1r parcial TR (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 4º curso
Asignatura Tecnologia de la reproducció
Año del apunte 2015
Páginas 36
Fecha de subida 27/03/2016
Descargas 21
Subido por

Descripción

si no enteneu alguna abreviatura pregunteu-me

Vista previa del texto

Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial 1-. GAMETOGÈNESI GAMETOGÈNESI FEMENINA La formació dels gàmetes comença per migració de PGC (cèls gametogèniques primordials) a la cresta genital, propera al que seran els ronyons. Quan arriben a la cresta comencen a proliferar mitoticament fins que esdevenen oogonis (x acció de dif gens), que es comencen a dividir fins que es preparen per entrar a meiosis i fan l’última fase S (replicació DNA) i entren en profase I.
** Profase I = leptotè  zigotè  paquitè  diplotè La meiosi s’aturarà al dictiotè (canvi de nom del diplotè), que es el final de la profase I i es queda aquí durant anys.
Els gàmetes femenins i masculins sempre estan relacionats amb cels somàtiques (cels de Sertori en masc / cèls fol·liculars en fem). Les CF interaccionen i controlen el creixement del oòcit.
OOGÈNESI – CREIXEMENT OOCITARI FOL·LICLE PRIMORDIAL Alguns oòcits comencen la fol·liculogènesi. Comencen a créixer sobretot les CF (fol·licle 1ari  fol·licle 2ari  3ari...); l’oòcit està aturat en meiosi I, és un oòcit 1ari. El fol·licle 1ari té 1 capa de cèls, el 2ari té 2... i conté l’oòcit 1ari.
Els fol·licles ja creixen dp del naixement però si el nivell de FSH (gonadotropina) no és l’adequat l’oòcit entra en apoptosi (o ATRESIA). A la pubertat, hi queden el 25% d’oòcits (reserva ovàrica).
Quan augmenta la [FSH] l’oòcit manté el creixement. Només el 0.1% d’oòcits seran ovulats.
L’oòcit acumula molta quantitat de material (per l’embrió) i les CF comencen a sintetitzar estradiol.
L’augment d’estradiol disminueix la [FSH]. La disminució de FSH fa que només hi hagi suficient per 1 fol·licle i per tant, només 1 fol·licle serà capaç de créixer del tot (DOMINÀNCIA).
Al punt de màxim creixement, l’oòcit respon a l’augment de LH i reprèn la meiosi fins la metafase II (oòcit 2ari), on es tornarà a aturar. La meiosi femenina s’atura a dictiotè (diplotè). La meiosi no es reprèn fins el moment de la fecundació (oòcit  zigot, no existeix òvul).
**Vesícula germinal: nucli condensat SINTESI DE MACROMOLÈCULES: RNA I PROTS Un cop els oòcits estan aturats, algun oòcit creixerà (+ el fol·licle). L’oòcit creix i acumula material, la vesícula germinal és molt activa sintetitzant DNA. L’inici de síntesi de RNA es produeix en un fol·licle 2ari (a l’oòcit 1ari); la gran majoria (60%) és rRNA (producció de ribosomes), 18% tRNA, 10% mRNA, 2% microRNA.
Els RNA són relativament estables. RNA que es traduït té una vida mitja més curta pq les nucleases estan associades al cromosoma. I els altres son emmagatzemats per utilitzar-se més endavant.
Aquests rna produeixen proteïnes de manteniment (housekeeping) i prots associades al creixement oocitari. Hi ha 2 grups de prots que se sintetitzen molt activament: 10% són prots de la zona 1 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial pel·lúcida (embolcall que rodeja l’oòcit i l’embrió; secretada per l’oòcit) composta de 3 prots i és important pq interacciona amb l’espermatozoide. Les actines tenen un paper regulador.
Hi ha un grup de prots que s’emmagatzemen per ser usades dp de la fecundació, controlen els primers estadis d’embriogènesi i són d’origen exclusivament matern.
Les proteïnes són molt estables.
ACUMULACIÓ D’ORGÀNULS El creixement s’organitza en estructures (ribosomes, RE…). El RE dona lloc a l’aparició de grànuls corticals, que migren cap a posicions properes a la mb i seran els responsables d’evitar que entri més d’un espermatozoide (Polispermia). El RE a més, acumula Ca++.
Tot això fa que l’oòcit, quan entri en prefol·licle preantral i antral, esdevingui meiòticament competent responen als estímuls hormonals i reprenen la meiosi, ovula. Els estímuls hormonals arriben a tot l’ovari però només els oòcits que han crescut suficient ovularan.
MADURACIÓ DE L’OÒCIT L’oòcit comença a madurar un cop ha crescut. Aquesta maduració implica certs canvis: - - - Canvis en les característiques nuclears: represa de la meiosi. Apareixen unes estructures a la metafase I. Hi ha diferents maneres d’organització cromosòmica.
L’embolcall nuclear es trenca  trencament de la vesícula germinal (GVBD). L’oòcit entra en metafase.
L’anafase separa els cromosomes homòlegs, durant la telofase la divisió es produeix a l’extrem  és desigual i apareix el 1r corpuscle polar.
L’oocit entra en metafase II i es torna a aturar. En aquest punt, es produeix l’ovulació en la majoria de mamífers. Queda aturada fins que es produeix la fecundació. Quan arriba l’Z, dispara un estímul per reprendre la meiosi femenina. Se separaran les cromàtides i hi haurà una altra divisió desigual, una part de les cromàtides aniran al citoplasma on hi haurà el zigot i l’altra part s’integrarà al 2n corpuscle polar. Quan veiem dos CP, està fecundat.
Síntesi de macromolècules: com el DNA està condensat en cromosomes, no pot haver-hi síntesi de RNA i no hi haurà transcripció. El control dels processos no dependrà de l’expressió gènica si no dels rna i prot emmagatzemats. El rna emmagatzemat formarà proteïnes però en menys quantitat que abans.
En la distribució d’orgànuls: cal preparar l’oocit per les primeres fases de desenv. Els Mt tenen una distribució difusa en tot el cyt; durant el trencament de la vesícula germinal formaran un halus, després es dispersen i es tornen a condensar en el centre. Això es important per la supervivència de l’embrió (qualitat oocit). Durant la maduració, el procés de migració dels grànuls es imprescindible per evitar la polispermia, aquesta migració va associada a una reorganització del citoesquelet: els microfilaments d’actina s’interposen entre els grànuls corticals i la mb (matriu subcortical). Així es controlen els grànuls corticals, 2 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial - quan entri el primer Z els grànuls han d’alliberar ràpidament el seu contingut. IP3 allibera el Ca++ del RE, així es regula el Ca++ Reorganització en la topografia de la superfície cel·lular: implica una redistribució dels microvillis. Hi ha una zona sense microvilli (CASQUET) on sota hi ha la metafase II, això impedeix que vagin els espermatozoides a aquella banda ja que si no hi ha microvilli no s’hi poden enganxar. Evolutivament important ja que si l’Z es queda a prop de la metafase II, quan es produeixi el 2n corpuscle, pot arrossegar el material genètic del Z (zigot haploide i d’origen exclusivament matern no viable).
Apareix un nou espai degut a l’aparició del 1r corpuscle polar, el volum del citoplasma disminueix pq una part se’n va al corpuscle. Es crea un espai entre mb i citoplasma (espai perivitel·lí) que ve de la pèrdua de volum de l’oòcit, té un paper clau en l’ inhibició de la polispèrmia.
- Canvis en el cummulus, que és un conjunt de cèls fol·liculars que envolten l’oocit, que l’acompanyen i controlen tots aquests processos  complex cummulus – oòcit (COC). Es produeix l’ovulació de tots dos. Unió per gap juntions. En algunes espècies es parla de corona radiada (p.e ratolins), que es la part del cummulus que toca directament a l’oocit.
Les CF estan molt unides entre elles i l’oocit, per tant, no hi passa cap espermatozoide. Hi haurà espais per on l’espermatozoide pot pasar, que es produeix en l’expansió del cummuls per síntesi i alliberament de l’àcid hialurònic, que funciona com una MEC per on hi circula l’espermatozoide.
REGULACIÓ OOGÈNESI Regulació meiosi abans de la GVBD: Control de la meiosi abans d’adquirir la competència meiòtica Les cèls entren en meiosi per acció del àcid retinoic, que es secretat per les FC (somàtiques). L’ÀR indueix l’expressió del gen STRA 8, que indueix meiosi. Per tant, el que indueix la meiosi és l’ambient (ecological niche). Les condicions ambientals de l’oogoni són molt importants. Aquest procés és el mateix que en el mascle, però en aquest cas hi ha un enzim que elimina l’àcid retinoic i per tant no poden entrar en meiosi.
L’oogoni s’atura al dictiotè, aquest pas està controlat per ciclines que controlen el cicle cel·lular, concretament CyB que, combinat amb CDK1 (=cdc2), produeix MPF (M phase promoting factor).
Quan la [MPF] és elevada, la cèl està en fase M. Aquestes cels (GV) estan parades en profase (baixa activitat de la MPF).
Quan cdc2 està fosforilada per acció de Myt1, la MPF està inactiva i quan la cdc25 es defosforila, la MPF estarà activada. Cdc25 està controlada per PKA i PKA està controlada per cAMP. Per tant, a més cAMP, més activitat de PKA, més fosforilació de Cdc25 i MPF s’inactiva.
El que controla aquesta aturada en la meiosi són les CF, ja que estableixen gap juntion amb l’oocit.
3 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Hi han dos hipòtesi sobre com controlen aquest procés: si agafem un oòcit lliure de CF, l’oòcit torna a fer meiosi.
1. L’oòcit no produeix el cAMP però sí les FC i a través d’aquestes gap juntions, passen el cAMP a l’oocit.
2. El cAMP es produït per l’oòcit, controlat per un GPCR . Aquest receptor produeix cAMP. Les FC són les que controlen el procés; en aquest cas produeixen el senyal que activa aquest receptor.
L’altre possibilitat és que aquest receptor sigui constitutivament actiu i l’oòcit sempre està produint cAMP.
Finalment, l’oòcit adquirirà competència meiòtica. Hi han dos hipòtesi: 1. Apareix quan l’antre de l’oocit apareix.
2. Apareix per sumació de processos. L’oocit ha crescut suficient per tenir competència meiòtica.
Control de la meiosi en oòcits competents - Control exogen Endogen La disminució del cAMP provoca disminució de PKA, s’activa MPF i es produeix GVBD (germinal vesicle breakdown).
Hi han dues hipòtesi: 1. L’augment de LH indueix la represa de la meiosi. L’oocit no té receptor per LH però sí les FC així que les FC responen a l’augment de [LH]. S’activen MAPK que indueixen la fosforilació de Cx43 (connexons) i això produeix la represa de la meiosi pq es tanquen les gap juntions (disruption of ovarian gap-juntional comunication). La [cAMP] disminueix i augmenta la de MPF.
2. No hi ha activitat de GPCR pq les FC no produeixen cAMP. L’altre hipòtesi es que el receptor està actiu constitutivament i les FC produeixen un inhibidor, minvant l’activitat dels receptors.
El Ca++ activa fosfodiesterases.
Probablement, són diferent vies les que fan això.
Si l’oocit està en metafase II, tenim alts nivells de MPF durant l’ovulació. L’activitat de les MAPK augmenta després del GVBD.
L’oocit ha de mantenir elevada l’activitat del MPF, ho pot fer de dues maneres: 1. MAPK (wee) fosforil·la Myt1, la inactiva i MPF s’activa.
4 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial 2. Per mantenir elevada la activitat de MPF necessitem molta [MPF] i tenir-lo activat  s’aconsegueix per APC (anaphase promoting complex). L’APC afegeix ubiquitina a CyB; la CyB anirà al proteosoma i s’eliminarà  MPF actiu.
