Módulo 3 Recombinación y transposición (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2014
Páginas 22
Fecha de subida 03/05/2016 (Actualizado: 03/05/2016)
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1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Módulo 3- La recombinación y la transposición Hay tres tipos recombinación: - - Recombinación homóloga, que se produce entre dos secuencias homólogas.
Puede tener lugar en cualquier punto del genoma.
Recombinación especializada; este tipo de recombinación solo puede darse en secuencias específicas, que deben ser prácticamente idénticas, es decir, presentar homología.
Transposición: permite insertar una secuencia de DNA en otra sin que se dé homología (es un posible origen del DNA repetitivo).
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Es la que ocurre entre cromosomas homólogos, por lo que puede producirse en cualquier punto del cromosoma (dos cromosomas homólogos presentan homología en todos los puntos de su secuencia). Para que se dé, las secuencias a intercambiar deben ser casi idénticas (homólogas).
El producto de esta recombinación son dos moléculas de DNA recombinadasse mezclan secuencias con orígenes distintos. Con ello, se genera variabilidad genética.
La recombinación puede observarse en meiosis, en la que se produce entre cromosomas homólogos. Durante este proceso se forma un intermediario de recombinación en el que hay apareamiento físico entre las dos cadenas complementarias de los dos DNAs progenitores.
Siempre hay un punto de cruzamiento que genera una estructura en forma de X, intermediario de recombinación, en la que las cadenas contiguas al punto de cruce, pasan de una molécula de DNA a la otra. A esta estructura se la conoce como HOLIDAY JUNCTION.
El proceso de la recombinación homóloga se descubrió a través del estudio de la meiosis: se observó que los cromosomas homólogos se apareaban durante un momento, apareciendo un punto de unión entre ellos, al que llamaron quiasma. Estos puntos desparecían posteriormente. Las quiasmas representaban en realidad las Holiday Junctions, que mantienen juntos los cromosomas homólogos y, alrededor de los cuales se produce la recombinación.
La recombinación homóloga siempre comienza con un corte de la doble hélice, conocido como ”Double strand break”. Se corta la misma posición en las dos cadenas de DNA. En este momento, las cadenas que quedan al borde del corte pueden separarse de su cadena complementaria, e invadir a la homóloga. Ya se ha creado la Unión Holiday (H.Junction). La invasión es simétrica; como el corte se ha producido en la misma posición en ambas cadenas, se libera exactamente la misma región de DNA en las dos cadenas.
Una vez que se ha creado la Holiday Junction se debe RESOLVER o DISOLVER esta estructura para poder acabar la recombinación (y obtener dos DNAs recombinados). La resolución implica a las enzimas resolvasas; la disolución es llevada a cabo por otros tipos de enzimas (topoisomerasa 3 y una helicasa).
1 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 Las Holiday Junctions son estructuras en forma de X, intermediarias en la recombinación, en las que dos cadenas (una de cada cromosoma homólogo) intervienen en el intercambio de material genético (las otras dos cadenas no). Las dos cadenas que sí participan quedan unidas entre sí por un lado y por el otro, a la otra cadena de su misma molécula. En esta estructura se mantienen todos los apareamientos de bases. Siempre que se da recombinación, se forman dos Holiday Junctions.
RESOLVASAS Fueron las primeras enzimas de las que descubrieron que podían deshacer la estructura en X intermediaria de la recombinación. La enzima tiene dos subunidades que reconocen la Holiday Junction y catalizan, simultáneamente, dos cortes simétricos para separar las cadenas (cortan enlaces fosfodiéster). Hay dos posibilidades para resolver la Holiday Junction, es decir, dos maneras para volver a separar las dos cadenas; ambas opciones implican el corte de enlaces fosfodiéster, y la diferencia entre ellas es la orientación de éstos.
Los dos cortes que se dan en la recombinación (siempre se forman dos uniones Holiday), determinarán si se ha producido o no “crossover”, es decir, entrecruzamiento entre los productos.
En los productos de la recombinación puede haber hetrodúplex, es decir, que cada cadena tenga un origen diferente, y no haber crossover; hay crossover cuando los dos extremos de una cadena tienen origen distinto (cuando las dos cadenas de las dos moléculas han intercambiado secuencia).
