Metodos de estudio (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Enfermería - 1º curso
Asignatura Anatomia
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 21/10/2014
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METODOS DE ESTUDIO • • Las unidades de medida utilizadas en histología son el nanometro (nm = 10-9 metros) y el micrómetro (mm = 10-6 metros.) Este término ha reemplazado al término «micra».
• • La unidad Angström (10-10 metros) ya no es mas reconocida por el sistema Internacional de Unidades.
• Al microscopio de luz los tejidos son estudiados por transiluminación, las técnicas de preparación de tejidos se han desarrollado para obtener tejidos delgados y translúcidos, para que la preparación sea permanente se requiere que los tejidos sean fijados, extendidos en una placa de vidrio, coloreados o tejidos y cubiertos para su observación al microscopio.
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • FIJACION • La fijación previene que el tejido siga su proceso natural de digestión ya sea por sus propias enzimas o por bacterias, y preserva la estructura física.
• Es por eso que las piezas de tejidos u órganos que se desea estudiar deben ser inmediatamente fijados luego de retirados del cuerpo.
• Normalmente la fijación consiste en sumergir el tejido en un líquido o pueden ser perfundidos.
• Las sustancias químicas que se utilizan para este fin son llamadas fijadores, algunas de estas sustancias son soluciones líquidas (Cloruro de mercurio, ácido pícrico, formalina, glutaraldehido) o combinación de uno o más sustancias fijadoras (Líquido de Bouin, compuesto por ácido pícrico, formalina, ácido acético y agua; y la formaliza de Zenker, que contiene formalina, dicromato de potasio, cloruro de mercurio y agua), el fijador mas comúnmente usado es la formalina al 10% disuelta en solución salina, y una solución buffer al 2% de glutarladehido.
• La química del proceso de fijación no esta muy bien comprendida, aunque se sabe que el formol y el glutaraldehido reaccionan con los grupos amino (NH2) de las proteínas tisulares y pueden además entrecruzarse.
• La fijación del tejido para el estudio al microscópico electrónico requiere un proceso especial de doble fijación, usando una solución buffer de glutaraldehido seguida por una segunda solución fijadora de solución buffer de tetroxido de Osmio.
IMPREGNACION • De manera de obtener cortes delgados con el micrótomo, los tejidos deben ser impregnados después de la fijación con sustancias que le den al tejido una consistencia rígida.
• Para que el tejido pueda ser impregnado se requiere de dos proceso previos que son la deshidratación y el aclaramiento.
• El agua de los fragmentos a ser impregnados es extraída mediante baños sucesivos en diferentes soluciones de etanol en agua, generalmente desde etanol al 70% hasta 100%, el etanol luego es reemplazado por un solvente miscible en el medio de impregnación. (Para la parafina como medio de impregnación, el solvente es xilol).
• El proceso de aclaración, es cuando el tejido se vuelve transparente al ser infiltrado por el solvente.
COLORACION • La coloración se la realiza utilizando diferentes colorantes o una mezcla de estos, que tiñen a los tejidos mas selectivamente.
• La coloración no solo permite la mejor observación de los tejidos, nos permite también distinguirlos entre ellos.
• Los colorantes se comportan como compuestos ácidos o básicos y tiene la tendencia de formar uniones electrostáticas con los radicales ionizables de los tejidos.
• Los compuestos que se tiñen con colorantes ácidos se los denomina acidófilos.
LA RADIOAUTOGRAFIA: Propósito • La radioautografía permite la localización de sustancias radioactivas en tejidos en forma de radiación emitida en emulsiones fotográficas.
• Las sales de Bromuro de plata presentes en la emulsión actúan como micro detectores de radioactividad.
• En la radioautografía, secciones de tejidos de animales previamente tratados con • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • compuestos radioactivos son cubiertos con una emulsión fotográfica y guardadas en una caja a prueba de luz en el refrigerador.
• Por la localización de radioactividad en los componentes tisulares se puede obtener datos de la secuencia de eventos que ocurre en los tejidos.
• Por lo tanto, si una proteína radioactiva precursora (amino ácido) es dada a una célula que sintetiza proteínas su trayectoria puede ser seguida en la célula por mucho tiempo.
▪ FRACCIONAMIENTO CELULAR • El fraccionamiento celular es el proceso físico por lo cual se usa la fuerza centrifuga para separar organelos y componentes celulares como función de sus coeficientes de sedimentación.
• Con la centrifugación diferencial, los organelos celulares pueden ser aislados y sus funciones y composiciones químicos pueden ser determinados "in vitro".
• La centrifugación diferencial es lograda poniendo una suspensión de componentes celulares (obtenido por la disyunción de células en un proceso llamado homogeneización) a la acción de diferentes fuerzas centrifugas resultando en la producción de fracciones puras que tienen diferentes organelos que pueden ser estudiadas bioquímicamente y su pureza analizada en el microscopio electrónico.
• La aislación de componentes celulares por el proceso de centrifugación diferencial permite el estudio en detalle de los componentes celulares obtenidos en un estado relativamente puro: ejemplo: núcleo - nucleolo - mitocondria - retículo endoplásmico rugoso ribosomas - gránulos de secreción y gránulos de pigmento.