Ara, tenim un oòcit aturat a metafase II. Els nivells de MAPK i MPF cauen.
CONTROL HORMONAL DE L’OOGÈNESI Eix hipotàlem – hipòfisi: l’hipotàlem genera GnRH (hormona alliberadora de gonadotropina) que controla la síntesi de FSH i LH per part de la hipòfisi.
L’FSH estimula el creixement del fol·licle; si els nivells de FSH son elevats, el fol·licle i l’oòcit creixen.
Les cèls fol·liculars (CF), quan es produeix el creixement del fol·licle comencen a sintetitzar estradiol. El creixement del oòcit tb es produeix per creixement de les CF; per tant, el nivell d’estradiol quan va madurant la cèl va pujant. L’estradiol fa fb + o – en funció del seu nivell sobre l’FSH. Si el fb és – cau l’FSH i haurà dominància. A partir d’un cert temps i un cert nivell elevat d’estradiol, es dispara l’FSH (fb +) i això ve acompanyat amb el pic de LH.
LH fa que es produeixi l’ovulació. Les CF sota l’estímul de LH no sintetitzen estradiol i comencen a sintetitzar progesterona, que tindrà fb – sobre l’FSH i LH.
Si es produeix l’implantació, l’embrió sintetitza hCG (human corionic gonadotropin). La hCG estimula el cos luti (acció equivalent a la LH) i té fb – sobre la producció de FSH i LH (la dona deixa d’ovular).
Com canvia al llarg del cicle menstrual? El cicle comença amb la menstruació, en quest moment la [FSH] és elevada i permet el reclutament del oòcits; comencen a créixer i a sintetitzar-se estradiol (fb – del FSH). L’ FSH comença a disminuir; els oòcits que creixin ara no trobaran nivells adequats de FSH i moriran; al final només un d’ells serà ovulat (dominància).
L’estradiol va pujant pq cada vegada hi ha més CF; quan arriba a l’antre, el nivell d’estradiol és màxim i el fb passa a ser +. El nivell d’estradiol dispara un pic de FSH, que coincideix amb el pic de LH  es produeix l’ovulació. Com que es produeix l’ovulació, les CF passen a sintetitzar progesterona i no estradiol. La PGE fa fb – cap a la FSH i LH (caiguda dels nivells).
Tots els oòcits que ara entrin a créixer trobaran nivells baixos de FSH i no podran créixer GAMETOGÈNESI MASCULINA Autoaprenentatge 5 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial EFICIÈNCIA DE L'ESPERMATOGÈNESI Cada espermatozoide madur és un germà en una família gran, derivat d'un espermatogoni tipus A patern. La família és gran a causa del nombre de mitosis premeiotiques i els espermatozoides són només germans no bessons idèntics perquè la formació del quiasme meiòtic s'assegura que cada un és genèticament únic.
Un cop produïts els Z, aquests han d’experimentar una sèrie de canvis per adquirir la capacitat per fecundar. Es produeix un procés amb 2 fases antagòniques: - Maduració: prepara els Z per adquirir la capacitat per fecundar; té lloc en el tracte genital masculí.
Capacitació: capacitat per fecundar. En el tracte genital femení.
Aquests dos processos controlen en quin moment l’espermatozoide es dispondrà a penetrar l’oòcit (això és quan l’oocit estigui davant sinó, morirà).
MADURACIÓ Canvis que experimenta Z a lo llarg del tracte genital masculí.
On té lloc? Epididim. Els conductes aferents s’ajunten formant un de sòl, formant l’epididim. Els Z surten pel conducte eferent.
Composició del fluid epedidimal: és molt dens pq té moltes proteïnes, ph àcid (6.5).
Els Z són immòbils fins que arriba l’ejaculació: Moviment pel llarg de l’epididim: entren cap a l’epididim pq en el rete testis hi ha un moviment ciliar que els empeny per l’epiteli i tb hi ha petites contraccions peristàltiques. Dins l’epidídim es mouen pq hi ha una pressió hidrostàtica: a l’entrada de l’epididim hi ha una síntesi més gran de fluid que a la cua (l’altre punta). El conducte de l’epididim tb té cilis que empenyen els Z. Finalment, en el moment de l’ejaculació apareixen contraccions peristàltiques.
Aquest temps de permanència en l’epididim depèn del temps que triga en ejacular. De mitjana, els Z estan 2 – 14 dies. Els espermatozoides, mentre transiten per l’epididim maduren.
Funció epididim: madurar els Z. Tb actua com un reservori; actua protegint els Z i que tinguin la millor qualitat possible, protegir-los d’ells mateixos ja que hi han tants Z allà dins amb una elevada activitat metabòlica que generen moltes ROS que són molt oxidants. L’epididim sintetitza glutatió, que segresta ROS.
Els Z tenen molts enzims proteolítics; si l’acrosoma es trenca s’alliberen aquest enzims. L’epididim secreta.... per controlar la proteòlisi.
Funcionalitat de la maduració 6 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Adquisició de tot allò que sigui necessari per penetrar l’oocit Proporcionar a l’Z la capacitat de progressió cap endavant: l’Z quan surt del testicle només mou la cua i dp de l’epididim pot avançar en línia recta Evitar la reacció acrosòmica a destemps. La RA és l’alliberament dels enzims. Si no es produeix davant de l’oocit és perillós pels altres Z. L’Z interactua amb molts tipus de cèls i s’ha de bloquejar l’Z.
Canvis z - - - - - Morfològics: en el testicle durant l’espermiogenesis i acaben de completar-se en l’epididim. Pèrdua de la gota citoplasmatica: conté el cyt i orgànuls que sobren. Té lloc en l’epididim Químic: pèrdua de fosfolípids i chol. Això canvia la fluïdesa de la mb. Important per la RA En la mb: importants sobretot a nivell de prots. Si nosaltres fem un gel d’electroforesi i mirem les prots de l’Z en el cap i cua de l’epididim, veiem un canvi brutal.
Hi ha poca traducció (DNA compactat), no hi ha ribosomes... hi ha molt poques prots que se sintetitzin de novo, les poques que apareixen provenen de l’Z. Algunes no són producte de la traducció sinó modificacions post traduccionals que tenen lloc in situ en la mb pels enzims que sintetitza l’epididim i que modifiquen les prots i lipids de la mb.
Un d’aquests enzims té a veure amb la composició amb oligosacràrids units a prots i glicolipids, de manera que durant el transit en l’epididim hi ha una adició de residus d’àcid siàlic la qual genera una carrega –. L’ÀS dificulta que el tracte genital femení ataqui els Z; tb es una mesura per avaluar el grau de capacitació del Z per fecundar l’oòcit.
Tapar prots amb molècules secretades per l’epididim. P.e, el lactosaminoglicà s’uneix a prots de mb del Z (galtasa) i les bloqueja. Per tant, no poden interaccionar amb altres cèls que hi hagi pel camí.
Altres bloquegen sistemes de senyalització (canals Ca++) L’Z va adquirint algunes d’aquestes prots, que serviran per reconèixer la zona pel·lúcida i tb la mb de l’oocit i unir – se.
Canvis en la cromatina. Està altament condensada. Les protamines interaccionen molt fortament amb el DNA. Aquestes protamines, durant la maduració, estableixen ponts disulfur entre elles  cromatina més condensada / protecció dna Canvis en la motilitat. Tenen a veure amb la capacitat de fer aquesta mobilitat. Quan l’Z entra a l’epididim dona voltes sobre ell mateix i quan surt va en línia recta. Tb hi ha un canvi en la quantitat de mobilitat. Aquests canvis estan associats a canvis en el ph i en la [cAMP]. [cAMP] augmenta activació PKA  fosforil·la els braços de dimerina dels microtúbuls (és ATPasa)  augmenta activitat ATPasa i la cua es mou més activament El Ca++, a través de la calmodulina, s’equilibra amb la concentració de cAMP Els canvis qualitatius (moviment en linea recta) és gràcies a FMP (forward motility protein). Aquesta prot canvia l’Z.
Altres canvis 7 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial - - Modulació de la incorporació del Ca++: durant l’estada en l’epididim hi ha moltes prots en la superfície i transportadors de Ca++ per evitar l’influx de Ca++ dins el citoplasma de l’Z (pq provocaria la reacció acrosòmica) Modificacions del metabolisme: d’aeròbic a anabòlic.
Ponts disulfur entre prots de les estructures dels microtúbuls que hi ha a la cua del Z. Això evita que el Z perdi la cua, formen una unió forta amb el cap.
Tenim un emmagatzematge de Z i ara han de sortir.
EJACULACIÓ ERECCIÓ: ppal causa d’infertilitat. Durant la sexual arousal (excitació) hi ha erecció però tb pot passar en la fase REM del somni; podem distingir les causes de disfuncions erèctils (psicològics o fisiològics). Si durant el somni apareix erecció, la disfunció és de causa psicològica.
L’erecció comença quan el SN parasimpàtic envia senyals a les cèls endotelials de les arteries cavernoses i activen la síntesi d’òxid nitric (NO és un gas i pot entrar a les cèls musculars llises). El NO augmenta al [cGMP] i aquest activa la dilatació de les artèries, hi haurà més flux i en conseqüència la corpora cavernosa s’inunda de sang. Tb es descomprimeix la beina, la sang es manté a dins.
Corpus esponjós evita que uretra/vasos eferents es col·lapsi ja que d’aquí sortiran els Z.
Sildenafile (viagra) redueix la [cGMPPDE].
El SN envia transmissors i es produeix la contracció dels vasos eferents i la sortida de Z GLÀNDULES: Pròstata, vesícules seminals i glàndules de Cowper o bulbouretrals. Produeixen secrecions que es barregen amb l’Z.
- Fases ejaculació: Secreció de focus gland(?): va a l’uretra per eliminar tots els Z que hi ha d’ ejaculacions prèvies; tb lubrica.
Prostate gland i epididim: magatzem de Z i barreja amb la secreció de la pròstata. La secreció de la pròstata té un 30% del total de la quantitat de semen I l’epididim conté 5% del contingut del semen.
La pròstata produeix Zn, important per condensar encara més el DNA del Z, tb és bactericida i és útil per controlar la flora vaginal (bacts, fongs...). Tb produeix Mg, que augmenta el pH del semen fins 8 – 8’5; serveix per neutralitzar l’ambient àcid de la vagina.
Enzims proteolítics de la pròstata: s’usen per passar el fibrinogen a fibrina. El fibrinogen prové de les vesícules seminals. La fibrina produeix l’aspecte mucós del semen. La pròstata tb produeix 8 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial fibrinolysine, que destrueix la fibrina i així l’Z no queda atrapat en la xarxa densa de fibrina que es forma. Això és en humans.
La pròstata tb produeix prostaglandines que protegeixen l’esperma reduint l’activitat del SI de la femella.
La tercera fracció pertany a les vesícules seminals (16 – 17%): produeixen fructosa. La oxidació de la fructosa produeix l’olor característic del semen. La fructosa serveix com a font d’energia. Tb produeix fibrinogen.
Hi ha dos glàndules de Cowper en l’epiteli de la uretra que produeixen secreció per lubricar el pas del Z.
Glàndules prepucials (o de Tyson): són glàndules que estan en les glàndules; en humans són vestigials. En altres animals produeixen feromones.
Canvis en els z: Nucli: formació de pont disulfur per estabilitzar el DNA Adició de característiques antigèniques: hi han algunes prots, polisacàrids que s’uneixen a la superfície del Z. P.e: espermadhesines, ajuden al Z a unir-se a les cèls epitelials del oviducte, un pas crucial del procés de capacitació. Un 25% de les prots de la superfície del Z són unides durant l’ejaculació.
Adició de substàncies descapacitants: durant el transit al tracte genital femení inhibeixen la reacció acrosòmica. Aquestes molècules són Caltrine (Ca++ transport inhibitor protein) i Calcemine.