Para que haya un mínimo grado de recombinación, en la meiosis se producen un número determinada de crossovers.
2 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PROCESO DE RECOMBINACIÓN 1º Se produce un corte de la doble hélice, conocido como “Double Strand Break”.
2º Una vez se ha cortado la doble hélice comienzan a intervenir diferentes actividades enzimáticas. La primera de ellas es una enzima exonucleasa, que degrada una cadena de DNA en dirección 5’3’ y su complementaria (como puede observarse en la imagen), dejando dos extremos 3’ monocatenarios (uno a cada costado del primer corte).
3º Invasión de una cadena homóloga: uno de los extremos monocatenarios 3’ busca una secuencia homóloga y desplaza a la cadena a que ésta está apareada.
Queda un extremo 3’, a partir del cual se sintetiza el fragmento que falta, apareado con un DNA.
En el otro costado del corte inicial puede ocurrir lo mismo, ya que es homólogo de la cadena que ha sido desplazada.
3 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 4º Finalmente, se han formado dos Holiday Junctions (cada extremo 3’ que se ha formado ha sido responsable de la formación de una de ellas).
Las Holiday Junction tienen la capacidad de migrar.
Como puede verse en la siguiente imagen, en los heterodúplex podemos encontrar pares de bases que no están apareadas. Esto se debe a que cada cadena viene de un cromosoma homólogo y estos no tienen que presentar necesariamente la misma secuencia exacta.
En la recombinación de la imagen se ha producido resección en una de las dobles hélice. La resección es la eliminación/degradación de un trozo de una de las cadenas.
4 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV 5º Se procede a la resolución de la Holiday Junction. Como hemos visto anteriormente, se puede producir de dos maneras. Según la imagen, habrá crossover si se hace el corte 1, y no lo habrá si se hace el dos. Como hay dos Holiday Junctions, que haya o no crossovers dependerá de cómo actúen las resolvasas en las dos.
Existen casos en los que la recombinación homóloga se puede iniciar sin un corte. Por ejemplo, cuando una horquilla de replicación se encuentra con alguna discontinuidad. Al llegar al punto donde se encuentra, habría una horquilla cortada y la única manera de rescatarla sería empleando la maquinaria de recombinación. La célula interpreta esta situación como si fuera un Double Strand Break (DSB).
También puede producirse la recombinación como consecuencia de lesiones en el DNA que bloqueen a la DNA polimerasa (la DNA polimerasa se para y la única forma de rescatarla es la recombinación homóloga). Con este método no se elimina la lesión del DNA pero se permita que la DNA polimerasa avance.
5 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 La familia de proteínas RecA (en procariotas) o Rac51 (en eucariotas) son proteínas que promueven el intercambio de cadenas. La Rac51 es, por lo tanto, muy importante para reparar el DNA tras la radiación. Para que puedan actuar, es necesario que haya homología entre las cadenas (complementariedad de secuencias), y que haya una región de DNA monocatenario, además de un extremo libre de DNA en la región complementaria a este DNA monocatenario.
La RecA reconoce el DNA monocatenario, por el que tiene afinidad, y se une a él.
RecA es capaz de interaccionar consigo misma formando una estructura helicoidal.
Por cada vuelta completa hay 6 subunidades.
Cuando se une al DNA, RecA es capaz de estirarlo.
Estas proteínas (RecA y Rad51) se unen al DNA con polaridad determinada. La polimerización de RecA hacia 5’ es una polimerización muy lenta; en cambio, la polimerización hacia 3’ es una reacción muy rápida, lo que implica que los extremos 3’ –OH libres que deja la exonucleasa, quedan recubiertos muy rápidamente.
Dentro de la estructura helicoidal de RecA hay dos puntos de unión al DNA: uno primario, al que se une el DNA monocatenario (en el que se ha producido DSB); y uno secundario, que busca una secuencia, relativamente larga, homóloga a la secuencia monocatenaria entre los cromosomas que se encuentran en el núcleo. En el momento en el que encuentra unos cuantos nucleótidos con homología se engancha formando la Holiday Junction, y se produce el intercambio de cadenas.
