Tema 5 - PCR Convencional (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 16
Fecha de subida 10/04/2016
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 5 – PCR Convencional APROXIMACIONS GENERALS Els genomes complexes com és el genoma humà són molt difícils d’analitzar. Com hem estat veient, les aproximacions pel seu genotipat passen per la hibridació o detecció específica (Southern, Northern, FISH) i per la clonació o amplificació específica (PCR). Aquesta darrera va ser desenvolupada per Kary Mullis, el qual va introduir una nova tècnica de clonació en sistemes lliures de cèl·lules, la PCR.
Dins de l’amplificació específica, les 2 aproximacions es poden seguir via PCR o via blotting.
123 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 PCR La PCR no és més que una síntesi de DNA in vitro. És un sistema lliure de cèl·lules on purifiquem o sintetitzem un nombre molt elevat de còpies d’una seqüència concreta del genoma; amplificació selectiva de seqüències. A més, podem partir de poca quantitat inicial de DNA i en un estat de conservació relativament dolent. Amb tal que hi hagi unes còpies intactes de la seqüència que vols amplificar ja tens suficient.
La PCR va ser tota una revolució per la genètica forense. Va ser de les primeres tècniques usades en genètica legal; abans de la PCR s’usava el Southern blot.
Inhibidors de la PCR: moltes vegades les mostres de DNA són brutes, contenen inhibidors de la PCR (SDS, àcid húmic,...) o alguns compostos que poden interferir negativament en la reacció. És aconsellable diluir la mostra per tal de diluir aquests compostos, ja que no hi ha problema en que hi hagi menys quantitat de DNA en la mostra. En concentracions més baixes de DNA obtindrem millors resultats. Ara, un excés d’inhibidors pot ser problemàtic.
Components d’una PCR - DNA motlle per copiar.
Polimerasa de DNA per sintetitzar les còpies.
Encebadors.
dNTPs.
Buffer (tampó de reacció).
Polimerases de DNA Klenow La polimerasa Klenow és una polimerasa d’E. Coli en la qual s’ha eliminat l’activitat exonucleasa. Es va començar a utilitzar l’any 1983.
Desavantatges: Aquesta polimerasa es desnaturalitza en desnaturalitzar-se el DNA, de manera que en cada cicle se n’ha d’afegir de nou. És poc eficaç perquè la seva temperatura òptima és de 37 ºC. A aquesta temperatura, les condicions d’astringència són baixes, i l’especificitat serà baixa (s’amplifiquen moltes regions).
124 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Taq (Thermus aquaticus) Es va incorporar 5 anys més tard, el 1988. Aquesta és una polimerasa termostable; pot treballar en condicions de temperatura que s’ajusten a les d’hibridació i d’annealing (no n’hem d’afegir a cada cicle). Té una temperatura òptima de 95ºC, cosa que permet treballar a temperatures més elevades, obtenint així una especificitat més elevada.
Ara bé; tampoc la podem tenir permanentment a 95ºC, ja que llavors sí que es desnaturalitzarà. Però com anem pujant i baixant la temperatura periòdicament, l’activitat de la polimerasa només es veu lleugerament afectada (un % es va perdent). Al llarg de molts cicles ens quedarem sense, però la vida mitjana és més alta que en la Klenow.
Actualment venen Taqs modificades sintèticament que s’activen a mesura que arriben a la temperatura indicada. D’aquesta manera, hi ha la mateixa quantitat de polimerasa al llarg de tot el procés.
En la següent taula en tenim uns quants exemples. Un d’ells, la Tth, és una polimerasa que té activitat retrotranscriptasa; actua com a polimerasa de DNA i de RNA, en funció del que hi hagi a la mostra. És a dir, pot sintetitzar DNA a partir de motlles tant de DNA com de RNA.
125 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Long Range PCR La Taq no serveix per amplificar seqüències molt més grans de 3-4 Kb, ja que no té correcció d’error. Si s’introdueix un error, la cadena es dissocia i la síntesi no continua.
Les cases comercials venen polimerases que permeten amplificar seqüències més llargues de 3-4 Kb (fins a 40). Ara bé, la majoria són mescles d’enzims: concretament, mescles de la Taq amb un enzim o polimerasa de correcció de prova (tenen capacitat de reparació). Quan s’introdueix un error, l’enzim de correcció de prova ho detecta i ho corregeix, per tant la cadena no es dissocia i la síntesi continua.
