta afinidad (es más rápido) contra alguna etiqueta que hayamos añadido a la proteína de interés. Cuando construimos el plásmido con el gen de interés, incluimos al final de éste una secuencia que codifique para la etiqueta: aminoácidos que puedan ser reconocidos por algún anticuerpo o por alguna columna de afinidad.
Etiquetas que se usan frecuentemente son, por ejemplo: - Cola de histidinas, que permite purificar con una columna de afinidad.
- Secuencia HA, muy inmunógena. Permite usar un anticuerpo.
- Calmoduline binding peptide (CBP) - se une a la calmoudulina.
- GFP -green fluorescent protein - la proteína expresada será verde.
-… Cada etiqueta tiene más utilidad en algunos procedimientos que en otros. Para la purificación de proteínas normalmente se añaden etiquetas que faciliten la purificación en base a la afinidad.
Por tanto, encontramos una gran variedad dentro de los plásmidos pET, que pueden diferenciarse en la etiqueta y en el promotor.
La sobreexpresión de proteína genera problemas en la bacteria. Aparte de un crecimiento más lento, el mayor problema es que las proteínas acaban formando cuerpos de inclusión, que son agregados de proteínas. Cuando se encuentra formando cuerpos de inclusión, la proteína es insoluble (al centrifugar queda en el pellet), lo que puede suponer un problema según para qué queramos la proteína. Para evitar este problema, habrá que intentar evitar que no se formen los agregados o bien tratar de solubilizar la proteína una vez se han formado.
Células de mamífero En la mayoría de los casos en los que la proteína es purificada para interés terapéutico, la proteína se expresa en células humanas. La expresión en células de mamífero permite obtener modificaciones post- traduccionales lo más parecidas posible a las que sufre la proteína dentro del organismo (sobre todo si se emplean células humanas). Mediante el uso de este sistema de expresión se intenta reproducir la proteína endógena lo más fielmente posible.
Es frecuente usar la línea CHO (Chinese hamster ovary) que puede crecer en solución. Se emplean células que puedan crecer en suspensión ya que tienen mucho más rendimiento a la hora de obtener 3 Purificación de proteínas proteínas que las células que crecen en monocapa (con las células que crecen en monocapa se obtiene un número de células mucho menor).
Las células de mamífero son mucho más difíciles de hacer crecer que las bacterias, ya que, mientras en las bacterias solo hay que controlar la temperatura, en células animales hay que vigilar la temperatura, los niveles de oxígeno y dióxido de carbono, … Por esto resultan más caras de cultivar y mantener.
Cuando se purifican proteínas en células animales a escala industrial, normalmente se trabaja con biorreactores.
En la siguiente imagen se muestra la electroforesis de la eritropoyetina (EPO) que se ha obtenido de células transfectadas con el plásmido EPO (PEPO+). Presentan un patrón smear, que se debe probablemente a que la proteína está glicosilada (las proteínas con modificaciones post-traduccionales no corren tan bien en el gel).
Plantas transgénicas Se trata de una alternativa al uso de células animales que comienza a utilizarse actualmente.
Encontramos dos formas de obtener las proteínas: - Podemos sobreproducir la proteína en alguna parte de la planta y realizar un extracto de la planta para obtener un preparado enriquecido en la proteína que pueda usarse para aplicación terapéutica. Es decir, no es necesario purificar la proteína. Como ejemplo tenemos la producción de Ig en maíz para usarlas como método contraceptivo (atacan al esperma).
- Se sobreproduce la proteína en una planta y después se purifica.
La principal ventaja del uso de plantas respecto al uso de células de mamíferos es que resulta mucho más fácil y barato mantener las plantas que los cultivos de células animales.
El principal incoveniente es que, a pesar de que las plantas se parecen más a nosotros que las bacterias, las modificaciones post-traduccionales siguen sin ser las mismas.
Sistemas libres de células (cell free) Las proteínas se producen sin necesidad de un cultivo celular. Se utiliza un plásmido como molde que contenga el gen que codifique para la proteína de interés y se pone en contacto con todos los sustratos necesarios para hacer proteínas (nucleótidos para sintetizar el mRNA, aminoácidos, …) y con la maquinaria biosintética (RNApolimerasa, ribosoma).