Mantenen la [Ca++] el més baixa possible. Calcemine indueix Ca ATPase, que bombeja Ca++ fora del Z. L’ATPasa es troba a la cua del Z.
Funcions dels fluids seminals: - Subministren energia als Z Enzims que regulen l’activitat del Z Proporciona la capacitat d’evitar la reacció acromàtica Estratègies que eviten la flora vaginal Diluir l’esperma. Els Z comencen a moure’s en l’etapa de l’ejaculació TRANSPORT DELS GÀMETES Captació de l’oòcit per l’ifundibulum 9 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial La fecundació es produeix dins els conductes oocitaris. Hi ha sp que l’ovari(?) està tancat dins d’una bossa. En humans, hi ha 3 estructures dins la cavitat ovàrica.
L’oòcit s’ha d’implantar en el peritoneu; ha de sortir del fol·licle. ?? L’ infundibulum té forma d’embut. L’ovari està unit al úter però es pot moure i això alinea el fol·licle al infundibulum. L’infundibulum té cilis que produeixen un influx de líquid. L’oòcit + cummulus entra a l’infundibulum per l’influx de líquid. Tb hi ha interacció entre CF i cèls epitelials del infundibulum.
Trompes de fal·lopi, Ampulla...
Els Z van pel camí contrari Transport i interacció de l’z pel tracte genital femení El tracte genital femení està estructurat: vagina, cervix (o coll de l’úter), úter (gran endometri), dos oviductes (trompes fal·lopi), unió uterotubal, ampulla...
El transport dels Z al llarg del tracte genital femení és com una mena de carrera.
Eventualment els Z són dipositats en la vagina, s’observa un transport ràpid en el qual els Z molt ràpidament van a l’oviducte (en 10 min). La velocitat a la que es desplaça un Z no pot recórrer aquesta distància, són empesos per una estructura que apareix en l’uter i l’oviducte que estiren l’Z cap el lloc de la fecundació. Els 1rs que arriben no estan preparats per fecundar. El transport ràpid causa una gran mort als Z, no es massa clar el perquè. Lo important es transportar senyals químiques que indiquin que s’ha produït un coit (hipòtesi). Els altres Z tindran la capacitat de fecundar. El seu transport és com una carrera per etapes: van avançant per dif espais del tracte genital, van experimentant una sèrie de canvis i es van preparant per fecundar.
Quantitat de Z a cada espai: Vagina 10^7 – 10^8. Alguns d’ells aconseguiran anar al cervix i arribar a l’úter. A l’uter trobem 10 ^4. A nivell del oviducte, al començament  10^2 – 10^3. Ampul·la (es troba cummulus – oocit)  centenar 10^2. Superfície de la zona pel·lúcida  unes desenes 10^1 Aquesta disminució i selecció es un esdeveniment que no té lloc en una fecundació in vitro.
S’elimina la selecció, s’usen 10^5 Z.
Què passa en cada espai? Cèrvix: té moc cervical, amb un 90% d’aigua. Els Z que entren allà, s’escapen de l’ambient hostil de la vagina. El cervix té tot una sèrie de criptes en les quals els Z es poden quedar durant un temps(fins 80h dp del coit). En el cervix hi ha una pèrdua de vitamina E (és un scavenger) i exposa als Z a [ROS] més elevades i els Z que no estan del tot bé acaben morint. En alguns humans, el moc cervical porta Ac contra la parella, entre ells són incompatibles.
10 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Úter: hi ha un mecanisme de selecció d’aquests Z que estiguin capacitats, com la pèrdua d’àcid sialic. Els que han perdut massa ÀS són detectats per la sialic acid binding protein i són eliminats.
Segueixen pujant per l’uter.
Les dones ovulen alternativament en 1 ovari en cada cicle, els Z s’han de dirigir al conducte on hi hagi l’oocit. Hi ha una tendència a que els Z vagin a l’oviducte on hi ha l’oocit (quimiotaxis). El que els guia és un gradient de progesterona més elevat. La progesterona es sintetitzada per les cèls corpusculars (allà hi haurà l’oòcit).
Oviducte: es produeixen els canvis més importants. Els Z interaccionen amb les cèls epitelials de l’oviducte. Durant l’ejaculació, les espermadhesines permeten la interacció entre Z – oviducte transitòriament. Durant aquesta interacció, la capacitació avança. Les cèls de l’oviducte són ciliades, i fan com si raspessin el cap del Z. La motilitat dels Z es redueix.
Es posaran a avançar quan arribi el senyal de que s’ha produït ovulació. Durant l’ovulació s’alliberen glicoconjugats que mimetitzen els receptors de les cèls epitelials i s’estableix un mecanisme de competició; els Z es desenganxen de les cèls epitelials. A més, hi ha un increment del ratio Na/K sobretot en l’ampul·la després de l’ovulació, això farà que els Z reprenguin la motilitat (hiperactivació: moviment frenètic de la cua). Només els Z que estiguin correctament capacitats.
Cummulus: acabarà de capacitar els Z ja que és ric en progesterona.
CAPACITACIÓ Canvis que experimenta l’Z al llarg del tracte genital femení. És antagònic a la maduració (aquest evita la reacció acrosòmica, la capacitació l’estimula).
Aparició de hiperactivació Exposa tota una sèrie de receptor que reconeixerà la zona pel·lúcida i la mb de l’oocit. La maduració tapa aquests receptors pq no responguin.
On té lloc? En el tracte genital femení. Comença en el cèrvix. Els Z no necessiten del tracte genital femení per ser capacitats, aquest procés es pot fer in vitro. La maduració es en el tracte genital masculí.
Durada: depèn de l’estat fisiològic dels Z i del tracte genital femení. Serà més ràpida al voltant del moment d’ovulació Mecanismes moleculars Un dels esdeveniments bàsics és la pèrdua de colesterol de la membrana (BSA: albúmina seca bovina). L’albúmina s’endu el colesterol. Això desestabilitza la membrana, important per fer la reacció acrosòmica, que implica la fusió de la mb externa (mb plasmàticaacrosomainterna) del Z amb la del acrosoma per alliberar el contingut del nucli.
11 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Durant la capacitació hi ha la pèrdua de bloquejadors de mb. P.e: pèrdua del receptor de la progesterona. Aquests receptor poden ser tipus A si responen a progesterona i introdueixen Ca++ (augment pH) i els tipus C que controlen els canals de bicarbonat.
- Via del bicarbonat: Cotransport amb el gradient de Na. Entra i activa una adenilat ciclasa bicarbonat dependent.
L’adenilat ciclasa agafa ATP i sintetitza cAMP cAMP activa PKA PKA fosforila proteïnes com flipases, que canvien de cara determinats fosfolípids de mb i això provoca una desestabilització de la mb, una cara es fa més fosfogenica (inestable). La PKA, a través de cascada de MAPK fosforila la PLC que transforma el PIP2 en diacilglicerid i IP3. La PLC té com a substrat el PIP2 de la mb (ha d’estar associat a la mb). Per tant, la PKA fosforila la PLC i la PLC s’associa a la mb i es prepara per desencadenar el senyal; quan li arribi l’estímul es posarà en marxa.
La PKA tb fosforil·la la PLD1 que hidrolitza la fosfatildicolina en colina i àcid fosfatídic (PA). PA converteix l’actina globular en actina filamentosa. Això és molt important pq aquests filaments d’actina es polimeritzen entre mb plasmàtica i mb externa de l’acrosoma. L’actina evita que aquestes mb no s’acostin ni es fusionin fins que arribi l’hora.
- Via del Ca++ : L’increment de Ca per l’entrada de bicarbonat provoca la sortida de H+ s’incrementa el pH.
L’increment del pH, obre els canals de K i el K surt de la cèl  pèrdua de càrregues positives (es com si guanyéssim carregues –) hiperpolarització mb (es torna més electronegatiu). La hiperpolarització fa que els canals del Ca++ adoptin una estructura tridimensional de manera que la seva energia d’activació baixa. S’està preparant el canal del Ca pq quan arribi l’estímul adequat s’obrin.
L’augment del cAMP i del Ca++ provoca un increment de la motilitat pq hi ha un increment del Na que entra amb el HCO3. El cAMP fosforila els braços de dineina ...... augment motilitat Membrana - Canvis en la composició de proteïnes Al final de la capacitació sembla com si algunes prots de l’acromosma vagin cap a la mb. Per tant, algunes prots provenen d’aquí. Les altres prots del Z provenen de canvis de proteïnes que estaven ocluides i que ara són exposades.
El que provoca es que es produeix una major mobilitat en la difusió lateral d’aquestes prots. La difusió lateral genera regions de la mb lliures de prots, en aquestes regions és on s’iniciarà la fusió de les membranes (plasmatica – mb externa).
- Lípids 12 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Canvis en la composició en las dues cares de la mb, es fa més propensa a fusionar-se amb la mb externa. Aquests canvis se situen especialment a la regió apical del cap del Z. I no es fa en la regió post acrosòmica.
Els Z estan dissenyats pq la seva mb es torni més fluida en el tracte genital femení. Els fosfolípids tenen una transició de fases a 37º (canvi de sòlid a líquid a 37º). Els Z en els testicles i l’ epididim estan al voltant de 30 – 33º, la mb del Z en el tracte genital masculí és menys fluida. Quan la Tª puja la mb es torna més fluida i això facilita la fusió.
- Carrega neta L’àcid siàlic desapareix i s’elimina la carrega negativa. Això facilita la interacció de la mb del Z amb altres mb cel·lulars.
Modificacions en el patró de moviment flagelar Hiperactivació: lligada al increment de [cAMP]. La hiperactivació té varis objectius: 1r, es produeix dp de l’ovulació pq els Z avancin ràpid per trobar l’oòcit a l’oviducte. 2n, permet agitar el medi, que fa que les fonts energètiques (glucosa) es renovin amb facilitat. 3r, s’incrementa el coeficient de penetració hidràulica i fa que sigui més fàcil penetrar a les cobertes oocitaries.
Finalment, també incrementa la probabilitat de que els Z es trobin amb l’oocit ja que la hiperactivació a part de provocar l’avançament també augmenta l’estela (es mouen d’un costat a l’altre) que deixa al moure’s.
Exposició de R de mb Dos tipus de receptors: Un que dispari la reacció acrosòmica i els altes que reconeixien l’oòcit.
Els R s’uneixen a les galactosiltransferases que permetrà el reconeixement de l’oocit.????? Canvis en el nucli El Zn+ desapareix del nucli i per tant, la cromatina comença a relaxar–se.
Siginfitcat biologic de la capacitació La capacitació només està descrita en mamífers.
Té a veure amb el desenvolupament de les cobertes oocitaries. En els mamífers, aquest creixement és important: l’oocit està envoltat d’una zona pel·lúcida i de cummulus.
L’embrió ha d’estar protegit dins d’aquestes cobertes per no ser atacat pel sistema immunitari femení.
13 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Amb l’aparició d’aquestes cobertes, l’Z ho té més difícil per entrar. Ha de fer la reacció acrosòmica, que són letals per l’Z si es fa abans d’hora o no fecunda.
Factors capacitants i decapacitants Capacitants: són els d’origen femení. Presencia de cummulus, progesterona, albúmina, àcid hialuronic, heparina, aminoàcids com la taurina...
Decapacitants: són els d’origen masculí. Líquid seminal...
REACCIÓ ACROSÒMICA Acrosoma: És un grànul de secreció, deriva del reticle endoplasmàtic. Dins té una gran quantitat d’enzims com proteïnases, peptidases, glicosilases, lipases, fosfatases... Uns tenen gran importància i altres són residuals.