6 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En la meiosis hay un PROGRAMA GENÉTICO para crear daño en el DNA, ya que debe cortarse para que haya recombinación.
La Spo11 es una exonucleasa que provoca la rotura del DNA (tiene dos subunidades, cada una de las cuales corta una cadena); se trata de una tirosina catalítica. Queda enganchada al DNA tras cortarlo. Es una proteína específica de la meiosis.
MRX es un complejo que lleva a cabo la resección en eucariotas; expone los complejos 3’ –OH libres.
Así como Spo11 solo participa en la meiosis, MRX Y RecA/Rad51 también participan en la mitosis.
El complejo MRX (o MRN) está formado por las enzimas Mre11 (que es la que tiene 7 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 actividad nucleasa, y cataliza la reserción), Rad 50 (de la familia de las SMCs, al igual que la condensina y la coheisna) y Xrs2. Este complejo es el primero en llegar cuando se produce el corte en el DNA (además de la proteína RPA, que se une en el momento en el que queda expuesto DNA monocatenario).
La proteína Dmc que aparece en la imagen, encargada (al igual que Rad51) de mantener los dos extremos de una misma cadena juntos, es propia de la meiosis; Rad51 actúa tanto en meiosis como en mitosis.
RECOMBINACIÓN ESPECIALIZADA Es un tipo de recombinación específica de unos puntos concretos. Tiene lugar entre dos secuencias muy particulares, reconocidas por la enzima recombinasa. Cada recombinasa reconoce una secuencia concreta (son características de cada recombinasa).
Por ejemplo: un bacteriófago que se inserta dentro de la bacteria hoster (hay secuencias iguales entre el DNA del bacteriófago y el cromosoma bacteriano).
La recombinación especializada no es un fenómeno muy habitual, aunque se aprovecha en ingeniería genética.
Se diferencian tres tipos de recombinación específica de lugar: - Inserción: es como el ejemplo anterior; se inserta una secuencia de DNA en un lugar específico del genoma.
- Deleción; es el proceso inverso a la inserción. Las exonucleasas llevan a cabo una escisión. Las dos secuencias identificadas por la proteína deben estar repetidas en tándem. Este proceso se emplea por ejemplo en ingeniería genética para eliminar un gen sin matar al organismo (knock outeliminación de un gen).
- Inversión: consiste en cambiar la orientación de las moléculas. SI las secuencias a identificar por la recombinasa están repetidas en tándem de manera invertida, ésta invierte el DNA que esté en medio.
8 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Las recombinasas se encargan de catalizar los tres tipos de recombinación específica.
Hay dos tipos: - Serina recombinasa: con una serina en su centro activo.
- Tirosina recombinasa: con una tirosina en su centro activo.
Estas enzimas quedan enganchadas al DNA, como tienen un –OH (muy reactivo) pueden cortar los enlaces fosfodiéster.
Una cadena queda libre y el otro trozo de la cadena queda enganchada a la recombinasa. Esta reacción se revierte, ya que la enzima puede reaccionar con otro extremo 3’ –OH y formar otro enlace fosfodiéster, creando una nueva cadena recombinada.
Recombinación por serina-recombinasas: Aparecen 4 serina-recombinasas, una para cada cadena de DNA. Cada enzima corta una queda y queda enganchada a esta. El corte de las 4 cadenas es simultáneo, ya que la serina-recombinasa es un tetrámero.
Una vez se ha producido el corte, tiene lugar el intercambio de cadenas: se revierte la reacción, la serina-recombinasa vuelve a formar enlaces fosfodiéster, formando moléculas recombinadas (como puede verse en la imagen de la izquierda).
Recombinación por tirosina-recombinasas: Al igual que en el caso de las serina-recombinasas, también actúan 4 moléculas de enzima que se enganchan a las dos secuencias/moléculas de DNA (una por cada cadena). La diferencia es que no se activan las 4 recombinasas a la vez, se activan por parejas (en la imagen, la 1ª pareja está representada en color verde y la 2ª en morado).
9 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 La primera pareja da lugar a un intermediario al activarse, con una unión covalente entre DNA y enzima. Las dos recombinasas cortan los enlaces fosfodiéster y quedan unidas a las cadenas mediante el residuo tirosina. La recombinasa revierte la reacción formando un enlace fosfodiéster entre las dos cadenas, formándose una primera cadena híbrida (se forma una estructura muy similar a la Holiday Junction).