El procediment és el següent: 126 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tampó de reacció Magnesi El magnesi és un catió bivalent (Mg+2) cofactor de la polimerasa. Els dNTPs o el DNA segresten el magnesi lliure.
S’ha d’ajustar la quantitat per tal que la Taq funcioni correctament.
El Mg+2 és necessari per l’activitat de la Taq polimerasa (precisa una concentració mínima de Mg+2 lliure de al menys 1,2 – 1,3mM). Un defecte de Mg+2 disminueix l’eficàcia de l’amplificació, mentre que un excés pot produir inespecificitat en l’amplificació. Si n’hi ha poc, l’amplificació serà molt deficient. Si n’hi ha massa, el DNA s’estabilitzarà molt i hi haurà unions inespecífiques un cop incorporem els encebadors. A més l’efecte d’estabilització dels ions bivalents és major que en els monovalents, com podrien ser el sodi i el potassi.
Per tal de determinar la quantitat necessària de Mg+2 hem de fer bancs de dilucions fins obtenir la banda de l’amplicó sense soroll de fons. La concentració necessària de Mg+2 variarà en cada PCR.
Els dNTP competeixen pel Mg+2 en quantitat equimolar; hi ha d’haver la mateixa concentració de cada un dels 4 dNTPs (50-200 mM).
Les cases comercials a vegades afegeixen additius al buffer que serveixen per estabilitzar la Taq i evitar interferències i altres problemes de la PCR. Per exemple, el glicerol redueix les estructures secundàries que es formen en regions riques en GC. El DMSO (dimetil sulfòxid) redueix la incidència de depurinacions i també les estructures secundàries. Ara bé, aquest darrer també és un inhibidor de la PCR; hem de trobar les condicions òptimes.
127 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Encebadors Els encebadors permeten definir els límits (extrems 5’ de cada un d’ells) de la seqüència específica del DNA motlle a amplificar a nivell de nucleòtid. De la mateixa manera, també definim la seva grandària.
Sense encebadors no hi ha amplificació; la polimerasa ha de trobar un extrem 3’OH lliure i estable en el DNA motlle a partir del qual sintetitzar DNA. L’encebador delimita l’amplicó i l’extrem 5’P de cada cadena. Cada encebador han d’hibridar en cada una de les dues cadenes (la forward i la reverse).
Si marquem els encebadors, marcarem el producte que amplifiquem. És més; si marquem els dos encebadors de manera diferent, marcarem cada cadena de forma diferencial, i després podrem modificar els productes de l’amplificació en funció del que ens interessi.
La precisió dels primers, doncs, la decidim nosaltres, ja que dissenyem els encebadors per que hibridin i s’orientin d’una manera determinada.
En l’electroforesi dels productes amplificats, podem observar unes bandes difuses i petites (d’uns 50 pb, a la part de baix) que corresponen a dímers d’encebadors. Això es dóna perquè els encebadors poden hibridar entre sí (són complementaris en els seus extrems 3’OH) donant lloc a productes inespecífics (també estan marcats).
Com més dímers trobem, menor serà l’eficàcia de la PCR, ja que aquests encebadors no estaran destinats a amplificar el nostre producte.
Aquests dímers es poden formar entre primer 1 i primer 2 com també entre dos primers 1 i 2 primers 2.
Quan es fan PCR múltiples, on s’amplifica amb més d’un parell de primers, encara hi haurà més possibilitats d’aparellament entre primers. El que es fa llavors és dissenyar cada parella d’encebadors de manera que la grandària de cada parella sigui diferent. Així en l’electroforesi distingirem de quin parell d’encebadors es tracta cada banda. Per això, a més encebadors més complicat serà el disseny de la PCR.
128 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Reacció de PCR Molècules de DNA en una PCR Podem trobar 3 molècules de DNA: el DNA inicial (DNA motlle), el DNA de llargada variable, generat a partir del motlle inicial, i el producte específic que incrementa de manera exponencial.