- Acrosina: proteïna més freqüent de l’acrosoma. És una endopeptidasa molt semblant a la tripsina pancreàtica (mateixos inhibidors). Està en forma de proenzim, no activades. Entre 70 – 90% de les molècules d’acrosina estan en forma de proacrosina; la resta està inactivada pq l’acrosoma té un pH àcid i l’acrosina es funcional a pH bàsic.
El pas de proacrosina a acrosina implica una autocatalisi, es trenca. Fa una reacció en cadena activant la resta d’acrosina.
Es troba en 3 llocs: fora de la mb del Z, en la matriu del acrosoma (està organitzat i té la funció de dispersar el contingut de l’acrosoma) i associada a la mb interna del acrosoma (IAM) que permetrà que el Z travessi la zona pel·lucida.
- Hialorunidasa: trenca l’àcid hialurònic. És important perquè quan es produeix l’expansió del cummuls es degut al àcid hialuronic que fa una mena de xarxa. El Z quan atravessa el cummulus es troba aquesta xarxa. Però la hialuronidasa permet que el Z atravessi més fàcilment el cummulus disgregant aquesta xarxa. Pot haver-hi hialuronidasa dins l’acrosoma o en la mb. La que està fora lubrica l’Z i l’ajuda a passar per el cummulus.
La primera fase és la vesiculació, que és la fusió de la mb externa del acrosoma amb la interna del Z.
Simultàniament, hi ha una dispersió del contingut de l’acrosoma. Un cop s’ha produït la dispersió dels enzims, es produeix un canvi en el cap del Z: la mb plasmatica ja no és la més externa, és la mb interna del acrosoma. Fantasma acrosòmic: ........... es queda enganxat a la superficie de la zona pel·lúcida.
Control i inducció de la RA - Control ambiental: és la capacitació Inducció: 14 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial En el tracte genital femení: és la zona pel·lúcida, que està composta de glicoproteïnes, en ratolins ZP 1, 2 i 3; en humans hi ha una 4ta. La R.A serà disparada per la ZP3. Hi participen la fracció proteica i els oligosacàrdis.
En l’espermatozoide: intervenen els receptors de la mb. Com a mínim hi intervé la Galactosiltransferasa (GalTasa). Quan arribi a la superfície de la zona pel·lúcida interaccionarà amb la ZP3; el Z ha de reconèixer la zona pel·lúcida de la seva espècie. Aquest reconeixement es fa entre GalTasa i els oligosacàrids del ZP3 (=ZPC). La galtasa llegeix els monòmers dels oligosacàrids (seq única per cada sp). La galtasa agafa la galactosa i el transfereix en aquesta cadena de sucres. Però com que en el medi no hi ha galactosa, la reacció enzimatica queda bloquejada i l’enzim es queda enganxat als oligosacàrids del ZP3.
La proteïna en si, té una estructura que provoca la oligomerització d’uns receptors de la mb del Z amb activitat tirosinkinasa. Fan una fosforil·lació creuada dels receptors  dispara el senyal Durant la capacitació, els receptors estan bloquejats.
En el fons, qui dispara la R.A és la ZP3.
Surten H+ per acció de la progesterona, s’incrementa el pH i s’obren els canals de Ca++. Al final qui acaba produint aquest canvis durant la R.A és l’entrada del Ca++.
En humans, la ZP4 també intervé en l’activació de la R.A. Podria activar la PLC.
Tot acaba conduint al mateix, a l’entrada massiva de Ca++ La PLC s’enganxa a la mb però no s’activa fins que hi hagi la R.A. la PLC dispara l’augment de [Ca++].
(DAG  PKC....). IP3 allibera Ca++ dels reservoris intracel·lulars de la mb ja que quasi no té RE.
A través d’aquesta via es CICR (calcium induce calcium release): alliberament de Ca++ induït per Ca++. La sortida de Ca++ provoca que s’alliberi més Ca++.
Hem de treure els microfilaments d’actina presents entre les dues membranes. L’increment de Ca++ activa PLC que allibera més Ca++. La pujada de [Ca++] despolimeritza l’actina  R.A (les mb es fusionen) El Ca++ neutralitza les càrregues negatives dels fosfolípids  les mb s’acosten més El Ca++ interacciona amb determinats fosfolípids que desestabilitzen la mb. Generació de micel·les, es forma vesiculació i fusió de la mb.
ATPasa Mg-depenent és inhibida pel Ca++, això provoca l’entrada de H2O, l’acrosoma s’infla i provoca que les 2 mb s’acostin.
L’increment de pH a l’interior de l’acrosoma implica activació de l’acrosina  dispersió acrosoma 15 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial La fusió té lloc en la regió apical. S’ha de controlar que aquesta fusió de mb tingui un límit, per proteïnes de tethering. Reconeixen el destí dels grànuls que surten del Golgi. Hi ha 2, que són SNARE que són les encarregades de reconeixen que aquestes 2 mb s’han de fusionar, ajuden a mantenir-les enganxades i que es fusionin.
Increment pH  activació acrosina  expansió acrosoma / hidròlisi scafold.
L’acrosina és l’únic enzim que no s’allibera, es queda enganxada a la IAM (mb interna).
La regió del segment equatorial (debajo la apical) no es fusiona. L’estructura del segment equatorial és molt estable. Apareixen unes estructures proteiques que bloquegen aquesta regió.
Funcions RA - Alliberar aquests enzims pq el Z pugui penetrar a l’oòcit.
Exposar els enzims que estaven dins la mb interna, que seran els receptors secundaris (acrosina) que permetin l’unió a l’oòcit per la zona pel·lúcida.
Fa l’Z més punxegut, incrementa el coeficient de... hidràulica. Li serà més fàcil penetrar.
Té efecte en la regió post acrosòmica i equatorial, canviant l’expressió de receptors de mb.
La R.A té lloc en la superfície de la zona pel·lúcida. Però, d’alguna manera tènue, es genera abans.
2-. FECUNDACIÓ Dp de la maduració el cummulus s’expandeix, això és necessari pq el Z travessi la coberta oocitaria (?). Durant aquesta expansió hi ha alguns estats que apareixen entre les cèls del cummulus, àcid hialurònic. Forma una xarxa per on l’Z passi a través (~laberint) per arribar a l’oòcit. L’expansió del cummulus té una estructura que atrau l’Z fins el centre i que no es desviï. El condueixen fins al centre de l’oòcit. El cummulus té una elevada concentració de progesterona, necessària per capacitar l’Z.
Com travessa el cummulus? Gràcies al moviment de la cua del Z (hipermotilitat). Els Z tenen hialuronidasa en la superfície que lubrica el pas del Z.
Finalment, l’Z arriba a la zona pel·lúcida on hi té lloc la R.A. El cummulus selecciona els Z que han tingut R.A massa d’hora, es queden atrapats als cummulus.
En la zona pel·lúcida hi ha la 1ª unió, interacció entre superfície Z i Z.P unió dèbil (attachment). És inespecífica. Z d’altres d’sp poden interaccionar amb aquest oòcit.
L’estructura de la Z.P conté ZP1, 2, 3 i 4. En la part externa hi ha molt àcid hialuronic i progesterona.
Aquestes molec col·laboren amb el 1r contacte.
16 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Reconeixement Z – Z.P específica: 2n contacte, unió forta (binding). GalTasa reconeix l’ÀH de ZP3.
Dp del 2n contacte hi té lloc la R.A; hi un a canvi en els receptors; abans la galtasa interaccionava amb la ZP3. Canvia i la acrosina s’uneix a ZP2.
MECANISME DE PENETRACIÓ DE LES COBERTES - Model tradicional: la R.A allibera enzims que produeixen un forat a la Z.P per on passarà el Z a través. Però en microscopi electrònic mai hem vist aquesta imatge. La Z.P està completament unida al Z.
L’altre model proposa que el Z perfora un forat en la Z.P produït pel moviment de la cua. Empuxa i fa camí a través de la Z.P. Per què el Z té enzims llavors? El moviment és necessari per travessar la Z.P.
Un altre model es basa en que es com una cremallera (belcro): la acrosina interacciona amb ZP2 i dp l’acrosina trenca la ZP2; l’acrosina que queda lliure es torna a unir a un altre ZP2 i torna a fer el mateix cicle (REPASAR). No es produeix forat. Llavors per què a l’acrosoma hi ha hialuronidasa? Per trencar l’ÀH de la Z.P El cap del Z arriba al espai perivitel·lí i s’estableix el 1r contacte amb la mb de l’oòcit (amb l’inner acrosome mb i el seu receptor anomenat cyritestin).
El cap del Z es posa en la superfície del oòcit. Dp la interacció del Z i l’oòcit serà en el segment epitelial del òocit (microvilli) i la regió postacrosoma del Z. Això és gràcies a la presència de receptors del Z i de l’oòcit.
Una vegada que el Z s’uneix a la mb de l’oòcit, la cua es continua movent, l’oòcit rodola per fer entrar la cua.
Els receptors del Z estan en la mb plasmàtica. Juno, en l’oòcit és un IgSF i és un receptor de folat.
Interacciona amb Izumo 1 del Z. Hi ha una forta especificitat. Hi ha oòcits que accepten qualsevol tipus de Z d’altres sp. Probablement aquest R han sigut seleccionats al llarg de l’evolució.
Dp del reconeixement, s’han de fusionar les mb. Cyritestin és de la família ADAM (dominis de desintegrina), reconeix integrines de la mb externa. Tenim fertilin alfa i beta (tb ADAM).
Segurament hi hagi més prots implicades. *Fertilines són prots que ajuden a la fusió de les mb*.
Fertilin es troba a la mb plasmàtica.
Reconeixement alfa / beta fertiline. Interaccionen. Alfa té un pèptid de fusió que empuxa la mb i no se que i tiren de la mb...... diapo 6 Finalment, les mb es fusionen. La cua del Z deixa de moure’s. El cap entra dins el citoplasma de l’oòcit, la mb nuclear del Z desapareix, els cromosomes es descondensen formant el nucli.
17 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial ACTIVACIÓ ZIGOT Aquests canvis inicien el desenvolupament embrionari. Tot això ve controlat per l’Z Inicialment, un oòcit no fecundat és relativament inert. Poca activitat, poc consum d’ATP; només per mantenir-se.
Quan es produeix la fecundació, augmenta el consum energètic  dispara el metabolisme del zigot.
Energia que serà utilitzada per fer tot una sèrie de canvis. Molts tenen lloc simultàniament.
El primer que es produeix és el blocatge de la polispèrmia, simultàniament és produeix la meiosi II femenina, el 3r esdeveniment és la formació dels pronuclis masculí i femení, simultàniament hi ha una mobilització de DNA paterns...
Què dispara aquests esdeveniments? El Ca++, com a 2n missatger, té una importància cabdal en aquests processos. Com canvien les [Ca++]: tenen oscil·lacions molt acusades. Aquest model és típic dels mamífers. La [ca] augmenta per acció del Z; l’Z té un isoenzim de la PLC, anomenada zeta(ζ) que és soluble en el cyt del Z. En el moment en que es fusionen les mb, la PLCz és alliberada a l’interior del zigot (cyt oòcit). La PLCz s’associa a la mb, agafa PIP3 formant DAG, que activa PKC que provocarà canvis en el desenvolupament del zigot. Tb forma IP3, que obre els canals de Ca++ del reservori intracel·lular. Primera pujada de Ca++.
La [ca++] torna a baixar per un oscil·lador acoblat als canvis de [K]. Dp de la penetració del Z hi ha una hiperpolarització de la mb de l’oòcit (es fa més electronegatiu) que es van produint en oscil·lacions de [K+] semblant a la del Ca++. En l’inici, el pot de mb de l’oocit comparat amb el de dp veiem que el potencial no es recupera del tot, hi ha un diferencial. Aquesta diferencia és el potencial de fecundació, que té un paper en la prevenció de la polispermia. Aquest canvi en el pot de mb del zigot respecte l’oòcit és una característica de totes les sp.