La única forma de obtener la maquinaria biosintética es añadiendo extracto de bacteria, por lo que no obtenemos la proteína pura directamente.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El resultado es una gran cantidad de células del extracto y una cantidad muy abundante de proteína (más que con otros métodos).
Representa una ventaja respecto a la producción en bacterias ya que evita realizar la transformación con el plásmido. Por esto, es útil para expresar distintos mutantes - resulta mucho más rápido.
No es un método excesivamente utilizado.
Otra ventaja que supone este sistema es que permite expresar proteínas tóxicas que no pueden ser expresadas en ningún organismo vivo.
Este método permite la utilización de aminoácidos no naturales.
Volviendo al cuadro de ventajas de cada uno de los métodos podemos decir que: - La principal ventaja de emplear bacterias es que nos permite obtener gran cantidad de proteína y resulta barato (en comparación con el resto de métodos). Por tanto, si las proteína que queremos purificar nos lo permite (y podemos obtener un resultado óptimo), lo mejor será utilizar bacterias.
- La ventaja que presentan las células de mamífero es que con ellas se obtiene el máximo nivel de modificaciones post-traduccionales correctas y la máxima probabilidad de obtener una proteína funcional.
- La ventaja del uso de plantas transgénicas es que resultan más fáciles y baratas de mantener que las células animales y son las más próximas a estas que podemos encontrar.
- La ventaja de los sistemas libres de células es que nos evitamos llevar a cabo el proceso de transformación con un plásmido, por lo que, resulta mucho más rápido que las bacterias en caso de expresión de varios mutantes diferentes. Además permite la utilización de aminoácidos no naturales y la expresión de proteínas tóxicas.
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS CELULARES Una vez se ha producido la proteína (mediante el sistema que sea), el siguiente paso es la obtención del extracto celular. El objetivo es extraer lo máximo posible y conseguir la proteína en forma soluble.
No existe un sistema que funcione para todas las proteínas; por ejemplo, las proteínas de membrana son más difíciles de obtener en forma soluble y por tanto, más difíciles de purificar.
5 Purificación de proteínas Existen varios métodos para llevar a cabo la extracción: - Métodos mecánicos El método empleado dependerá del sistema de expresión. Si expresamos la proteína en levaduras, tendremos que romper la pared, que es muy dura. Para ello podemos usar bolas de vidrio - se añaden sobre las levaduras y se agita para romper la pared celular. Las bolas de vidrio también pueden aplicarse a tejidos.
Otro método mecánico es la sonicación, que consiste en emplear ultrasonidos para romper la membrana celular.
Para plantas es habitual la congelación y después, machacar con el mortero.
Otra método mecánico que puede emplearse es la prensa francesa, que somete a las células a una alta presión.
- Detergentes Los detergentes solubilizan la membrana plasmática, contribuyendo a la liberación de proteínas. En bacterias y células de mamíferos suele ser suficiente con la aplicación de detergentes para lisas las células, es decir, no es necesario realizar un método mecánico (son muy agresivos).
- Enzimas Es común el empleo de la lisozima para bacterias, que debilita la envoltura, contribuyendo a su disolución. También hay otras enzimas que pueden aplicarse en el resto de métodos (no solo se usan para bacterias).
Para conseguir solubilizar y estabilizar las proteínas también se han desarrollado varios métodos: - Surfactantes - encontramos dos tipos: detergentes y surfactantes peptídicos.
Se trata de sustancias que reducen la tensión superficial. Tienen una parte hidrofílica y una parte hidrofóbica; esta composición les permite evitar que las partes hidrofóbicas de las proteínas interaccionen y formen agregados (lo que las hace ser menos solubles). Por tanto, los surfactantes facilitan la solubilización de proteínas - resultan especialmente importantes a la hora de solubilizar proteínas de membrana, que son muy insolubles.
- Inhibidores de proteasas Las células de los diferentes sistemas biológicos están llenas de proteasas que, cuando la célula está intacta, se encuentran reguladas y participan en el recambio proteico. Cuando se rompe la célula, las proteasas pierden esta regulación y comienzan a degradar las proteínas, por lo que es necesario añadir inhibidores de estas enzimas.
- Reductores de puentes disulfuro El interior de la célula metabólicamente activa es muy reductor y contiene antioxidantes como el glutatión, que ayuda a mantener reducidos muchos grupos tiol de las proteínas. Al romper la célula, deja de ser metabólicamente activa y cada vez aparecen más cisteínas oxidadas (debido también al ambiente reductor del exterior celular). Las cisteínas oxidadas forman puentes disulfuro que pueden desencadenar en la formación de agregados proteicos. Para evitar la formación de agregados, se añaden reductores de puentes disulfuro; el problema es que, si añadimos muchos, podemos deshacer la estructura terciaria de la proteína.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV De todos los métodos de solubilizar las proteínas, nos vamos a centrar en los detergentes. Como ya se ha dicho, en principio se caracterizan por ser lípidos con una parte polar y otra apolar. La parte polar puede tener carga +, tener carga -, no tener carga o tener cargas + y - compensadas, por lo que, es en función de la parte polar como se clasifican los detergentes. Encontramos los siguientes tipos: - Aniónicos - son aquellos detergentes cuya parte polar tiene carga neta negativa. Por ejemplo, el SDS (Sodium dodecyl sulfate) que se emplea para Western Blot o electroforesis desnaturalizante.
- Catiónicos - detergentes cuya parte polar tiene carga positiva.
- Zwiteriónicos - son aquellos detergentes cuyas cargas de la parte polar se encuentran compensadas (por lo que la carga neta de la parte polar resulta ser 0).
- No iónicos - la parte polar no tiene carga.
En algún contexto podemos encontrar que los detergentes catiónicos y aniónicos se agrupan en detergentes iónicos y también que, los detergentes que aquí hemos clasificado como Zwiteriónicos se incluyen dentro de los no iónicos.
No todos los detergentes solubilizan de la misma forma ni son igual de eficientes.
Los detergentes con carga acostumbran a interferir en interacciones hidrofóbicas y en interacciones polares. Son, por ejemplo, capaces de unirse a regiones hidrofóbicas de las proteínas y cortar interacciones con la membrana. Aparte de poder romper las interacciones hidrofóbicas, también pueden romper las interacciones polares, como interacciones proteína-proteína. Como rompen las interacciones polares, pueden llegar incluso a desnaturalizar proteínas.
Por tanto, los detergentes con carga tienen mayor efecto solubilizador.
Por otro lado tenemos los detergentes no-iónicos. Como no tienen carga, solamente pueden interferir en interacciones hidrofóbicas, por lo que son capaces de solubilizar proteínas de membrana pero, no acostumbran por ejemplo a desnaturalizar proteínas.
Los detergentes zwiteriónicos se encuentran en una situación intermedia ya que, aunque su carga neta es 0, esto se debe a que tienen cargas a lo largo de su parte polar que se encuentran compensadas (no a la ausencia de carga).
En la siguiente imagen podemos ver ejemplos de diferentes detergentes no iónicos, que presentan una gran variedad. No todos los detergentes no iónicos tendrán las mismas propiedades por lo que, según qué queramos purificar, emplearemos uno u otro. En cada detergente podemos distinguir la cabeza polar y la cola apolar. Por ejemplo, el DDM (dodecil maltósido) tiene una cola apolar de unos 12 C y una cabeza polar que consiste en un disacárido.
Como podemos observar, encontramos diferentes estructuras, que se diferencian en el tamaño de la cabeza polar y la longitud de la cola apolar. Aquellos detergentes cuya cabeza polar sea más grande serán menos hidrofóbicos (o menos apolares) y, por el contrario, los que tengan más grande la cola apolar serán más hidrofóbicos. Debido a esto, podemos encontrar que, por ejemplo la digitonina no 7 Purificación de proteínas puede cortar las interacciones entre los complejos de la cadena de transporte de electrones mientras que el DDM, sí.
También variarán los efectos en función de la concentración de detergente que usemos.
Una propiedad relativamente medible o fácil de conocer de los detergentes es su grado de hidrofobicidad. Podemos concocer el grado de hidrofobicidad del detergente conociendo la concentración micelar crítica (CMC) - cuanto menor sea la CMC, más hidrofóbico es el detergente.
Por ejemplo, DM y DDM son dos detergentes prácticamente iguales que solo se diferencian en el número de carbonos de la cola apolar, 10 y 12 respectivamente. Como el DDM tiene la cola apolar más larga, se trata de un detergente más hidrofóbico, por lo que su CMC es menor.
El hecho de que los detergentes presenten propiedades diferentes hace que se empleen distintos detergentes para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, para hacer Western Blot suele usarse Tween 20, mientras que DDM y digitonina acostumbran a utilizarse para aislar proteínas de membrana.
Como ya hemos dicho, los detergentes son lípidos que tienen una parte polar y otra apolar. Gracias a su composición, en solución podrán encontrarse en forma monomérica pero tenderán a formar micelas. El parámetro CMC es en realidad la concentración máxima de monómero que podemos encontrar en solución. Cuanto más hidrófobo sea el detergente, antes, en términos de concentración, comenzará a formar micelas (la CMC será más baja).
En la siguiente gráfica se representa las concentraciones de la fracción monomérica y de la fracción micelar en función de la concentración total del SDS, un detergente aniónico. Como podemos observar, la concentración monomérica crece hasta que llega un punto en que el detergente ya no es soluble y comienza a formar micelas (la concentración de la fracción monomérica va descendiendo conforme aumenta la concentración de la facción micelar).
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Si trabajamos bajo la CMC, encontraremos al detergente mayoritariamente en forma de monómeros.
Cuanto más aumentemos la concentración de detergente, habrá menos monómeros y más micelas.
Si nos interesa eliminar el detergente de la solución, se hace una diálisis que separa en función del tamaño. En el caso de dializar para separar el detergente hay que tener en cuenta el fenómeno de la formación de micelas: si nos encontramos por encima de la CMC la mayoría del detergente estará en forma micelar, que cuesta más dializar.
Otro parámetro destacable de los detergentes es el punto nuboso (cloud point). Al calentar determinados detergentes, éstos se separarán en dos fases, una rica y una pobre en detergente. La separación en dos fases hace que la solución de detergente se vuelva turbia. La temperatura a partir de la cual se produce este fenómeno (a partir de la cual se enturbia la solución) es el punto nuboso. Es relevante a la hora de trabajar con detergentes.
Los detergentes funcionan de la siguiente manera: a la hora de solubilizar proteínas de membrana, los detergentes tienen regiones hidrofóbicas que interaccionan con los lípidos de membrana. La idea es que el detergente sustituya a los lípidos de membrana - las cabezas polares interaccionan con las partes polares de la proteína y las partes apolares interaccionan con las partes apolares al igual que lo hacen los lípidos de la membrana.
Hay que valorar el ratio de cantidad de detergente necesario respecto a la cantidad de lípidos de membrana. Si este en inferior a uno, la proteína no se acaba de solubilizar, ya que generalmente la membrana mantiene bastante su estructura ante esta concentración de detergente. Se ha establecido que la proteína se empieza a solubilizar bien a partir del ratio detergente/lípidos de membrana de 2:1 se continúan viendo estructuras en las que aún no se ha eliminado todo el lípido de membrana como la que se muestra en la imagen.
Empíricamente se ha comprobado que para llegar a solubilizar toda la proteína hay que trabajar alrededor del ratio de 10:1, es decir, es necesario cierto exceso de detergente para sustituir todos los lípidos de membrana.
Aparte de los detergentes, dentro de los surfactantes podemos encontrar los péptidos surfactantes. El uso de estos surfactantes no es rutina en los laboratorios, sino que más bien son estrategias que se están probando como alternativa a los detergentes.
Uno de los primeros péptidos que ha sido construido fue el peptitergent. Éste toma la conformación de hélice α y está diseñado para que, a un lado de la hélice queden los residuos polares y al otro lado queden los apolares (como puede verse en la imagen).
No es complicado deducir cómo deben ponerse los distintos aminoácidos para que la hélice adquiera esta conformación, ya que el número de aminoácidos por vuelta es conocido.
La idea es que el péptido se enganche a la proteína de membrana por el lado hidrofóbico quedando la parte hidrofílica hacia fuera, solubilizando la proteína.
9 Purificación de proteínas Sobre esta misma idea se ha continuado investigando para lograr un péptido más barato y/o que funcione mejor.
Por ejemplo, se desarrolló un péptido al que se enganchó en un extremo una cadena alifática creando un híbrido ente lípido y péptido- lipopéptido. La cola alifática tiene longitud variable (entre 12 y 20 C). La parte lipídica interacciona con la parte apolar del péptido, quedando la parte proteica del híbrido, de naturaleza hidrofílica, hacia afuera (como puede verse en la imagen), solubilizando la proteína. Son mucho más comparables con los detergentes.
En la gráfica puede verse la estabilidad de la proteína de membrana cuando se solubiliza con diferentes surfactantes. Con estos montajes (péptidos surfactantes), se consigue una estabilidad mucho mayor que la que se logra con los detergentes.
Los lipopéptidos son bastante caros de sintetizar.
Otra aproximación que se ha desarrollado es fabricar péptidos cortos muy hidrofóbicos. La ventaja de este surfactante es que, al tratarse de moléculas cortas y pequeñas resulta relativamente fácil y barato producirlas. En solución, estos péptidos forman estructuras que recuerdan a bicapas lipídicas o microtúbulos. La parte polar queda entre el glutamato y el C-terminal, que ha sido modificado: le han añadido o bien un aminoácido polar o un grupo amino, que hace que el extremo del péptido sea aún más polar. Además, para evitar que el N-terminal (que forma parte de la parte apolar) sea polar, lo han bloqueado mediante la adición de un grupo acetil.
Como se trata de una molécula con una parte polar y otra apolar, forma bicapas. Es decir, se trata de péptidos de carácter anfótero.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Con este método conseguimos bastante estabilidad a la hora de solubilizar proteínas.
En la gráfica podemos observar que el mejor resultado es el que se obtiene al añadir a uno de estos péptidos, un detergente (en este caso el DDM).
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS La idea fundamental es combinar, sobre el mismo extracto de proteínas, diversos tipos de cromatografía para aislar la proteína.
Por ejemplo, podemos separar primero las proteínas de la muestra aplicando la cromatografía de intercambio iónico. Así, las proteínas se separarán en función de su carga. Después, podemos aplicar la cromatografía de interacción hidrofóbica y, por último, la cromatografía de gel filtración para separar por tamaño las proteínas. Así, mediante la combinación de diferentes tipos de cromatografía podemos aislar una sola proteína en función de sus propiedades. Hace 20-30 años la combinación de cromatografías era prácticamente la única forma (o al menos la más habitual) de purificar proteínas.
Desde que es posible manipular genéticamente el DNA, podemos introducir etiquetas en las proteínas que queremos purificar antes de expresarlas en algún sistema biológico. Esto permite que se purifique la proteína aplicando solamente la cromatografía de afinidad. Dependiendo del grado de pureza que se quiera obtener, pueden aplicarse las demás cromatografías tras la de afinidad.
Dentro de la cromatografía de afinidad, la más utilizada para purificar proteínas es la cromatografía de metal binding o IMAC (Cromatografía de Afinidad a un Metal Inmovilizado). Normalmente, se incluye una cola de histidinas como etiqueta en el vector de sobre-expresión. Como las histidinas tienen una gran capacidad de quelar metales, para aislar la proteína expresada se hace pasar el extracto proteico por una columna que tenga metales inmovilizados sobre las beads de agarosa.
11 Purificación de proteínas En la siguiente imagen podemos ver una cromatografía de afinidad metal binding. En el carril 2 se ha hecho correr todo el extracto de proteína, antes de comenzar a purificar. La mancha más marcada se corresponde a la proteína que queremos purificar, que ha sido sobreexpresada en un sistema biológico (hay más cantidad). En el carril 4 aparece todo lo que no ha quedado enganchado a la columna (es decir, todas las proteínas que no tienen afinidad por el metal). Se van haciendo lavados con diferentes tampones (de diferentes concentraciones) para que salgan el resto de proteínas que sí han interaccionado con el metal (aunque no de forma tan estable como nuestra proteína). Por último, se hace un lavado con algún compuesto que rompa el enlace que ha formado la proteína con el metal (mediante la cola de histidinas).
Normalmente, las columnas de afinidad a un metal se basan en un soporte de agarosa que tiene un quelante unido covalentemente. A este quelante se puede unir un metal (la columna puede comprarse con o sin metal).
Lo más frecuente es que el metal empleado sea el níquel, que puede formar seis enlaces de coordinación - una vez el metal se une a la columna, quedan dos enlaces de coordinación libres, que pueden ser ocupados por la proteína. Como cada cola de histidinas tiene varias histidinas, una proteína puede unirse a más de un átomo de níquel. Esta unión será muy fuerte  nuestra proteína ("etiquetada" con la cola de histidinas) siempre se unirá más fuertemente que el resto de proteínas que tengan la capacidad de unirse a metales.
Para cortar la interacción entre la proteína y el metal, generalmente se añade imidazol, que corta las interacciones y desplaza las histidinas.
La IMAC con cola de histidinas es la forma más popular para purificar proteínas, pero hay gente que emplea etiquetas diferentes. Por ejemplo, se puede sintetizar la proteína de interés conjugada junto a Glutatión S-transferasa, que tiene afinidad por el glutatión (se añade el glutatión a las beads).
En la siguiente imagen pueden verse ejemplos de otras tags que pueden ser útiles en cromatografía de afinidad.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PRECIPITACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE UNA PROTEÍNA Tras discriminar nuestra proteína del resto de proteínas del extracto, podemos aplicar técnicas accesorias.
PRECIPITACIÓN Contamos con una proteína en solución y hacemos que se vuelva insoluble tras añadir algún agente.
Así, si centrifugamos, la proteína quedará en el pellet.
Cuando las proteínas precipitan, pueden formar agregados, pero hay algunas ocasiones en las que nos interesa precipitar la proteína.
Hay diversos AGENTES con diferentes propiedades: Algunos agentes precipitarán la proteína desnaturalizándola parcialmente, mientras que hay otros que no modifican la estructura.
Por ejemplo, podemos precipitar proteínas con sulfato amónico, un método bastante suave. Esta precipitación se basa en el efecto salting-out: la sal secuestra las moléculas de agua que rodean a la proteína en solución favoreciendo que las proteínas se agreguen (permite que formen interacciones hidrofóbicas) - las proteínas pueden perder la solubilidad, precipitando.
Cada proteína precipitará a una concentración diferente de sulfato de amonio: cuanta más superficie hidrofóbica tenga la proteína, menos concentración de sulfato amónico necesitará.
Si volvemos a solubilizar la proteína, esta recuperará su estructura ya que no se desnaturaliza durante el proceso de precipitación. Es decir, la precipitación con sulfato amónico es un proceso reversible.
Otro agente que podemos emplear para solubilizar proteínas es la acetona. A diferencia del sulfato amónico, puede provocar la desnaturalización irreversible de la proteína. La acetona se usa en técnicas analíticas, por ejemplo cuando se quiere eliminar determinados componentes de la proteína (como sales) o cambiar el buffer. Cuando hacemos análisis clínico no nos importa si la proteína pierde su estructura, tan solo nos interesa llevar a cabo un procedimiento lo más rápido y barato posible para conocer por ejemplo la concentración de una proteína en una muestra clínica.
Algunos ácidos también favorecen la precipitación de proteína. Por ejemplo, suele usarse el ácido tricloroacético. Los ácidos también desnaturalizan las proteínas.
La polietileneimina favorece la precipitación del DNA, por lo que también provocará la precipitación de las proteínas que se encuentren asociadas a él.
El sulfatodextrano favorece la precipitación de lipoproteínas.
En la siguiente tabla podemos ver estos ejemplos de agentes precipitantes así como otros diferentes que suelen emplearse.
13 Purificación de proteínas CONCENTRACIÓN Cuando purificamos una proteína, muchas veces nos interesa concentrarla. El proceso de concentración de la proteína suele llevarse a cabo al final de la purificación, previo al almacenaje de la proteína.
Suele ser interesante concentrar la proteína ya que, generalmente, cuanto más concentrada está la proteína, acostumbra a ser más estable.
Existe toda una serie de sistemas basados más o menos en el mismo principio. El mecanismo básicamente consiste en un dispositivo con dos cavidades separadas por una membrana de tipo diálisis. Esta membrana tiene poros de tamaño suficiente para no poder ser atravesada por proteínas pero sí por solventes y complejos de pequeño peso molecular.
Se ejerce una presión que haga que el solvente atraviese la membrana junto con las moléculas pequeñas.
En muchos de estos sistemas, esta presión se consigue mediante la centrifugación de la muestra  la fuerza centrífuga es la que empuja al solvente.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Es necesario tener en cuenta el cut off de la membrana (tamaño del poro), el material del que está hecha y la orientación del flujo.
Cut off Es un parámetro que viene determinado por el tamaño del poro. Podemos comprar membranas (o dispositivos que incorporan membranas) con tamaños de corte de diferente peso molecular, como los que se muestran en la siguiente tabla.
Tipo de membrana Las membranas pueden tener diferentes composiciones  serán compatibles con unos solventes u otros y tendrán diferente capacidad de absorción de proteínas. Para la concentración de proteínas nos interesa que la capacidad de absorción de la membrana sea mínima, ya que no buscamos que las proteínas se queden enganchadas en la membrana. Podemos encontrar dos materiales principalmente: - Poliéter sulfona - Celulosa En principio, son mejores las de celulosa ya que tienen menor capacidad de absorber proteínas.
Dirección del flujo En algunos sistemas, sobre todo en los primeros que fueron sintetizados, la fuerza o presión que se ejerce sobre la muestra para que baje el solvente es perpendicular al filtro. Esto puede comportar un problema: si ejercemos presión de forma perpendicular a la membrana, las proteínas tienen a apretarse 15 Purificación de proteínas contra ésta y pueden llegar a taparla, dificultando el paso de solventes y otros componentes que no nos interesen en la muestra final.
Para solventar este problema, se desarrollaron sistemas en los que, simultáneamente a la presión perpendicular a la membrana, se crea un flujo "perpendicular" a esta presión, que evita este fenómeno de taponamiento. Se trata del flujo denominado tangencial.
Cada fabricante ha desarrollado aparatos y sistemas diferentes empleando los dos tipos de flujo. Por ejemplo, en el sistema que emplea la centrífuga, el flujo es perpendicular a la membrana.
Hay casas comerciales que han desarrollado sistemas en los que la membrana se dispone con una cierta inclinación, evitando así el problema del taponamiento (el flujo ya no es perpendicular a la membrana).
Podemos encontrar otro sistema en el que la presión se ejerce por un lateral mediante una entrada de gasa inerte. Este sistema está bien a la hora de trabajar con volúmenes superiores. Como puede verse en la imagen, la membrana queda en la parte de abajo.
Este sistema incorpora una barra magnética que puede hacerse girar con un imán, creando un flujo tangencial.
La máquina que se muestra en la siguiente imagen hace girar el líquido (la solución en la que tenemos la proteína) creando un flujo tangencial.
Podemos encontrar otros muchos aparatos, de distinta magnitud.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Cuando hacemos una purificación, llevamos a cabo un seguimiento de cómo funciona mediante tablas de purificación. Se evalúan todos los pasos que se siguen para purificar la proteína. En la siguiente imagen se muestra un ejemplo de una de estas tablas de purificación de un proceso en el que se han seguido cuatro pasos.
Al final de cada paso se indica cuánta proteína, cuánta actividad enzimática tenemos (en caso de que la enzima purificada se trate de una enzima), el volumen total, … pudiendo comprobar con todos estos datos si hemos logrado enriquecer la proteína.
Esperamos que, con cada paso, disminuya la cantidad total de proteína - esto implica que estamos perdiendo la proteína que no queremos en nuestra muestra final. Además, lo ideal es que el total de la actividad enzimática disminuya lo mínimo posible, ya que estamos midiendo la actividad enzimática de la proteína que nos interesa (este parámetro nos estaría indicando si perdemos la proteína de interés).
El factor de purificación (purification factor) nos indica el número de veces que hemos conseguido enriquecer nuestra proteína (respecto al extracto inicial).
En general, la mayoría de sistemas que hemos visto hasta ahora son para purificaciones a pequeña escala. Cuando trabajamos a escala industrial, se emplean los mismos principios básicos (mismos sistemas de expresión, se usa la cromatografía y sobre todo la cromatografía de afinidad, …). Lo único que cambia son el tamaño y las regulaciones que deben seguirse para asegurar que el producto que salga al mercado cumpla los criterios de calidad., 17 ...