La quantitat de DNA generada en una reacció de PCR ve generada per la quantitat de motlle inicial. Nosaltres partim d’un eppendorf amb unes molècules de DNA motlle a analitzar. A cada cicle, la quantitat d’aquest DNA es manté constant, no es veu modificada. Aquest permet sintetitzar més còpies de les cadenes de DNA, les quals correspondran a les de llargada variable, que augmenta de forma lineal.
Aquest servirà de motlle amb la mida definida a partir dels quals se sintetitzarà el producte específic, el qual anirà augmentant, teòricament, de forma exponencial.
Així doncs, al final tenim m·2n molècules de DNA. En un número de cicles determinat, podem calcular el número d’amplicons que tindrem com segueix:: 𝑸 = 𝒎(𝟏 + 𝑬)𝒏 On: - - Q: quantitat de DNA que tenim en el moment.
m: quantitat de DNA inicial.
E: eficàcia. Si aquesta fos 1, tindríem m·2n. Però mai és 1. Normalment considerem una eficàcia bona quan es troba entre 80-90%. Els amplicons petits s’amplifiquen de manera molt més eficaç que els grans, i segresten els components. En una PCR múltiple els amplicons petits surten més intensos que els més grans.
n: número de cicles.
Ara bé, aquest creixement exponencial no és infinit. Hi ha un número determinat de cicles on hi ha creixement exponencial, però un cop s’arriba a un màxim, ja no hi ha més amplificació.
Això ve donat perquè els recursos no són infinits (anem consumint dNTPs, encebadors lliures, la Taq perd activitat i es desnaturalitza...). Això crea desequilibris en la reacció, i arriba un moment on ja no hi ha amplificació. En general tenim entre 35 – 40 cicles.
L’últim pas de les PCRs és deixar-la a 4º per tal de conservar-ho bé un cop acabada la reacció.
129 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Algunes imatges que il·lustren el que hem explicat: En aquesta taula tenim les diferents molècules que ens podem trobar a cada cicle. Tenim molècules de llargada intermèdia i petita però que no afecten el producte específic.
130 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Inespecificitats Ens poden aparèixer inespecificitats, bandes al gel que no són les que busquem, i poden ser degudes a diferents motius.
Els encebadors que dissenyem poden trobar certa complementarietat en altres regions del genoma fora de la regió a amplificar, sobretot treballant amb genomes grans. Això seria un off target site primer dímer. Fins i tot pot passar que un encebador amplifiqui inespecíficament una regió que no toqui i que fent això creï llocs de complementarietat per altres encebadors; llavors tindrem amplificada una regió al llarg de tots els cicles.
També podem trobar-nos amb què la Taq tingui activitat fora de la fase de polimerització.
La Taq sol tenir el seu òptim als 72º, però pot activar-se quan temperatura està assolint aquest grau. Això es dóna sobretot a la fase inicial de desnaturalització, ja que és fàcil que la Taq comenci a sintetitzar de manera inespecífica mentre la temperatura assoleix els 72º.
Així doncs, les inespecificitats es donen al principi de la PCR.
131 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tenim diversos mètodes per evitar aquestes inespecificitats: - Touch-down PCR. Consisteix en reduir progressivament al llarg dels cicles la temperatura d’hibridació.
Hot-start PCR. Consisteix en mesclar, introduir o activar la polimerasa de DNA en el moment de la primera desnaturalització.
Nested PCR. Consisteix en realitzar una segona reacció de PCR amb encebadors interns del fragment amplificat en la primera PCR.
Touchdown PCR 29/03/16 És un mètode de PCR pel qual els encebadors eviten l'amplificació de seqüències no específiques. La temperatura d’annealing durant una PCR determina l'especificitat de la hibridació de l’encebador. El punt de fusió de l’encebador estableix el límit superior de la temperatura d’annealing. A temperatures just per sota d'aquest punt, només es produiran aparellaments de bases molt específic entre l'encebador i el DNA motlle. A temperatures més baixes, els encebadors s'uneixen de forma menys específica.
En els primers passos d’una touchdown PCR, les temperatures d’annealing són altes. Aquesta va disminuint a mida que passen els cicles (el nombre de cicles i de l'increment de disminució de temperatura individuals és elegit per l'experimentador). L’encebador hibridarà a la temperatura més alta que sigui menys permissiva quant a les unions no específiques que és capaç de tolerar.
Per tant, la primera seqüència amplificada serà la que tingui major especificitat amb l’encebador; el més probable és que aquesta sigui la seqüència d'interès. Aquests fragments d’interès s'amplifiquen encara més durant les rondes posteriors (a temperatures més baixes).
La touchdown PCR augmenta l'especificitat de la reacció a temperatures més altes i augmenta l'eficiència cap al final mitjançant la reducció de la temperatura d’annealing. Això millora en gran mesura el resultat final del procés de reacció en cadena de la polimerasa.
Imatge de l’esquerra: PCR estàndard. Imatge de la dreta: Touchdown PCR.
132 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Hot Start És la tècnica més freqüent per evitar les inespecificitats. Les cases comercials ja venen les Taq polimerases preparades per fer hot starts (Taq hot-start). Són una mica més cares que les normals.
Aquesta tècnica es basa en començar la PCR en calent. De normal, com comencem a temperatura ambient, la polimerasa és capaç de sintetitzar alguns fragments d’encebadors que hibriden inespecíficament abans de començar la PCR. La polimerasa no està del tot activa fins que s’assoleix la temperatura de desnaturalització però, com ja hem dit, quan s’acosta la temperatura ja pot sintetitzar alguna cosa. Si comencem la PCR en calent ens estalviem aquestes possibles inespecificitats.
Aquesta tècnica la podem dur a terme de diferents maneres: - - Manual. Algun dels components que no s’introdueix des del principi, com ara el magnesi o la Taq, s’afegeix quan la temperatura ja és superior a 70ºC. Quan el termociclador arriba a 70-80º aturem la PCR, ho afegim i tanquem. No és recomanable, ja que quan obres els eppendorfs es donen desequilibris (problema: l’aigua s’evapora).
Separació física. Els components de la reacció es divideixen en dues mescles separades per una barrera, com ara una capa de cera. Es posen els components a l’eppendorf, s’afegeix la molleta de cera, es puja la temperatura, es fon la cera, i quan es refreda solidifica i fa una capa. Tens els components alliberats sota la capa. Ara obres l’eppendorf i afegeixes les polimerases, però l’aigua no s’evaporarà. Tornes a pujar la temperatures, la cera es fon i es barregen tots els components, i quan es fon la temperatura està tan alta que els encebadors ja hibriden directament amb el DNA motlle, i comença la PCR des de la temperatura d’anneeling. Les inespecificitats que es generin seran degudes a què no has dissenyat correctament l’encebador. Problema: la cera després s’ha d’eliminar.
133 Diagnòstic Genètic Molecular - - Parcial 1 Polimerases amb anticossos que bloquegen el centre actiu. La polimerasa de DNA s’afegeix unida a anticossos inactivants termosensibles. Els anticossos modelen el centre actiu de l’enzim. Quan puja la temperatura, l’anticòs s’allibera i deixa buit el centre actiu.
Polimerases químicament modificades. La polimerasa de DNA s’afegeix unida a un grup químic bloquejant termo sensible. És el més senzill, ja que tu compres aquestes polimerases ja fetes que es van activant a mida que puja la temperatura i sempre es manté la mateixa quantitat de Taq activa.
Tot això son sistemes per separar els continguts. Ens farà servei amb petites quant de DNA, ja que assegura un bon resultat.
134 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Nested PCR Aquest és un sistema que es pot emprar per varies coses. Pot donar-se el cas que dissenyem els encebadors per la PCR i no amplifiquin o siguin dèbils; això passa quan partim de quantitats petites de DNA. No arribem a visualitzar o veiem les coses molt tènues. Si fem molts cicles, ens arrisquem a que s’amplifiqui la seqüència que volem i també d’altres seqüències per inespecificitats. Com més cicles, més possibilitats que amplifiquin seqüències inespecífiques. La quantitat de DNA que amplifica depèn de la quantitat inicial.
Una Nested PCR consisteix en fer una segona reacció de PCR però amb uns encebadors diferents, interns del fragment amplificat en la primera PCR. La quantitat de seqüències inespecífiques serà molt menor que el DNA motlle del genoma que estàs amplificant. La probabilitat que les seqüències inespecífiques anteriors també tinguin complementarietat amb els nous encebadors és molt baixa. Llavors aconsegueixes eliminar les inespecificitats i incrementes l’eficàcia de l’amplificació.
El producte final és més petit en la 2a ronda que en la 1a, però es més específic. És una PCR dins d’una PCR. A vegades afegint un segon encebador val, però altres vegades se n’afegeixen més.
Aquesta PCR ens millora l’especificitat (veiem la banda més clarament) a banda d’evitar les inespecificitats.
135 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Podem dissenyar 3 o 4 encebadors: - Niuada (nested). Dissenyem 2 encebadors externs per la primera ronda de PCR i 2 encebadors interns per la segona ronda. És una PCR dins una altra PCR anterior.
Seminiuada (seminested). Introduïm només un nou encebador intern. Així només dissenyem 3 encebadors. La primera reacció es farà amb els encebadors dels extrems i la segona amb un de l’extrem i l’intern.
136 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 PCR a partir de petites quantitats de DNA És millor treballar partint de quantitats baixes de DNA però que sigui pur. Podem trobar-nos en dues situacions no desitjades: tenir poques cèl·lules o cèl·lules barrejades que no interessen.
- DNA d’una o unes poques cèl·lules. Serveix per un DGP o un DP no invasiu.
Poques molècules de DNA dins una població major. Per infeccions, cèl·lules canceroses o transplantaments de moll de l‘os. En aquest darrer cas del moll de l’os, treballaríem amb una barreja de DNAs, i no volem que hi hagi competència entre DNAs pels nostres encebadors. Això generaria moltíssimes inespecificitats. Llavors la millor solució seria una Hot – Start, tot i que es podria fer també una Nested – PCR.
RT – PCR Característiques de la PCR per retrotranscripció: - - Aquesta PCR precisa d’un motlle de DNA. No podem analitzar directament el RNA; les polimerases també depenen de DNA; en aquest generem còpies de DNA a partir de cDNA que obtenim per retrotranscripció del RNA. A partir del cDNA amplifiquem el RNA.
Es pot obtenir DNA còpia d’RNA per poder-lo utilitzar com a motlle inicial de la PCR.
El cDNA s'obté per retrotranscripció (RT).
És una tècnica ràpida i sensible que permet d’analitzar l’RNA de petites mostres biològiques.
Els passos a seguir són: 1. Aïllem el RNA.
2. Fem la retrotranscripció.
a. Aquesta pot ser prèvia a la PCR o simultània, ja que hi ha polimerases, com la Tth (Thermus thermofilus) que tenen activitat polimerasa i retrotranscriptasa.
3. Fem la PCR sobre el cDNA.
137 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Les retrotranscripatses que podem utilitzar són: - M – MLV. És la retrotranscriptasa del virus de la Leucèmia Murina.
AMV. És la retrotranscriptasa del virus de la Mieloblastosi Aviar.
Tth. És la polimerasa de Thermus thermofilus. L'enzim replica el DNA a 74°C i té una vida mitjana de 20 minuts a 95°C. L’activitat polimerasa de DNA depenent de DNA de Tth precisa de magnesi, i la depenent d’RNA precisa de manganès. Per tant si comprem la Tth, el buffer ens vindrà amb Mg i Mn. Amb aquesta rt disminueix la probabilitat d’error.
Els encebadors que podem utilitzar són: - - Hexàmers generats aleatòriament (random).
Oligo dT. Amplifiquen còpies de mRNA amb cua poliA (per l’amplificació de seqüències de mRNA de manera inespecífica).
Encebadors específics de seqüència.
La RT-PCR és el sistema mes senzill. Al primer cicle se’ns generen còpies de DNA i còpies del mRNA (cDNA). A partir d’aquí, ja tenim el cDNA que serveix de motlle pel segon encebador i ja podrà anar amplificant. Per tant només s’han de dissenyar dos encebadors per la seqüència del mRNA; un d’ells serveix per retrotranscriure i els dos serveixen per l’amplificació posterior. No és necessari dissenyar més encebadors.
La RT-PCR és molt útil; s’usa més que el Northern blot per l’anàlisi de RNAs, ja que aquesta permet treballar amb quantitats de RNA inicial més baixes.
138 ...