Hi ha una relació entre les oscil·lacions de Ca++, oscil·lacions del K i els canvis de pot de mb.
El Ca dels reservoris del RER que estan més propers del nucli és el que s’allibera, i a la zona on hi ha la fusió de mb. L’entrada del Ca obre els canals de K i el K se’n va fora (HIPERPOLARITZACIÓ, baixa el pot de mb, més electroneg). Simultàniament, aquest alliberament del Ca subcortical provoca un fenomen anomenat CICR (calcium induce calcium release), la pujada de Ca fa que reservoris més interns del Ca alliberin més calci, provocant una reacció en cadena. El punt on arriba l’Z es transmet a tot el cyt del zigot. El resultat final és que la [ca] puja ràpidament i s’exten. S’activa un mecanisme per baixar i restablir la [Ca].
La CaMKII (kinasa depenent de calmodulina) és un adaptador que a través de la calmodulina tradueix la [Ca] en una acció cel·lular, fosforil·la els receptor del IP3, genera un fb – que fa que els canals de Ca que responen a IP3 es tanquin. A més, al estar fosforil·lats alguns seran ubiquitinitzats i desapareixeran.
18 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial La pujada de Ca++ activa una ATPasa Ca-depenent que bombeja Ca fora del cyt, el treu fora la cèl o l’entra dins els reservoris. La [Ca] cau i els canals de K es tanquen. La Na/K ATPasa recupera la [Na]  guany de càrregues +, es recupera el pot de mb (DESPOLARITZACIÓ). La despol provoca l’obertura de CIDV de Ca i es tanca el cicle, torna a pujar la [Ca++] i lo mismo. Això es tradueix en pujades i baixades periòdiques de la [Ca++] El RE té un paper important, actua com a reservori. Si es buida, aquestes oscil·lacions s’aturen. Interaccionen amb canals de Ca extracels per recarregar els reservoris intracel de Ca Tot això s’acaba traduint en una acció cel·lular. Aquestes oscil·lacions acabaran aturant-se. Hi ha dues coses que l’aturen: 1r, els IP3R es van fosforil·lant, ubiquinitzant i desapareixent i la [Ca] serà menor, és una via de desensibilització de les cèls. L’altre és la PLCz, específic del Z, que té un senyal de localització cel·Lular. Quan hi ha una mb nuclear (senyalada per NLS), la PLC entra dins el nucli.
Mentre no hi ha mb nuclear, la PLCz està a cyt, provocant les oscil·lacions de Ca++. Quan es produeixin els pronuclis, la PLCz entrarà dins i es deixarà de produir Ca++. Quan es formen els pronuclis les oscil·lacions de Ca++ desapareixen.
La CaM K II és un dels ppals acobladors, que governarà a través de la calmodulina sobre la [Ca] i què s’ha de fer.
Esdeveniments - BLOCATGE DE LA POLISPERMIA Quan entri un Z s’evita l’entrada de més. Tb és important que això no passi abans d’hora pq sinó l’oòcit no serà fecundat.
Estratègies per evitar la polispermia: 1. Mantenir baix el nº de Z que arriben al lloc de la fecundació.
2. L’oòcit, immediatament dp de produir-se la fecundació, provoca la reacció cortical  s’alliberen els grànuls corticals. Modifica les característiques de les cobertes per evitar que un altre Z entri.
Aquí hi juga un paper la CaM KII, una kinasa de la cadena lleugera de la miosina i una proteïna de tethering (són prots que lliguen els orgànuls del citoesquelet, mantenen els grànuls fixos allà). La Cam KII fosforil·la les prots de tethering, es deslliguen i els grànuls corticals queden lliures del citoesquelet per tant, poden anar a la mb i fusionar-se. Què els hi acosta a la mb? La cadena lleugera de la miosina, fosforil·lada per la CaMKII. Es contrau amb més facilitat i els grànuls són transportats per la cadena lleugera fins la mb. Qui ho controla és una Synapsine – like; controla l’alliberament dels grànuls d’Ach en la mb presinàptica i puja la [Ca++], la synapsin-like fa que la mb dels grànuls corticals es fusionin amb la del zigot.
S’interpreta que la cèl té com una mena de comptador de les oscil·lacions de Ca++. El nº d’oscil·lacions té diferent acció. Acció del grànuls corticals: 19 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial - Reacció de la mb: la mb és fa menys fosfogènica. Serà més difícil que noves mb de nous Z es fusionin. La nova mb del zigot és una barreja de 3 mb (oòcit + Z + grànuls corticals) per tant, la composició canvia i impedeix la fusió de nous Z.
Canvis en l’espai perivitel·lí: en l’espai s’alliberen peroxidases que peroxiden les prots de nous Z, oxiden receptors necessaris per la fusió. Juno (R oòcit) es perd durant la reacció cortical. Els grànuls corticals tenen conjugats que s’enganxen els R dels Z impedint que es fusioni.
Hi ha sp en que aquest blocatge a nivell de mb és molt important i en altres sp no.
- Reacció de la ZP (ZR): la clau d’aquest canvi resideix en l’alliberament del grànuls corticals.
Dues estratègies: canvis que impedeixen que nous Z s’uneixin a la ZP i enduriment de la ZP (zona hardering) que dificulti el pas de nous Z a través de la ZP.
Canvis que redueixen l’unió de Z – ZP: el 1r reconeixement entre Z i ZP depen de la ZP3 de la Z.P, concretament dels oligosacàrids que configuren la ZP3. Entre els enzims dels grànuls hi ha glucosidases que modifiquen els oligosacàrids i generen ZP3f. De manera que quan nous Z arribin allà, es troben una ZP3 diferent, no la reconeixen com a pròpia i no s’uneixen.
Enduriment de la ZP: si nosaltres agafem oòcits i els posem en presència de tripsina, es requereix un temps per dissoldre la ZP. En canvi, si agafem un zigot, necessita més temps.
Els canvis que hi ha hagut es degut a les endopeptidases dels grànuls corticals que hidrolitzen la ZP2 formant ZP2f. La ZP2 té una estructura amb ponts disulfur entre ella mateixa i és més difícil de reconèixer per l’acrosina. La ZP és una barrera més infranquejable per part del Z.
- FORMACIÓ DELS PRONUCLIS I REPRESA DE LA MEIOSI FEMENINA FORMACIÓ PRONUCLIS Partim d’un oòcit aturat en metafase II i l’entrada del Z, les oscil·lacions de [Ca] seran les senyals que activin la represa de la meiosi femenina. Aquests dos pronuclis viatjaran cap al centre del zigot i el DNA experimentarà una fase S. Es formaran els cromosomes i hi haurà un alineament d’aquests en la placa metafàsica.
Pronucli femení: oòcit aturat en MII, hi ha activitat de la MAPK i MPF elevada. Quan s’ha produït la fecundació. El que dispara l’exclusió del 2n corpuscle és la APC a través de la CaMKII (tradueix les oscil·lacions del Ca++ en una acció cel·lular). La CaMKII fosforil·la la APC i l’activa, la APC ubiquinitza la ciclina B, aquesta es degradada en el proteosoma i la [MPF] cau. Això estarà acompanyat per una caiguda de l’activitat de la MAPK. La caiguda de l’activitat de la MPF provoca l’entrada en anafase. Es produeix l’exclusió del 2n corpuscle. Se separen les cromàtides en telofase, es descondensa en DNA i s’envolten d’una mb pronuclear i això generarà el pronucli femení i el DNA entrarà en fase S.
20 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Hi ha dos dissenys d’oòcits (ovelles i humans / ratolins), en humans la placa es paral·lela i en ratolins perpendicular a la mb. En ratolins, es produeix la migració (anafase) i es produeix un gir del fus es produeix l’exclusió del 2n corpuscle. En humans/ovella, aquest gir no es produeix pq el fus ja està orientat. Aquest gir està propiciat per l’associació dels microfilaments amb la placa metafàsica. Aquests filaments segueixen units als pronuclis durant la migració dels dos pronuclis cap el centre.
Què permet la formació del pronucli? La caiguda de l’activitat MAPK que indueix la formació dels pronuclis. Cau pq es fosforil·lada per una PKC. Hi ha una PKC Ca++ depenent. Les dues promouen la caiguda de la MAPK. La MAPK fosforil·la les lamines (prots que organitzen l’embolcall nuclear), les lamines no es poden reorganitzar i no formen la mb nuclear. A més, la MAPK fosforil·la la histona H1  el DNA està condensat en forma de cr. La caiguda de la MAPK permet que es descondensi.
Pronucli masculí: entra l’Z i desorganitza la mb nuclear del Z. L’oòcit té una activitat de la MAPK elevada. Quan es desorganitza la mb, en el cyt de l’oòcit hi ha una sèrie de prots que trenquen els ponts SS de les protamines (les protamines condensen el DNA). El DNA es comença a descondensar. Es torna a reorganitzar la mb nuclear del pronucli masculí i es descondensa el DNA del Z.
El zigot entra en fase S, el DNA femení i masculí. Les prots que acompanyen al DNA es perden (en el cas femení, les histones. En el masculí, les protamines). A l’hora d’organitzar la cromatina, s’hi posen histones maternes, substituint a les protamines.
REPROGRAMACIÓ EPIGENÈTICA DELS PN Les histones del pronucli masculí són acetilades per acció de HATs (acetiltransferases). Quan les histones estan acetilades confereixen al DNA una disposició oberta (s’uneixen factors de transcripció). En el pronucli femení les histones estan metilades (cromatina tancada). Hi ha una desacetilasa (HDAC) que metila el pronucli masculí per tant, la disposició oberta de la cromatina és transitòria), això s’anomena fase menor.
L’epigenètica tb té a veure amb la metilació del DNA (a part de la de les histones).
Metilació del DNA: Durant la formació dels gàmetes, l’imprinting canvia la senyalització. Els gàmetes d’origen patern són imprintats com femenins. Imprinting (metilació de GpC island  metila per decidir quins són materns i quins paterns.). Els gens imprintats, un cop produïda la fecundació, el seu senyal no canvia. Els gens no imprintats sí que canvien. En el pronucli masc hi ha desmetilases que desmetilen el DNA del pronucli masc, ***la metilació de les GpC island implica inactivació de gens (promotor metilat)***, quan el promotor està desmetilat el gen està activat. Les histones exposen el DNA i es troben amb gens actius  s’expressa el DNA patern. El DNA matern està metilat en menys grau, en el pronucli femení trobem cromatina no accessible i DNA metilat promotors silenciats. Diapo 29 21 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Dp, hi ha una desmetilació progressiva i passiva del DNA matern. El responsable d’això és DNMT1 (metilasa de manteniment), que copia el patró de metilació del DNA a les cèls filles. En el pronucli femení, la DNMT1 està en una [ ] limitant. En la 1ª divisió tindrem un DNA hemimetilat, i en la propera, només 1 de les 4 cèls estarà metilada, és una desmetilació passiva. En el pronucli masc la desmetilació és activa.
En la mòrula, és el punt on comença a haver-hi les 1res diferències, les cèls agafen diferents camins.
Les cèls tindran senyals de metilació i imprinting diferent. La senyalització epigenètica passa d’una senyalització gamètica a la totipotencia i dp somatica.
PKC és el responsable de la formació del corpuscle.
PKC tb és important pq indueix la expressió de oncògens com c-fos, c – myc, jun. Aquests són importants per mantenir l’embrió en divisió, estimulen la proliferació de les cèls.
ACTIVACIÓ METABÒLICA Està relacionada amb la pujada de [ADP].
És metabolisme anaeròbic (usen lactat).
1ª DIVISIÓ EMBRIONÀRIA Té lloc dp de que el pronuclis siguin al mig del cyt, la mb nuclear desapareix y el DNA es condensa en cromosomes, que s’ alineen en una placa metafàsica.