▪ HISTOQUIMICA Y CITOQUIMICA • La histoquímica y la inmunohistquímica unen los métodos histológicos y citológicos con los de la química y la bioquímica.
• Su objetivo es mostrar la composiciòn química y bioquímica de los tejidos y células más allá de la distribución ácido-básica mostrada mediante los métodos de tinciòn standard, sin alterar la distribución de las sustancia químicas.
• Los términos histoquímica y citoquímica son usados principalmente para indicar los métodos y para localizar diferentes sustancias en secciones de tejidos.
• Muchos iones (ejemplo hierro-fosfato) fueron localizados en el tejido con estos métodos.
• La identificación de moléculas orgánicas por reacciones químicas es explicada de la siguiente manera: ▪ ACIDOS NUCLEICOS • El DNA puede ser identificada y cuantificada en los núcleos celulares usando la "reacción Feulgen" que produce un color rojo en la presencia de DNA.
▪ PROTEINAS • Los métodos químicos no permiten la localización de proteínas específicas en células y tejidos, los métodos inmunohistoquímicos pueden.
• POLISACARIDOS Y OLIGOSACARIDOS • Polisacáridos en el cuerpo están en un estado libre o combinados con y lípidos.
• Un polisacárido en el cuerpo unido a una proteína o lípido - se llama glucógeno - que puede ser demostrado en la reacción ácida periódica de Schiff (PAS) (periodic acid-Sciff reaction-PAS).
• La reacción PAS basada en la acción oxidativa del ácido periódico (HIO4) en los grupos 1 y 2-glicolos que están presentes en los residuos de glucosa da origen a los grupos aldehidos que se reaccionan con el reactivo de Schiff produciendo un compuesto nuevo y complejo de color púrpura.
• Una variedad de polisacáridos que son fuertemente aniónicos y de cadena larga que contienen monosacáridos aminados (amino azucares) constituye los glucosaminoglucanos.
▪ LIPIDOS • Lípidos son mejor revelados con tintes que son más solubles en lípidos que en el medio en que la tinción esta disuelta.
• En este proceso secciones congeladas son sumergidos en soluciones alcohólicas que están saturadas con la tinción apropiada.
• Luego la tinción va desde el alcohol a las gotas lípido celulares.
• Los tintes más comunes son Sudan IV y Sudan negro - ellos confieren los colores rojo y negro respectivamente en los lípidos.
• • • • • • • • • • • • • Muchos procedimientos histoquímicos son usados frecuentemente en diagnósticos laboratoriales: la reacción Perl para hierro - el PAS-amilasa y reacciones azul alcian para glucógeno y glucosaminoglucanos y las reacciones para lípidos son frecuentemente usadas en las biopsias de tejidos tomados de pacientes con enfermedades que almacenan hierro (ejemplo hemocromatosis y hemosiderosis) glucógeno (glucogenosis) glucosaminoglucanos (mucopolisacaridosis) y esfingolípidos (esfingolipidosis) en tejidos.
• ENZIMAS • Una variedad de métodos histoquímicos son usados para revelar e identificar enzimas.
La mayoría de los procedimientos enzimáticos histoquímicos están basados en la producción de tinturas intensas o de precipitados "electron-densos" en el área de actividad enzimatica.
• FOSFATASA ACIDA • El método Gomori demostrativo de la actividad del ácido fosfórico consiste en incubar secciones de tejidos fijados en formol en una solución que contiene glicerofosfato de sodio y nitrato de Plomo con una lámina protectora de ph 5-0. Este método permite la localización de la actividad de estos enzimas y se usa frecuentemente para demostrar los lizosomas que son organismos citoplasmáticos que contienen ácido fosfático.
• DEHYDROGENASAS • Estos enzimas remueven el hidrógeno de una sustancia y lo transfieren a otra.
• PEROXIDASAS • Estas enzimas que están presentes en muchos tipos de células promueven la oxidación de ciertas con la transferencia de iones de hidrógeno a peróxido de hidrógeno formando moléculas de agua.
• INMUNOCITOQUIMICA • La gran afinidad de interacción entre macromoléculas es la base de técnicas importantes como la histoquímica de la lectina, la inmunohistoquímica y la hibridación "in situ." • Este método permite el estudio de la presencia y la actividad de macromoléculas específicas en las células y en los tejidos.
• El mejor ejemplo de este estudio es la interacción del anticuerpo antígeno.
• Los métodos que usan anticuerpos específicos han probado ser los más importantes en la localización de específicas y otras macromoléculas como el ácido nucleico y los polisacáridos.
• Estos exámenes están basados en la reacción del cuerpo cuando está expuestos a sustancias extrañas que se llaman antígenos o inmunógenos.
• El cuerpo responde produciendo (anticuerpos) que reaccionan en forma específica que se unen fuertemente al antígeno y así neutralizan la sustancia extraña.
• Esta producción ayuda al organismo a luchar contra la invasión de microorganismos extraños y a eliminar ciertas y otras materias extrañas no reconocidas como propias. La inmunocitoquímica está basada en el matrimonio de inmunoglobulinas con sustancias que las hacen visibles en el microscopio sin causar la pérdida de actividad biológica del anticuerpo.
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