A continuación se activan las otras dos tirosina-recombinasas., que cortan las dos cadenas que aún no han participado en la recombinación. Se forma también el intermediario covalente y se produce el intercambio de cadenas seguido de la formación de enlaces fosfodiéster.
Ejemplo de tyr-recombinasa: recombinasa-Cre frecuentemente para knock outs condicionales.
10 (reconoce IoxP), empleada 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV TRANSPOSICIÓN Es una forma de recombinación genética que mueve ciertos elementos de un DNA a otro. Estos elementos son los TRANSPOSONES. Para este tipo de recombinación no es necesaria homología.
La transposición está catalizada por la enzima TRANSPOSASA, codificada por el propio transposón. Esta enzima se une a las secuencias de los extremos del transposón y a la secuencia diana a la que acabará saltando el transposón. Muchas veces, este salto implica la duplicación del transposón, aunque no siempre se copia.
Además, la secuencia diana puede encontrarse en el mismo cromosoma o en otro distinto.
Los transposones existen en todos los organismos conocidos; aunque son más infrecuentes en los organismos más sencillos.
(Los transposones son las secuencias representadas en verde).
El genoma humano está lleno de transposones, que son parte de DNA moderadamente repetitivo.
A veces, los transposones promueven reordenamientos cromosómicos como consecuencia de la recombinación homóloga. Esto se debe a que, si un transposón duplica y salta a otro cromosoma, habrá dos secuencias homólogas en dos cromosomas distintos, por lo que podría darse recombinación homóloga entre cromosomas que no están bien alineados.
11 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 Además, los transposones son elementos muy repetidos en nuestro genomase crean nuevos cromosomas.
Existen tres tipos de transposones: - Transposones de DNA - Retrovirus o retrotransposones parecidos a virus - Retrotransposones poli A En los tres tipos de transposones encontramos un elemento común: Se trata de una repetición directa a ambos lados del transposón. Esta secuencia no forma parte del transposón, es la secuencia diana dentro de la cual se integrará al producirse la transposición. Durante el proceso, esta secuencia diana acaba replicada a ambos lados del transposón.
En los TRANSPOSONES DE DNA encontramos: - Secuencias repetidas invertidas (a ambos lados del transposón); son las secuencias que reconoce la transposasa (color verde en la imagen).
- Gen que codifica la transposasa (color naranja); además en esa secuencia también suele haber genes que puedan darle ventaja, como genes que codifiquen para resistencia a antibióticos. Hay veces que el transposón pierde la secuencia que codifica la transposasa; esos transposones dejan de ser autónomos, ya que necesitan que haya otro transposón en la misma célula.
Los RETROVIRUS emplean mecanismos muy similares a la transposición del DNA para insertarse en la célula a la que infectan.
La diferencia entre los retrotransposones de retrovirus y los retrotransposones similares a retrovirus es que los primeros codifican proteínas para la cápsida y los segundos no codifican para ninguna proteína de la cápsida (por lo que no pueden salir para infectar otras células). Salvo esta diferencia, ambos son muy similares, y tienen la misma estructura.
Estos transposones tienen repeticiones directas (no invertidas) terminales largas o LTR. También tienen la secuencia diana.
12 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Codifican para una integrasa (que hace la misma función que la transposasa) que permite integrarse al transposón, y para la transcriptasa reversa. El mecanismo de transposición de los retrovirus es el siguiente: Se hace una copia en RNA del transposón (traducción); posteriormente y, gracias a la transcriptasa reversa, este RNA se copia a DNA que, a través de la integrasa se integra entre las secuencias dianas.
Los RETROTRANSPOSONES POLI A son algo más diferentes. También incluyen dos repeticiones de la secuencia diana a los costados de su secuencia.
Tienen dos UTR o untraslated region, uno 3’ y otro 5’. Estas regiones son secuencias que no se traducen. Contiguo al 3’ se ha encontrado una cola de poliadeninas (características del RNAm); los retrotransposones poli A tienen una estructura muy similar a la del RNAm.
Contiene los genes ORF1 y ORF2 que codifican para una transcriptasa reversa con dos dominios, uno con actividad transcriptasa reversa y otro con actividad nucleasapermite que tras transcribirse a RNA el transposón, se copie a DNA y se integre en el genoma (gracias a la nucleasa).
MECANISMO DE TRANSPOSICIÓN 1º Se forma el complejo sináptico en el que la transposasa (representada de color naranja) reconoce las repeticiones terminales invertidas de los extremos.
Normalmente la transposasa funciona como dímero (o multímero); cada subunidad reconoce a una de las terminaciones.
2º La transposasa hace un nick (corte en una de las dos cadenas), generando dos extremos 3’ -OH (se hace un corte en cada una de las posiciones en las que se sitúa la transposasa).
3º El mecanismo es muy variable en función del transposón; otras enzimas o incluso la propia transposasa cortan la otra cadena llevando a cabo la escisión de todo el transposón. Este proceso puede ocurrir más tarde.
4º Reacción de transesterificación con el extremo 3’ –OH; la transposasa queda enganchada a ese extremo y ataca a la secuencia diana. Como hay una transposasa en cada extremo del transposón, cada cadena se engancha a una de las dos cadenas (como puede observarse en la imagen).
Hay una pequeña separación (variable) entre el punto donde “ataca” cada una de las transposasas, es decir, entre el punto donde se inserta cada una de las dos cadenas; 13 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 debido a esta separación, quedan dos fragmentos con DNA monocatenario a cada lado del punto de inserción.
5º La DNA polimerasa rellena el hueco utilizando como primer el extremo 3’ –OH y como molde la otra cadena (ya que son complementarias); una ligasa quita la discontinuidad.
Es por esto que la secuencia diana acaba siendo duplicada a ambos lados del transposón.
Como ya hemos explicado antes, el retrovirus emplea un mecanismo muy similar: cuando infecta a una célula inserta su genoma en forma de RNA; la transcriptasa reversa lo pasa a DNA (bicatenario) y, a través de la integrasa lo inserta en el genoma de la célula hoster PROVIRUS. Desde esta posición, a través un sistema de transcripción puede sintetizar proteínas (cápsida).
14 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV MUTACIONES Una mutación consiste en un cambio en la secuencia del DNA. Este puede ocurrir de manera espontánea (como consecuencia de errores de la DNA polimerasa) o pueden ser inducidas por agentes mutagénicos.
Una mutación en una secuencia de un solo par de bases es muy poco frecuente (1 de cada 109-1010 generaciones); hacen falta muchas generaciones para que se produzca un error. La tasa de mutación aumenta cuando estudiamos genes (1 de cada 10 5-106 generaciones), y es aún mayor cuando nos referimos al genoma completo (1 de cada 300 generaciones). La exposición a agentes mutagénicos aumenta la tasa de mutación.
Desde que la DNA polimerasa comete un error hasta que se fija la mutación hay un tiempo para enmendar el error. La duración de este periodo de tiempo depende de cuándo vuelva a realizarse otra ronda de replicación. El fallo debe detectarse antes de comenzar una nueva replicación, ya que si se entra en replicación con un fallo, se fija la mutación.
Tautomería de las bases: De vez en cuando, las bases nitrogenadas no se encuentran en la forma en la que deben estar, sino que están en forma de un isómero. La tautomería genera mutaciones.
Por ejemplo: las bases nitrogenadas pueden estar en forma ceto o en forma enol; hay un equilibrio entre estas dos formas, que normalmente está desplazado hacia forma ceto.
*La forma enol de la timina puede aparearse con guanina (en lugar del apareamiento correcto de las timina –forma ceto- que es con la adenina); si la DNA polimerasa durante la replicación encuentra una timina en forma enol, la apareará con una guanina (porque se generarán puentes de H más estables). En la siguiente replicación, esta guanina se apareará con una citosina, habiéndose fijado la mutación.
15 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 SISTEMA DE REPARACIÓN DE MALOS APAREAMIENTOS - MISMATCH REPAIR Cuando dos bases no se encuentran bien apareadas, los puentes de H entre ellas están mal formados, por lo que la doble hélice queda distorsionada. Existe un sistema de reparación que permite localizar la distorsión.
Mecanismo de la E. Coli: Los genes MUT son genes con una tasa de mutación más alta de lo normal. Las proteínas MutS, son ATPasas que detectan esa distorsión. Estas enzimas se enganchan al DNA y se desplazan a lo largo de la molécula; cuando localizan una distorsión cambian de conformación, adoptando una nueva forma que les permite interaccionar con MutL. MutL activa a su vez a MutH, una endonucleasa con baja actividad. MutH solo corta una de las dos cadenas en un punto concreto, que contenga la secuencia GATC. Una vez MutH ha generado un nick, una exonucleasa degrada el DNA hasta alcanzar el punto donde se encontraba el mal apareamiento. Una DNA polimerasa volverá a sintetizar el DNA.
MutH tiene un sistema para detectar la cadena que debe que debe cortar: las MutH solo se unen a posiciones hemimetiladas (es decir, posiciones en las que una de las dos cadenas está metilada), Todas las posiciones hemimetiladas están en contacto con esta enzima, que, se encuentra inactiva hasta que reaccione con MutL. En resumen, cuando la secuencia tiene un mal apareamiento, MutS lo reconoce y recluta a MutL, que activa a MutH.
La secuencia en la que se produce el nick y la posterior degradación es la secuencia no metilada: la cadena no metilada es la recién sintetizada, ya que aún no ha habido tiempo de que se metilara (la metilada ya lleva tiempo en la cadena); por eso, es la no metidada la que probablemente contiene el error. Por lo tanto, la actuación de las Mut debe ser un proceso rápido para que a la base mal apareada no le dé tiempo a metilarse.
16 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En humanos esta sistema un funciona a través de las metilaciones. El homólogo de MutS de los humanos es la MSH, que se trata de un complejo de dos proteínas (dímero) diferentes, la MSH 2 y la MSH6, que funcionan igual.
Hay otras MSH, como por ejemplo la 3, que detecta específicamente bases que no están apareadas (suceso menos frecuente que un mal apareamiento), que se da sobre todo en secuencias repetitivas (microsatélites) en las que es más fácil que se produzca un slipping de la DNA polimerasa (se salta algunos nucleótidos y se los deja de replicar).
La reparación ocurre durante la propia replicación.
Cuando la MSH detecta un error un mal apareamiento o un nucleótido no apareado, envía a una nucleasa desde el punto donde se abre la horquilla de replicación que degrada todo el DNA recién sintetizado hasta que llega al error (se encuentra con MSH). La nucleasa va en dirección 3’5’ en la cadena conductora, y en la retardada va en dirección 5’3’.
Una vez se ha degradado el DNA: - En la cadena conductora a quedado un 3’ -OH libre a partir del cual la DNA polimerasa puede sintetizar el DNA de nuevo.
- En la cadena retardada debe generarse un nuevo primer.
Mutaciones en este sistema de reparación hacen que los satélites sean inestables y no se mantengan bien; esto es la principal causa del cáncer colo-rectal (que es hereditario): Normalmente los portadores tienen una copia buena y una mala (este cáncer es recesivo); algunas de las células del epitelio de la mucosa del colon (más expuestas a agentes mutagénicos-tabaco, alcohol, etc.) pierde la copia buena, por lo que se genera un tumor.
Otras fuentes de mutaciones espontáneas: Las bases nitrogenadas no dejan de ser compuestos químicos que, en cualquier momento pueden reaccionar.
  Desaminación: cuando se produce la desaminación de la citosina, por ejemplo, aparece uracilo, que puede aparearse con guanina o con adenina. Cuando en la replicación, la DNA polimerasa añade una adenina, se fija la mutación. La célula puede detectar la presencia de U, ya que sabe que esta base no debe estar en el DNA, y lo sustituye por C.
Las citosinas metiladas, de las regiones reprimidas, pueden perder el grupo amino, dando lugar a timina. La célula puede detectar esta mutación, ya que ve que 17 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 se ha producido un apareamiento incorrecto, pero no tiene forma de saber cuál de las dos bases (de cuál cadena) es la que está mutada.
 Pérdida de la base nitrogenada: se genera un lugar abásico. Esto puede controlarse, ya que cuando la célula detecta uno de estos lugares vuelve a colocar la base correspondiente.
   Alquilación; se añade un grupo alquilo.
Oxidaciones; son muy frecuentes, ya que vivimos en un ambiente con O2.
También pueden producirse mutaciones por agentes exógenos: - Anillo de ciclobutano: se produce cuando se forma un dímero de timinas debido a la exposición a la luz UV. En la replicación, la DNA polimerasa no sabe qué nucleótido debe añadir y se queda parada. Se necesitan DNA polimerasas especiales que permitan replicar estructuras de este tipo.
- Radiación γ o rayos X pueden ocasionar cortes en la cadena; si se corta el enlace fosfodiéster se trata de un corte neto, pero también puede darse un corte en el propio azúcar o en una base nitrogenada.
- Agentes intercalantes y análogos de bases nitrogenadas.
Bromuro de etidio: tiene una estructura muy similar a los anillos aromáticos de las bases, por lo que puede ocasionar apilamiento de bases al colocarse entre dos bases nitrogenadas.
18 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Normalmente es fluorescente y su unión al DNA incrementa su fluorescencia (se usa para tinción del DNA).
Estos agentas intercalantes son mutagénicos ya que pueden ocasionar que la DNA polimerasa añada una base de más.
Bromouracil: es un análogo de bases que se incorpora como si fuera una base normal (en concreto, como la timina). Al igual que las bases nitrogenadas, hay un equilibrio entre su forma ceto y su forma enol: el bromouracilo que está en forma ceto se aparea con adenina (no induce mutación), pero el isómero enol es mayoritario en este caso.
Prueba de Ames; sirve para identificar que productos son mutagénicos. Para llevarla a cabo se utilizan cultivos de salmonela, con una mutación que impide la síntesis de histidina, aa que necesitan para crecer.
Se colocan 108 células de la bacteria en una placa de Petri sin el compuesto a analizar; se espera que en este cultivo no crezca ninguna colonia, aunque, al haber muchas células, algunas (muy pocas) revierten espontáneamente la mutación y se forman algunas colonias.
Se colocan otras 108 células en otra placa de Petri en presencia del compuesto que se quiere analizar; si este es un agente mutagénico crecerán muchas colonias, ya que muchas células habrán mutado y habrán revertido la mutación inicial sobre la histidina (además de incorporar otras mutaciones nuevas).
Según la cantidad de colonias hayan crecido mayor o menos será la capacidad del compuesto para mutar el DNA.
Existen muchos métodos de reparación del DNA, además del ya visto Mismach Repair: *Non-homologous end-joining: une dos extremos de DNA sin homología. Cuando se corta un cromosoma, si no encuentra homologías, vuelve a enganchar los dos extremos.
*Sistema DNA polimerasa: se trata de un sistema de tolerancia al daño.
Hay patologías asociadas a todos los métodos de reparación salvo al base excision repair (del que de momento no se conocen patologías). Por ejemplo, la patología asociada al mismatch es el cáncer colo-rectal. Xeroderma pigmentosum: personas incapaces de reparar el daño de la luz UV (fallo en el sistema de tolerancia al daño; genes XP).
19 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 Los genes BRCA (BRCA1 y BRCA2) intervienen en la recombinación homóloga, y sus mutaciones están asociadas al cáncer de mama.
*Sistema BER (base excision repair) o sistema de reparación por escisión de la base.
Consiste en eliminar la base que está dañada mediante cambios en su estructura.
Requiere de la actuación de enzimas glicosilasas, cada una de ellas especializada en detectar un tipo concreto de alteraciones en cada base.
Una vez que reconoce las bases alteradas, la glicosilasa es capaz de coger la base y girarla hacia afuera, para que pueda cortarse el enlace glucosídico.
Por ejemplo, la glicosilasa de la imagen reconoce las alteraciones en el uracilo.
Como consecuencia de la reacción catalizada por las glicosilasas se genera un lugar abásico (a este punto también puede llegarse por hidrólisis espontánea de de la base nitrogenada). En el lugar abásico interviene una endonucleasa especializada de tipo AP, que realiza un corte, y posteriormente una exonucleasa. Entre ambas enzimas eliminan los restos del nucleótido, y dejan un extremo 3’ –OH libre que puede ser aprovechado por la DNA polimerasa (añade un nucleótido nuevo que es unido al anterior mediante una ligasa).
*NER-Reparación por escisión del nucleótido Sobre todo funciona para mutaciones causadas por la luz UV (como el dímero de T). En esta reparación intervienen toda una seria de enzimas (y una mutación en cualquiera de ellas causa el Xeroderma Pigmentosum). Cuando los rayos UV inducen una mutación, se forma una aglomeración de estas proteínas, que, en primer lugar, abren la doble hélice. Dos nucleasas intervienen: cada una se encarga de cortar por un costado y entre las dos eliminan la secuencia alrededor de la mutación (unas 20 pares de bases). A partir del DNA monocatenario, que queda recubierto por RPA, y del extremo 3’ –OH libre que han dejado las nucleasas, se sintetiza de nuevo el DNA.
Otras alteraciones, aparte del XP, pueden producirse por alteración de esta vía (como el Cockayne,…) 20 1º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Estas mutaciones causadas por la luz UV, no solo provocan que se bloquee la DNA polimerasa, sino que también paran a la RNA polimerasa (en la transcripción también se activa esta vía de reparación).
*Non-homologous end joining (unión de extremos) Esta vía une extremos sin ningún tipo de homología.
Las proteínas Ku70 y Ku80 reconocen estos extremos y forman un anillo alrededor de cada uno de ellos, para señalizar y proteger el extremo de DNA.
Se reclutan otras proteínas, como la DNA pk, que tiene actividad señalizadora y recluta y activa a otras proteínas, como la nucleasa Artemis.
- Cuando los extremos son netos, solo es necesaria la actuación de una ligasa que los una.
- En la mayoría de casos, los extremos no son netos (son productos de fragmentación del DNA) sino que son brutos y quedan fragmentos de DNA que es necesario limar para que los extremos de DNA puedan volver a juntarse. Nucleasas como por ejemplo Artemis se encargan de esta función (procesan y pulen los extremos brutos). Tras la actuación de la nucleasa, la liagasa une los extremos.
Este proceso es algo peligroso, ya que al limar los extremos brutos, pueden perderse algunas bases. Si se pierde una base, puede perderse la secuencia que codifica para una proteína (ya que se los aa se codifican por tripletes). Es por esto por lo que las células evitan usarlo e intentan emplear la recombinación homóloga para reparar cortes.
Por tanto, cuando hay un Double Strand Break se puede: - Usar Non Homologous Joining: solo durante la fase G1 del ciclo celular.
- Usar recombinación homóloga: disponible en las fases S, G2 y M.
Esto es así ya que, a partir de que la célula se encuentra en fase S, hay más probabilidades de encontrar una secuencia homóloga para que se dé la recombinación (se está duplicando el DNA).
Durante la fase G1 no las hay, y además es peligrosos usar la secuencia del cromosoma homólogo (el único disponible) ya que puede perderse la heterocigoticidad (perderla es peligroso porque, si uno de los homólogos estuviera dañado, podríamos perder la copia buena).
La actividad CDK activa el complejo MRN que se encarga de la reserción, por lo que, durante la fase G1 no queda más remedio que emplear el método de N.H. End Joining.
Por otra parte, el End Joining es necesario para sintetizar inmunoglobulinas (recombinación VDJ), ya que a base de combinar diferentes secuencias se generan genes para sintetizar diferentes inmunoglobulinas (así se consigue sintetizar inmunoglobulinas para cualquier patógeno).
21 BIOLOGÍA MOLECULAR - Módulo 3 *Síntesis de tranlesión (vía de tolerancia al daño) Cuando la DNA polimerasa se queda parada al encontrarse con una lesión, se intercambia por polimerasas que sean capaces de saltarse esta lesión: DNA polimerasas de translesión, que añaden un nucleótido cualquiera. Así, la célula evita que la replicación se quede parada de forma indefinida, Pueden generarse mutaciones (ya que la polimerasa de translesión añade cualquier nucleótido); cuando el sistema NER elimina la mutación inicial (que había causado que la DNA polimerasa se parase), se fijará la nueva mutación.
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