- Organització microtúbuls: És important per l’alineament dels cromosomes.
En el model del ratolí hi ha molts centrosomes pq els oòcits no tenen centríol. L’inici té lloc sense centriol (no perpendicular) dp de 5 – 6 dies. Està controlat pels centrosomes. Tenen molts MOC (microtubul organization centers) (flechas).
2 d’ells controlaran l’organització de la 1ª metafase (l’alineament dels cr). El centríol del Z no té cap rol en aquesta organització del fus.
En humans, veiem que el centríol proximal del Z contribueix en l’organització del fus ja que dp d’entrar en l’oòcit, aquest centríol proximal es divideix en 2, forma 2 MOCs i dp desapareix, organitzant un 1r fus metafàsic. **el centríol proximal del Z és el que forma la cua** Finalment, tindrem la primera divisió.
Tenim dos cèls embrionàries que estan connectades per un pont citoplasmic (citoplasmatic bridge), ple de microtúbuls. Al centre d’aquest contractil bridge....... aquest anell contràctil de miosina/actina es separarà al final.
22 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial 3-. DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI Embrió de ratolí. En la 1ª foto distingim els 2 PN, en la 2ª veiem les dues primeres cèls, 3ª es 4 cell stage, 8 cells stage.
Les divisions no sempre són sincròniques. El procés que sigui, acaba quan totes les cèls s’han dividit.
Aquestes cèls s’anomenen blastòmers.
Com podem veure aquí, l’embrió augmenta el nº de cèls sense augmentar el volum, el volum és el mateix. Per tant, el volum d’aquestes cèls disminueix. Això és pq l’embrió està dins la Z.P i no es pot expandir. El volum es redueix fins arribar al volum normal de les cèls somàtiques.
Durant aquest desenvolupament l’embrió no es comunica amb l’entorn matern. L’embrió viatja a través de l’oviducte (encara no es detecta).
Dp de la “8 cells stage” apareix la “16 cells stage” que s’anomena mòrula. En aquesta fase no podem distingir les cèls que té, s’unifiquen en unions compactes. Aquests procés és important pq comença a aparèixer la 1ª diferenciació. Fins aquí, totes les cèls són pluripotents, poden formar qualsevol òrgan. Apareix una capa externa que es convertirà en Trophectoderm (autocels) que formarà la placenta i les inner cells, que es convertiran en inner cells mass. Aquestes 2 capes estan separades, ja no es poden convertir en una altre i tindran dif destins.
Apareix una cavitat plena de líquid (cavitation process)  formarà els blastocists. L’embrió començarà a augmentar el volum; s’expandeix pq les cèls somàtiques aconsegueixen el volum final i la ZP es torna més prima fins el hatching process (eclosió)el blastocist forma un forat en la ZP i surt d’allà per implantar-se a l’úter (endometri). En aquest procés apareix el 1r epiteli, important pq l’ambient exterior és diferent de l’interior per tant, separa aquests medis diferents.
Durant aquestes últimes fases hi ha una comunicació propera de l’embrió i la mare.
METABOLISME Autoaprenentatge CONTROL DE L’EMBRIOGÈNESI 3 elements que controlen l’embriogènesi: - Informació genètica de la mare. S’emmagatzema a l’oòcit i durant el desenv embrionari controla aquest procés. No és l’expressió del DNA matern, és RNA i prots. Aquest acaba desapareixent.
23 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial - Expressió del genoma embrionari. Quan s’activi prendrà el control del desenv. Alguns d’aquests gens estan imprintats i expressaran dif coses depenent del teixit.
Epigenètica: hi ha moltes modificacions epigenètiques durant aquest desenv. Transmeten les decisions que s’han de prendre. Quan una cèl decideix convertir-se en un tipus cel·lular, aquesta informació es transmet a les altres cèlls. La pluripotencialitat desapareix quan el desenv s’està donant lloc.
Fase 1: els canvis no són dramàtics, només somàtics Fase 2: activació del genoma durant la 2 cell stage Fase 3: dif cel·lular. La decisió de què es convertirà és pren a la 4 cells stage Transició 1: materno-zigòtica. És el moment en el que es passa d’utilitzar el material emmagatzemat en l’oòcit i es passa a controlar per part del genoma embrionari. Elimina els mRNA i les prots d’origen matern. En aquest punt es produeix una reprogramació de manera que el genoma embrionari que té una estructura i senyalització de tipus gamètica passa a ser una estructuració més somàtica.
Transició 2: compactació. Produeix les 2 capes de la cell.
Transició 3: formació blastòcit.
Dp de la fecundació, el control del desenv embrionari es per mecanismes post traduccionals.
Aquestes acaben governant els canvis que tenen lloc. Això és així fins el moment en que s’estableix la 1ª placa metafàsica (preludi de la 1ª divisió). D’una forma paulatina es va modificant aquest control. Dp de la 1ª divisió embrionària passa a ser a nivell post transcripcional, hi ha una mobilització dels mRNA emmagatzemats en el cyt de l’oòcit i aquests controlaran els primers esdeveniments del desenv.
Control de l’expressió gènica Cua poli A: aquests mRNA emmagatzemats inicialment tenen una cua curta, de 90 Adenines, que passen a 150 (POLIADENILACIÓ DEL mRNA). Aquests mRNA seran traduïts.
Són mRNAs que tenen una seqüència anomenada CPE en la C- 3’, reconeguda per CPEB (binding prot) la qual es fosforil·lada per la CaMKII; quan hi ha les oscil·lacions de Ca. Quan s’uneix al DNA recluta una poliA polimerasa, que allarga la cua de poliA.
Relació cua poli A – traducció: la cua de poli A té relació amb la vida mitja del RNA. Tb té relació amb l’inici de la traducció pq la cua de poliA es reconeguda per la poly-A-binding protein, que s’uneixen a ella i recluten elements de l’inici de la traducció. Com més llarga és la cua, es recluten més fàcilment elements de la traducció i podrà començar abans. Les poliA binding prot mantenen unida la subunitat gran del ribosoma  relació directa longitud cua – inici traducció.
24 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial En un conjunt de mRNA es produeix un splicing. Alguns d’aquests mRNA s’emmagatzemen en forma de cRNA (transcrit primari) immadurs, que no es poden traduir. Quan es produeix l’splicing maduren i es poden traduir. És un mecanisme d’activació.
Una 3ª estratègia és segrestar RNAs que estan en forma de ribonucleoproteïna associada a elements del citoesquelet (no es pot traduir). Quan aquesta interacció es trenca, la riboNP s’allibera i es fa accessible la maquinaria traduccional. Es controla quins RNA es tradueixen.
Els RNA que són traduïts seran degradats. Tb hi ha una maquinaria regulada pels microRNA que senyalen quins mRNA materns han de ser degradats.
Tots aquests mecanismes de control de l’expressió aniran desapareixen i apareixerà el control embrionari.
(DIAPO 20) El mRNA matern arriba fins a l’estadi de blastomer.
L’expressió gènica comença amb l’expressió del pronucli masculí: estadi minor El genoma patern és activament desmetilat  té promotors hipometilats que permeten l’expressió dels gens.
Tenim el genoma del PN masculí obert i el DNA del PN femení està bloquejat. Aquest obertura fa que el genoma patern sigui + accessible als factors de transcripció  s’expressaran gens del PN masculí.
La majoria de RNA que són transcrits no es tradueixen (del PN masculí), durant l’estadi primerenc.
Podria estar relacionat amb imprinting o que aquesta expressió tan primerenca té a veure amb la supervivència de l’embrió. Els gens expressats en la fase menor regulen gens d’apoptosi.
**els oòcits, per defecte, entren en apoptosi. Els que són ovulats, si no són fecundats al cap d’un temps entren en apoptosi. El genoma del Z ha d’indicar a l’oòcit que s’ha produït fecundació; l’expressió del genoma patern indica que hi ha hagut fecundació i evita l’apoptosi de l’oòcit, permetent que s’iniciï el desenv embrionari.
Altres gens que s’expressen a l’inici són gens de determinació gonadal: Sry, Srx, ZFx. Per defecte, les gònades tenen sexe femení; en el moment en que es produeix la diferenciació de conductes de wolf o de Müller es controlat per aquests gens. Els embrions masculins es desenvolupen més ràpid que els femenins (per això en fecundacions in vitro neixen més nens, pq se seleccionen els embrions que creixen més ràpid).
Dp de la fase menor hi ha l’activació del genoma embrionari. Amb 2 cèls ja s’inicia l’expressió del genoma embrionari.
Els mecanismes de control són els clàssics de les cèls somàtiques.
25 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial En les 1res fases del desenv els gens TATAbox són els preferits per transcrits  són gens de housekeeping, manteniment. Funcionament bàsic.
Altres gens importants són els gens de pluripotència, TATAbox negatiu. P.e Oct 4, que és el gen de pluripotencia clàssic, està actiu en totes les cèls pluripotents i quan es van diferenciant disminueix.
**marcador de les cèls mare** OSKM: gens  iPS ........
Un altre mecanisme de regulació de la transcripció és poc freqüent en l’adult però aquí té molta importància. Hi ha una relació entre replicació del DNA i transcripció; en termes grals, els gens replicats primerencament queden transcripcionalment competents i els gens que es repliquen més tard seran transcripcionalment incompetents. Això està relacionat amb l’accés dels factors de transcripció. En aquests estadis d’elevada divisió, la transcripció està molt regulada.
Origen proteïnes: cada vegada són més d’origen embrionari ja que els RNA d’origen matern es van degradant.
Expressió gènica embrionària: El genoma de l’embrió no és un i únic, hi ha gens que tenen senyals d’imprinting i que tindran expressió diferent segons sigui d’origen matern o patern.
El senyal d’imprinting és manté estable fins el moment de formació dels gàmetes (primordial germ cells), on desapareix.
SINTESI DNA DNA nuclear: El cicle cel·lular té molt a veure amb la replicació. En mamífers, el cicle cel·lular és lent per dues raons: 1r, el cicle cel·lular dels embrions té fase G1 i G2; es necessita regular fenòmens complexos. 2n, la replicació del DNA del mamífer és lenta; s’usen pocs orígens de replicació, això té relació amb el control de la transcripció.
Què manté a l’embrió dividint-se constantment? La PKC activa proto-oncogens (jun, fos...), que són gens proliferatius i mantenen les cèlls en un estadi proliferatiu ct. Eventualment, algunes cèlls necessiten estímuls externs per dividir-se. Tb hi ha estímuls externs, sobretot a nivell autocrí i paracrí, que sintetitza el propi embrió i que estimula la proliferació en estadis més tardans. P.e PAF.
Àcids nuclèics mitocrondrials: Relacionat amb esdeveniments importants del desenv.
Per evitar malalties mt, s’usen dues dones: una que doni el nucli i l’altre l’oòcit amb mt sans.
La sintesi de mtDNA comença en l’etapa d’implantació, durant l’etapa de blastocits. El nº de mt ha de ser reduit al nº normal de mt de les cèlls somàtiques. Un oòcit té 100x més mt que una cèl somàtica. Aquesta reducció es produeix durant l’implantació de l’embrió, quan el nº de cèls augmenta sense augmentar el volum. Aquesta reducció del tamany de les cèlls s’acompanya de la reducció del nº de mt. No hi ha replicació dels mt. Quan arriben al nº normal, comença la sintesi de mtRNA.
26 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial La transcripció en els mt comença abans d’això. La sintesi de mRNA comença a la 8 cell stage Es produiran les prot mitocondrials. Dp d’això, faran la traducció produïnt noves prot. A partir d’aquesta fase (blastocit), començarà la sintesi de RNA TIPUS D’EXPRESSIÓ GÈNICA PRE-IMPLANTACIÓ - Gens reguladors de fenòmens d’apoptosi El gen Bcl 2 suprimeix factors d’apoptosi com Bax, Bad i p53. Aquest gen s’expressa tempranament.
L’apoptosi chequeja la qualitat de les cèls, si hi ha anomalies, mutacions en el genoma... aquestes cèlls moriran. Si la cèl alterada no s’elimina, ¼ de l’organisme estarà afectat per aquesta anomalia.
L’apoptosi treballa constantment.
- Gens involucrats en funcions nuclears Factors de transcripció: Aquests FT es produeixen per controlar ells gens que es produiran durant el desenv embrionari. Tenim: oncogens (indueixen proliferació cèll, !! de regular) snRNAs i microRNAs: regulen la funció de l’embrió i la diferenciació.
Histones: controla la conformació de la cromatina Tb es produeixen polimerases.
- Gens codificadors de funcions de manteniment Housekeeping es essencial per mantenir l’activitat de la cèll. Tenim xaperones com Hsp70 que controlen el plegament de les prots, les introdueixen dins d’orgànuls. Aquí tb tenim molts enzims metabòlics.
- Gens codificadors d’elements del citoesquelet El citoesquelet es un element clau del desenv. Tenim l’expressió d’actina, que està relacionada amb mecanismes que inicien el procés de polarització i diferenciació.
La tubulina és !! pq produeix el fus que controla la distribució dels cr. Se sintetitza en cada divisió cel·lular.
Filaments intermedis es relacionen amb la diferenciació. Quan una cèl no està diferenciada no té aquests filaments; quan es comença a diferenciar els sintetitza.
- Gens codificadors de canals membranals i transportadors iònics 27 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Conexines: p.e la Cx 43, es produeix en connexos que conformen les GAP juntions. Les GAP apareixen durant el procés de compactació. Quan les cèlls tenen el mateix destí, estableixen una sèrie de senyals que seran les mateixes.
Na+/K+ ATPasa: durant la 8 cell stage.
Cell adhesions signaling: les cadherines són prots Ca++ dependents. És un mecanisme típic d’adhesió cel·lular. Tb és ! per la compactació de l’embrió (producció mòrula). E cadherin està relacionada amb la compactació i amb WNT (senyalització) i la beta caterine.
- Gens codificadors de proteïnes de superfície i prots de secreció Fosfatasa alcalina: relacionades amb el procés de senyalització  control del destí de les prot Elements de la MEC: p.e fibronectines, apareixen durant l’epiblast i la hipoblast. Aquests elements han d’unir dif cells de l’embrió, les ancora entre elles. Quan aquestes cells es necessiten moure, s’han de separar de la MEC i ho fan secretant colagenases i estromelisines que són enzims que dissolen la MEC.
- Gens codificadors de factors de creixement i receptors (Lista en tabla) Comuniquen entre cèlls de l’embrió i l’organisme matern a través de les vies autocrines/paracrines o sist endocrí. L’embrió produeix receptor però tb produeix GF.
La majoria són pèptids. El PAF, que es sintetitza al fetge durant la fase....... i és un fosfolípid que va per la via autocrina i paracrina i activa la PLC. La PLC produeix augment de Ca++  activació CaMKII proliferació L’embrió produeix TGF alfa i tb el seu receptor  les que tinguin una vía autocrina i paracrina d’acció, l’embrió produeix el receptor i la prot.
Els de la vía endocrina, com la insulina, es produeix en el pàncrees i es transporta per la sang i a través de la placenta arriba a l’embrió. L’embrió produeix només el R. Les cèlls de la inner cell mass.... la insulina interacciona amb el trophectoderm i transporta la insulina a l’interior - Inactivació de l’X Tenim dos cr x, el matern i el patern  només un cr X s’activa i la inactivació de l’X és un procés a l’atzar.
En el cas de que l’embrió sigui un mascle, el X sempre serà de la mare.
En les fases primerenques del desenv, apareix la inactivació del cr en humans.
28 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial En ratolins es entre la fase 8 i el blastocit, s’inactiva al X patern i l’X matern produeix un RNA anomenat Xist, aquest RNA inactiva el X patern. En etapa adulta, algunes cells expressen el cr X patern (es reactiva)  això es pq en les cels de la inner mass s’inactiva però en el trofectoderm segueix actiu. S’expressen gens imprintats.
DETERMINACIÓ – DIFERENCIACIÓ CEL·LULAR Es produeix un canvi substancial en les cèls de l’embrió. Passem de tenir unes cells que són totipotents (poden donar qualsevol tipus de cell) a tenir dos camins diferents, cels de l’exterior que donaran la part embrionària de la placenta (trofectoderm/exterior) i altres que es queden a dins i donen al fetus (cells de la massa interna), parlem de cells pluripotents.
Les cells totipotents només poden donar cells de la mateixa línia germinal. Això va acompanyat de canvis epigenètics importants. Les cells de la línia germinal conserven la totipotencia.
Landscape model: la cell va prenent unes decisions i això impedeix que torni cap enrere. Però SCNT: transdiferenciació. Fem que una cèl torni a tenir la capacitat de totipotencia. S’esborren els senyals epigenètics.
Formació de la mòrula En aquest estadi es produeix la compactació. Ja no podem veure els limits de la cèl pq la compactació fa que l’embrió esdevingui com una unitat. Aquesta compactació dispararà la 1ª presa de decisions de quin serà el destí d’aquestes cèlls (massa cel interna/trofectoderm).
Simultàniament a la compactació tenim la polarització; encara que no sabem la relació que hi ha entre ells. Això va acompanyat amb unes divisions asimètriques de les cells i s’estableixen dues linies cel·lulars diferents que tindran destins dif.
Control temporal Què decideix que s’inici la compactació? Hi ha un rellotge biològic que es temporal, que conta el temps que ha passat dp de la fecundació. Els embrions compacten al cap d’unes determinades hores dp de la fecundació. Això té a veure amb un control nuclear. Quan separem els blastomers, els embrions compacten en el moment que han de fer-ho.
Hi juga un paper important una prot amb distribució asimètrica anomenada PKCalfa  fosforil·la beta Cadherina  compactació Compactació Implica un aplanament intercel·lular  adhesió i compactació intercel·lular.
Aquests elements d’adhesió són: 29 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Ponts citoplasmàtics: les cells filles queden unides temporalment x un pont citoplasmatic, que es va estenent i finalment s’acaba trencant. Apareix en la 1ª divisió per tant, no tenen un rol atribuïble a la compactació Gap junctions: és un mecanisme de comunicació entre les cells que permet que molec petites passin per aquestes comunicacions. Si impedim que es formin les Gap, l’embrió compacta igualment. Per poder establir aquests conexons, 1r ha d’haver-hi la compactació. Passen ions, 2ns missatgers, Ca++... això ens diu que aquestes Gap s’estableixen 1r entre totes les cells de l’embrió però quan es vagin diferenciant, s’establiran entre cells de la mateixa linia cel·lular.
Prots de mb: la E-caderina en aquests estadis s’anomena Uvomorulina. És una prot d’adhesió Calci depenent, típica dels epitelis. Apareixen en la superf de la mb, té 4 dominis extracel d’unió al Ca++.
Quan el Ca s’uneix en aquests dominis s’estableix l’unió. Tb té una regió transmembranal i una cua citoplasmàtica, molt conservada al llarg de l’evo, que interacciona amb una sèrie de caderines i a través d’això s’uneix als microF d’actina i s’estableix una continuïtat de les molecs d’adhesió de la mb amb el citoesquelet. La beta catenina controla l’unió i distribució de les E caderines.
Aquesta unió entre molec, permet l’aplanament, l’adhesió... i això depèn del Ca++.
La E caderina, que te una funció d’unió entre cells tb té la funció de transmissió de senyals. Senyala a les cells int i ext. La beta catenina pot viatjar a nucli i activar tot una sèrie de gens, regula la transcripció (via de Wnt); l’altre possibilitat és fer-ho a través d’Hippo, que transmet info sobre la tensió a la qual està sotmesa la cell i transformar-ho en expressió gènica. Les cèlls no només s’estan enganxant, tb reben info del lloc on estan.
Hi ha + prots que ajuden a mantenir la compactació, com la galactosil transferasa (reconeixen els oligosacàrids de la ZP3).
Polarització – determinació - Canvis que implica la polarització: Canvis en l’estructuració de les cèlls: distribució de microvillis. 1r la distribució és uniforme, dp de la compactació els microvilli es localitzen en el pol de les cells(domini apical). Dp apareix un domini basolateral que està unit a les cells veïnes. Això va acompanyat d’una distribució desigual de prots associades a microvilli com la Ezrina, PKC alfa (situada en les regions de contacte entre cells, basolateral).
Distribució asimètrica dels orgànuls: deguda a la polarització del citoesquelet. En la regió apical trobem vesícules endocítiques. Els lisosomes estan situats en la basolateral, com tb el nucli, mt, inclusions lipídiques, Golgi...  això és el retrat d’una cell epitelial per tant, les cells que s’estan polaritzant seran epitelials. Les altres que no es polaritzaran són pluripotents i formen la massa cel interna (1ª diferenciació).
- Elements reguladors: 30 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Hi ha 2 elements, Senyalització: hi ha 3 models, pot ser que la realitat barregi elements d’aquests 3 models.
Model de pre – patterning o de Determinació primerenca: la decisió de quin serà el destí de les cells ja està presa en el moment de la fecundació. Apareix una predisposició de les cells de l’embrió a anar a un destí o a un altre (commitment/compromís). Això s’aconsegueix x una distribució asimètrica de prots. Estableixen un eix que s’anirà conservant. P.e Oct 4, Cdx 2 i Sox 2 són gens de pluripotencia.
El 2n element és el pla de divisió de les cells. és un factor que apareix sovint en les qüestions de determinació cel·lular. Per allà on es divideixin les cells pot acabar de condicionar quin és el destí d’aquestes. El pla de divisió que ens interessa és l’estadi de 3 a 4 cells. En aquest pla de divisió poden tenir 2 orientacions dif. A partir de la base dels blastòmers si es divideixen igual: Divisió meridional Divisió equatorial El blastomer es pot dividir en aquestes dues divisions. El 2n blastòmer por fer el mateix que el 1r bl, de manera que la combinació dels 2 pot ser: meridional – meridional, meridional – equatorial, E – E, E – M.
La divisió meridional tendeix a produir ICM i la div eq cells del TE.
Quan la divisió es repeteix, el destí és incert. Perquè la cel tingui un destí clar s’ha da produir una alternança en el pla de div. Quan es produeix la alternança en el pla de div, les cells tenen un destí pre fixat i quan apareixen una M – E, tenen tendència al TE.
Totes aquestes cells no tenen un destí finit. Si les alterem, les cells tenen suficient plasticitat per tornar al seu destí. Tenen una predisposició però no està pressa del tot. Si traiem les cells del int, no passa res pq encara no estan destinades. El model de pre – pattering no és incompatible amb els altres models, pot funcionar simultàniament.
Model regulatiu o determinació tardana dels linatges: està en contraposició amb el model prepattering. Partint de que les cells són totipotents, la decisió de la determinació és tardana i tenen lloc a l’estadi 8 cell. Es produirà la decisió de si les cells aniran a parar a TE o a la MCI. Aquest model té dues vaariants que no són excloents, un i l’altre són una mica oposats.
Inside – outside: la decisió es pren a través de la E – cadherina. És una molec responsable de la compactació de les cells, tenen una info de senyals i transmissió a la cell a través de 2 vies.
DIAPO 44. Blau DNA, verd e-cadh. Les cells de fora tenen una distribució asimètrica de E-cadh. Quan s’enganxen a altres cells es veu. En canvi, fora no s’enganxa i per tant allà no tenim. No és simetrica.
Dins, les cells internes estan rodejades d’altres cells i per tant poden enganxar-se tenint una 31 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial distribució simètrica. Les que tenen simetria determinaran la MCI. Les cells ext per aquesta asimetria es polaritzen i esdevindran cells de l’epiteli. Les de dins no es polaritzen.
Polarització: és previa. La funció del pla de div es que tindrem cells d’un destí o un altre. El pla de div ens donarà el destí de les cells; la polarització és la causa. A l’esquerra del pla de polarització: 1. Div simètrica/ conservativa 2 cells ext. 2. Div asimètrica/ diferenciativa  un pol lateral (polaritzat) i l’altre basolateral (no polaritzada).
En l’embrió de 8 cells, la meitat es donen simetricament i l’altre meitat no. Tindrem 3 cells polaritzades i 1 no polaritzada. Això és molt important pq necessitem més cells polaritzades que no pol. Les polaritzades estaran a fora, ja que es on necesitem + cells.
Què decideix que sigui així? No està gaire clar. Es diu que es la [Oct4]. No és la mateixa en les cells i per tant, si és elevada tindrem asimètrica i si és baixa, simètrica. Les no polaritzades seran les cells internes que formaran part de la MCI i son cells pluripotents. El determinant de la pluripotencia és Oct4 per tant generaran cells amb [ ] elevada.
Model estocàstic: les cells prenen decisions del destí a l’atzar. Si es donés tal qual les cells no estarien ben ordenades. Aquestes cells s’ordenen de manera que les polaritzades les trobaríem fora y les no pol dins.
Regulació transcripcional 4 gens que serveixen per la decisió de la determinació: Oct 4 i Sox2, sobretot oct4 és un gen de tipus homebox. És el gen de la pluripot (són cells mare).
Quan es comencen a diferenciar, apaguen Oct4. En el zigot totes les cells son Oct4. Però quan avancen es va apagant i al final quasi no hi haurà cells que expressin oct4 (excepte els gàmetes).
Encara que estiguin diferenciats presenten Oct 4. Moltes de les det impliquen apagar-lo.
Sox2: precursor de oct4. No dif Cdx 2: gen tipic de l’epiteli. En el càncer de colon solen sortir. El trofectoderm és un epiteli per tant cdx2 és un det de l’aparició del trofectoderm.
Gata6: ICM  oct4, sox 2 i Nanog estan connectades x un fb + però amb Cdx2 la mantenen de manera –.
És ! pq permet desequilibrar amb molta facilitat. Partim d’una situació on s’expressa per igual cdx2 i oct4 però quan qualsevol factor incrementa un dels gens deseq el balanç que tenim.
Gens reguladors: Gens pluripotents: oct4, sox2  en les cells no diferenciades Gens determinants de destí  Cdx2 i Gata6 32 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial 1 ª DETERMINACIÓ - Trofectoderm Massa cel interna Pq hi ha cells int i ext? En la1ª determinació tindrem com a resultat cells int i ext. En les cells ext hi ha una proteïna YAP que es troba dins del nucli; en canvi, en les int es troba en el cyt i es degrada.
YAP és una prot que té a veure amb la via de senyalització de Hippo. Hippo és un gen que converteix la tensió de les cells en senyalització, es a dir, converteix l’unió de les cells amb la matriu en senyal.
En les cells ext PKC inhibeix a Hippo  YAP va a nucli  Cdx 2 es transcriu  dif a ectoderm En les cells int Hippo està inactiu. P.e les molec de contacte. Hippo està actiu i fosforil·la a Yap Yap no entra a nucli no activa Cdx2  augmenta [Oct4] exp MCI La MCI està indiferenciada, tenim: epiblast, pluripotent i hipoblast.
Decisió que prenen cells de la fase cel·lular interna per esdevenir Hipoblast (donaran el sac vitel·lí) o Epiblast.
Això succeeix en 3 fases: Fase 1 – Coexpressió Els dos gens que ens interessen son Nanog i Gata 6; s’estan coexpressant i a part, s’inhibeixen mútuament  estan en un equilibri inestable.
DIAPO 52. Les cèlls estan de color lila (blau + vermell/ nanog + gata6) Fase 2 – Expressió mútuament excloent Algunes cells comencen a expressar més Nanog i aquesta situació d’equilibri es trenca, algunes cells expressen més Nanog i inhibeixen Gata6. Nanog fa que es comenci a secretar fibroblast grow factor 4 (FGF4) (bolitas del dibujo; DIAPO 53). Simultàniament aquesta cèll deixa d’expressar els receptors del FGF pq la cell no ha de respondre a sí mateixa. El FGF4 si es troba amb cèlls que tinguin receptors pel FGF es produeix la interacció FGF – cell  indueix MAPK  inh Nanog. O sigui, la que expressa Nanog fa que s’inhibeixi Nanog d’altres cells  guanya Gata6. Al final ens trobem en una situació variegada en la qual les cells de la massa cel interna algunes expressen nanog i sintetitzen FGF 4 i les altres expressen Gata 6 i sintetitzen el receptor de FGF4. Les que produeixen Nanog aniran al epiblast i les que exp gata 6 aniran a hipoblast.
Fase 3 – Segregació espaial Selecció de cells i migració. Totes les cells que expressen Nanog es posen juntes i les que expressen Gata 6 s’ajunten entre elles. Les cells de Nanog segueixen sintetitzant FGF 4 i per tant les altres el 33 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial receptor. Entre els 2 tipus de cells hi ha una lamina basal (molecs de la MEC) que fa que quedin separades.
Per què unes comencen a expressar Nanog i les altres no? Hi ha 2 models: - - Time outside – time inside: **durant la fase de mòrula hi ha tot una sèrie de div asimètriques (diferenciatives. El pol apical queda per una banda i a l’altra queda una cell no polaritzada)** Les 1res cells que es divideixen asimètricament, les que van a parar a dins (roja) aniran a l’epiblast. Seran les que decidiran expressar Nanog. Les de la 2ª i 3ª ronda aniran a l’endoderm primitiu (hipoblast) i expressaran GATA6. Hi ha biaix cap el destí d’aquestes cells que està determinada pel temps en el que es divideixin Model estocàstic: és a l’atzar. Expressen Nanog pq petites fluctuacions de Nanog seran modificades i es convertirà en una cell que expressi majoritàriament Nanog.
Finalment, tenim unes cèlls pluripotents que expressen Nanog que determina l’aparició d’epiblast i les altres que seran hipoblast (Gata6).
2ª DETERMINACIÓ Regulació epigenètica **nota** Acetilació histones + hipometilació DNA  senyal d’activació / Metilació histones + metilació DNA  senyal d’inactivació Senyal de pluripotencia: la decisió que es pren s’ha de mantenir i que segueixi expressant-se a les cells filles, la decisió es transmet a la descendència de la cell, per modificacions epigenètiques.
Aquests senyals de totipotencia es caracteritzen per tenir senyalitzacions equivalents (per una banda són d’activació i d’una altra d’inactivació). El DNA té promotors enriquits amb hidroximetilcitosina i l’aparellament citosina – guanina es inestable, el DNA s’obre mes fàcil. Els promotors que barregen citosina i hidroxiMC tenen mes facilitat d’obrir-se. La hidroxiMC genera un estat intermig entre gens poc metilats i gens molt metilats. DIAPO 59 La característica d’equivalència és important pq així es troben en un equilibri inestable i poden caure d’una banda d’activació a una d’inactivació en un temps curt. Prenen una decisió ràpida en front a un estímul i una petita variació en la senyalització.
miRNAs Són reguladors de la traducció. Els miRNA són transcrits com un precursor, es tallen al nucli i van al cyt on s’acaben de tallar i es converteixen en RNA. S’uneixen al complex RISC (rna induce silencing complex) i altera la vida mitja d’aquest RNA o impedeix la traducció.
Els miRNA són inhibidors, controlen l’expressió de Oct4, Nanog, Sox2...
34 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Els miRNA se sintetitzen a partir de clusters de DNA. El control de la transcripció d’aquests clusters està controlada x l’expressió d’aquests gens de pluripotencia i d’altres gens com Klf4, c-myc. Aquest conjunt de gens s’anomena OSKM. La sobrexpressió d’aquests gens provoca la reprogramació de les cells i activa la iPSC.
FORMACIÓ DEL BLASTOCIST: CAVITACIÓ DIAPO 62 Significat biològic de la cavitació És important que un epiteli (TE) separi l’embrió de l’ambient exterior. L’embrió tindrà una composició del medi diferent. El TE és un epiteli que transporta nutrients fora i dins de l’embrió.
Formació del blastocel Model de cavitació metabòlica: es formen tight juntions que donen impermeabilitat. És produeixen al 8 cell stage i acaba en la mòrula stage. En 32 cels stage ja estan organitzades.
Les cells que estan polaritzades formen TE. Estan separades per tight juntions, comencen a apropar-se. Les cells tenen un domini apical i un basolateral. Quan les tight juntion apareixen, es forma un nou espai virtual; sense elles tenim l’espai intracel i extrcel i dp de que apareixin, l’EE es divideix en espai extraembrionari i espai intraembrionari.
Tenim una Na/K ATPasa que bombeja 3 Na fora i 2 K dins la cel. Tenim canals de degoteig de Na que permeten que el Na entri a la cel i alguns K l’abandonin; això és important pq si no deixem al K escapar, la [K] dins la cell no deixa d’augmentar. Durant aquest procés, algun Na es bombejat fora per la ATPasa i altres Na es bombegen dins pels canals de degoteig. L’espai intersticial està tancat per les tight juntions així que el Na no pot passar  la [Na] en l’espai intraembrionari disminueix críticament. Aquesta [ ] és més baixa que la intracel. Hi ha un influx des de l’espai extraemb fins l’intraemb per gradient. [Na]extraemb >Na intracel>Na intraemb Això és equivalent a perdre càrregues negatives. L’ATPasa passa de tenir una distribució per tota la cèl a trobar-se només a la mb (regió basolateral) En el domini basolateral tenim el nucli, mt i grànuls de lípids. L’activitat dels mt augmenta, produint ATP. La ATPasa Na/K bombeja Na fora de la cel. Però la distribució de la ATPasa està en la regió basolateral i per això el bombeig només es troba en un costat de la cèl surt Na del domini basolateral i la [Na] intraemb augmenta molt; Na intraemb > [Na] intracel < [Na] extraemb.
L’embrió continua bombejant Na en la direcció extraemb  intracel intraemb. Bombejaran Na dins de l’embrió. El Na, està en l’espai extracel dins de l’embrió  incrementa la P osmòtica pq entra H2O. L’H2O prové del medi del voltant (del metab de la glucosa). L’aigua s’acumula a l’espai intersticial, forma una cavitat en el blastocist. La carrega + del Na serà compensada mitjançant Cl– i es formarà sal que serà el sèrum fisiològic.
L’embrió té una cavitat plena d’aigua i sal.
35 Noelia Carrión Tecnologia de la reproducció – 1r parcial Característiques de les estirps cel·lulars del blastocist Model ratolí. Tenim la 1ª dif a ICM o TE. TE produeix la part embriònica de la placenta. L’hipoblast produeix el sac vitel·lí (yolk sac), que proveeix a l’embrió alguns nutrients però al final de la prod de la placenta serà vestigial. L’epiblast produeix les 3 capes embriòniques (mesoderm, ectoderm i endoderm). En humans, les embrionic stem cell s’aïllen del epiblast i en ratolí de les ICM.
Allantois: és actina(?) Formarà art del sist digestiu L’embrió flota en la cavitat amniòtica.
ECLOSIÓ És el procés final. L’embrió abandona la Z.P per unir-se al endometri. Això es produït per un enzim tripsin – like sintetitzat per l’embrió que la trenca perquè el blastocit pugui sortir. L’embrió té moviments de contracció i expansió.
IMPLANTACIÓ L’embrió viatja desde l’oviducte fins l’úter. El blastòcit és molt plàstic. