TEMA 04: Métodos alternativos experimentación animal (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad de Valencia (UV)
Grado Ciencias Ambientales - 2º curso
Asignatura Toxicología ambiental y salud pública
Profesor G.F.P.
Año del apunte 2017
Páginas 6
Fecha de subida 06/11/2017
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Toxicología TEMA 4: METODOLOGÍA ALTERNATIVA A LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL INTRODUCCIÓN Cada año se sintetizan más de 1000 productos nuevos con ayuda de los métodos alternativos. Para ello se utilizan 1500 animales por cada producto.
PRINCIPIO DE LAS 3R: reemplazo, reducción y refinamiento.
REEMPLAZAR = sustituir − − − Uso de sistemas vivos: in vitro, otros animales y microorganismos.
Uso de sistemas no vivos (QSAR y sistemas físicos y mecánicos).
Uso de simulaciones por ordenador.
REDUCIR = disminuir − − − Reparto de animales.
Reducción filogenética.
Mejorar la calidad de los animales.
REFINAR = perfeccionar − − − − Disminuir el grado y la intensidad de la invasión al organismo.
Mejoramiento de la instrumentación Mejoramiento del control del dolor Mejoramiento del control de las técnicas REAL DECRETO 1201/2005 (de 10 de octubre): sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos.
Se pretende garantizar que el número de animales empleados se reduzca al mínimo, y evitar al máximo la prolongación innecesaria de dolor, sufrimiento o lesión.
Por otra parte, fomenta la puesta a punto de métodos alternativos que puedan aportar el mismo nivel de información que el obtenido en procedimientos con animales (intentar reducir su utilización).
MÉTODOS ALTERNATIVOS 1.
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Mejoras en el almacenamiento de datos: bases de datos de estudios previos.
Modelos matemáticos: Rel. estructura - actividad.
Mejoras en el diseño de experimentos: reducción/refinamiento.
Uso pequeños organismos no protegidos: animales invertebrados, bacterias, hongos, algas...
Embriones vertebrados: peces, anfibios, reptiles, pájaros, mamíferos.
Técnicas in vitro: cultivo de células, órganos, tejidos, o sistemas libres de células.
Otros: estudios en humanos (epidemiológicos) y modelos en educación (audiovisuales, simulaciones).
MÉTODOS ALTERNATIVOS: MÉTODOS IN VITRO Los MÉTODOS IN VITRO se han desarrollado de forma espectacular en los últimos años debido: gran evolución en métodos moleculares, el empleo de cultivos celulares y el uso de cultivos con tejidos.
Los derivados de mejoras en los cultivos: factores de crecimiento, matrices, cocultivos y microagregados.
JUSTIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS IN VITRO − − − − − − Morales y éticas: no hay estrés ni sufrimiento.
Económicas: elevado coste de métodos de experimentación animal con especies no roedoras.
Científicas: las experiencias con células o fracciones celulares favorecen el entendimiento de procesos fisiopatológicos, alteración molecular y medición cuantitativa de efectos y acciones.
Logísticas: disponer de suficientes medios.
Socio-políticas: grupos sociales exigen la abolición de la experimentación animal.
Legales: la legislación europea y española exigen el reemplazo por métodos alternativos.
VENTAJAS E INCONVENIENTES VENTAJAS DE LOS MÉTODOS IN VITRO − − − − − − − − − − − − − − Ética y moralmente más aceptables Utilizan menos animales (si los precisan) Material homogéneo Permite obtener conocimientos a nivel celular Facilitan estudios electrofisiológicos y toxicocinéticos Objetivables y cuantificables Mayor reproducibilidad Mayor precisión en la dosis Control del tiempo de contacto Mecanismos de acción Influencias toxicocinéticas Ahorran tiempo y dinero Menos cantidad de producto Son puentes esenciales entre animales y humanos INCONVENIENTES DE LOS MÉTODOS IN VITRO − − − − − − − Batería de ensayos.
Ausencia de interacciones.
Limitada duración de actividad fisiológica: dificultad de detectar toxicidad retardada o crónica.
Ausencia de fenómenos toxicocinéticos.
Difícil empleo de sustancias volátiles, poco solubles, gaseosas o que se descomponen rápidamente.
Resultados erróneos (modificaciones de las condiciones del ensayo).
Complejidad de extrapolación (información in vivo).
Sustrato biológico: material generalmente orgánico, vivo o no, sobre el que se aplica in vitro el xenobiótico y cuyas reacciones, ante tal estímulo, queremos extrapolar al hombre o animal entero. Se valoran mediante los indicadores de toxicidad.
Indicadores de toxicidad: parámetros que determinamos para cuantifican las modificaciones producidas por el xenobiótico sobre el sustrato.
Evaluación: buena conjunción entre los sustratos biológicos y los indicadores de toxicidad, aunque tiene gran trascendencia el protocolo utilizado para la exposición del tóxico y el procedimiento estadístico utilizado.
SUSTRATOS BIOLÓGICOS Para incrementar la capacidad predictiva de los efectos tóxicos en humanos utilizando modelos alternativos in vitro se está aumentando la complejidad de los sistemas mediante empleo de cortes de tejidos, cultivos con diferentes tipos celulares, alargando los periodos de exposición, sistemas transgénicos.
Organismos utilizados: invertebrados, microorganismos, plantas, Microalgas y preparaciones in vitro.
TIPOS DE SUSTRATOS BIOLÓGICOS 1. Cultivo de embriones de roedores o aves (huevos fecundados): examina alteraciones en el desarrollo y la diferenciación. Mantiene intacto su metabolismo y el desarrollo de interacciones celulares fisiológicos.
2. Cultivo y baños de órganos (de animales más maduros o recién nacidos): se conservan relaciones espaciales entre distintos tipos de células. Problemas de hipoxia en el centro del órgano y dificultad para visualizar comunicaciones intercelulares.
3. Órganos perfundidos (hígado, riñón y páncreas): su circulación sanguínea se ha sustituido por otra artificial en condiciones controladas. Se pueden conocer en cada momento las sustancia que llegan al órgano y las que salen de él.
4. Explantes: cultivos organotípicos de pequeñas piezas de tejido, de animales de cualquier edad, cuyas células interactúan entre sí y crecen en cultivo durante semanas o meses manteniendo la estructura del órgano.
5. Cultivo de reagregados celulares (células de tejidos fetales): se disocian y reagrupan en microagregados con arquitectura tridimensional. Mejor diferenciación que los cultivos monocapa y mejor reproducibilidad bioquímica que los explantes. Precisan mayor número de animales.
6. Cultivo de células dispersas: las células se siembran tras ser disociadas y el crecimiento del cultivo primario se produce en monocapa.
− Inconveniente: estructura bidimensional, se pierde la arquitectura tisular original.
7. Cultivo de líneas celulares (clones celulares): células de origen animal o humano adaptadas a vivir en cultivo (línea celular establecida).
− − Ventajas: Gran cantidad de material homogéneo, mantenimiento sencillo y resultados reproducibles.
Inconveniente: perdida estructura tridimensional y funciones.
8. Modelos libres de células: si disminuimos el nivel de organización llegamos a componentes individuales de las células que desde hace más de un siglo se separan por centrifugación. Experimentación con fracción subcelular aislada.
− − Evita: interacciones tisulares.
Problema de realización de procesos interrelacionados.
SISTEMAS IN VITRO PARA ESTUDIAR HEPATOTOXICIDAD SISTEMA Líneas celulares establecidas Cultivos de hepatocitos primarios Reagregados células hepáticas Rodajas de hígado COMPLEJIDAD (NIVEL DE INTERACCIÓN) CAPACIDAD DE CONSERVAR FUNCIONES HEPATOESPECÍFICAS DURACIÓN POTENCIAL DEL CULTIVO CAPACIDAD DE CONTROLAR EL MEDIO Algo célula-célula (Varia según la línea celular) De escasa a buena (varía según la línea celular) Indefinida Excelente Célula-célula De bastante buena a excelente Semanas Excelente Célula- célula (Entre células del mismo tipo o de tipos distintos) De buena a excelente Semanas Excelente Célula- célula (Entre todos los tipos de células) De buena a excelente De horas a días Buena Hígado aislado prefundido Célula- célula (Entre todos los tipos de células) e intraórgano Excelente Horas Bastante buena Hepatotoxicidad: enfermedad hepática tóxica inducida por drogas, que implica daño del hígado inducido por ingestión de compuestos químicos u orgánicos.
INDICADORES DE TOXICIDAD TIPO DE MECANISMOS (EFECTO TÓXICO) Citotoxicidad general: interferencias producidas por un xenobiótico o sus metabolitos sobre los procesos basales comunes a la mayor parte de las células del organismo.
Toxicidad órgano-específica: se dirige a órganos diana para ciertos tóxicos y explica la mayor susceptibilidad y sensibilidad de éstos. Puede deberse: − − Modificaciones de la actividad basal de células especializadas Alteración de mecanismos celulares exclusivos de ese órgano o sistema (ej, la neurotransmisión) TIPOS DE INDICADORES DE TOXICIDAD 1. Morfología celular y tisular: tamaño y forma de las células. Uniones y mecanismos de contacto entre células.
Tamaño, forma e inclusiones del núcleo. Tamaño, forma, número e inclusiones de nucléolos. Vacuolas citoplasmáticas.
− − Técnicas no invasivas: microscopía óptica invertida, cinematografía de intervalo y resonancia magnética nuclear.
Técnicas invasivas: microscopía óptica con tinción, microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de transmisión, criofactura, microscopía crioelectrónica, técnicas histoquímicas para glucógeno y lípidos, técnicas inmunocitoquímicas, sondas específicas y citometría de flujo.
2. Variabilidad celular: azul de tripán, eritrosina B, rodamina 123, etc.
3. Proliferación celular: − − Recuento directo: en la monocapa, contador electrónico de partículas o cámara de recuento de células Recuento indirecto: de ADN, ARN, proteínas, etc.
4. Actividad metabólica celular − − − − Contenido de sustancias reguladoras: control homeostático de iones y carga energética, determinación de Mg+2, Ca+2, K+, Na+ y modificación de glutatión, ATP, cociente ATP/ADP.
Utilización de energía y alteraciones enzimáticas: radiaciones ionizantes y sustancias que forman radicales libres crean peroxidación lipídica y alteran el estado de oxidación celular.
Síntesis de macromoléculas: medición de precursores radioactivos marcados y comparación entre ribosomas libres y polirribosomas.
Inducción selectiva de proteínas: técnicas de DNA recombinante.
5. Membrana celular − Composición y estabilidad: modificación en viscosidad, difusión lateral de lípidos y proteínas o fluidez mediante espectrometría de resonancia de spin.
− − Permeabilidad iónica: estudios electrofisiológicos, isótopos, fluorímetricos para comprobar la afectación tóxica de los canales de iones.
Sistemas de transporte: capacidad de captación de colorantes polares y actividad de sistemas enzimáticos implicados en la bomba de iones como la de Na/K.
6. Estudio de la comunicación intercelular: transferencia de colorantes, recuperación de fluorescencia tras fotodecoloración, etc.
7. Indicadores específicos: métodos inmunoquímicos para determinar moléculas específicas, receptores y otros componentes celulares, etc.
EJEMPLOS DE ALTERACINES TÓXICAS - Del SNC: neurotransmisores, receptores, despolarización/repolarización neuronal, etc.
- De células hepáticas: almacenamiento de metales y vitaminas, síntesis de bilis, biotransformaciones de fase 1 y 2, etc.
- De tejido dérmico y ocular: procesos de fotosensibilización, reacciones alérgicas, etc.
- De la fisiología endocrina: captación de precursores, secreción hormonal, degradación, unión a receptores, etc.
- Del sistema inmunitario: influencia de la cooperación celular, etc.
- De células renales: captación de sustancias por sus polos apical y basal, procesos de secreción, concentración y aclaramiento.
VALIDACIÓN Y ACEPTACIÓN DE LOS MÉTODOS IN VITRO Para que los datos toxicológicos de un método experimental sean utilizados para la evaluación del riesgo/peligro y el registro de una nueva sustancia se requiere que el protocolo sea validado científicamente y que sea aprobado por las autoridades reguladoras.
Validación: proceso por el que se establece la reproducibilidad y relevancia de ese procedimiento para un determinado propósito.
Aceptación: aprobación e inclusión de un procedimiento (por las autoridades reguladoras) en las recomendaciones y normativas (nacionales, internacionales, OCDE, UE) para su aplicación en estudios de valoración del riesgo.
Pasos para aceptar un nuevo ensayo: 1.
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Desarrollo del ensayo Prevailidación Validación Evaluación Progreso para su aceptación reguladora AÑOS 70 → Test de ames: test de primera elección para determinar mutagenicidad. Es un modelo no validado, pero aceptado internacionalmente.
AÑOS 80 → Se validan 3 ensayos para definir la genotoxicidad in vitro. La evaluación no era tan rigurosa como la actual.
− − − Demostración de mutaciones génicas y puntuales Demostración de aberraciones cromosómicas Demostración de otros tipos de efectos sobre los cromosomas MÉTODOS VALIDADOS POR LA ECVAM Actualmente hay 13 métodos científicos validados, 2 recomendaciones para eliminar y 10 métodos aceptados.
1. Ensayos de Fototoxicidad: fijación de rojo neutro en células 3T3.
2. Ensayos de Corrosividad: ensayo de la resistencia eléctrica transcutánea en piel de rata (TER) y modelo de piel humana constituida (Episkin).
FUNCIONES DE LA EURL-ECVAM 1. Coordinar la validación de métodos alternativos en la UE.
2. Actuar como un punto focal para el intercambio de información sobre el desarrollo de métodos de ensayos alternativos.
3. Configurar, mantener y administrar una base de datos sobre los procedimientos alternativos.
4. Fomentar el diálogo entre los legisladores, industria, científicos biomédicos, organizaciones de consumidores y grupos de bienestar animal, con miras al desarrollo, la validación y reconocimiento internacional de los métodos de ensayo alternativos ...

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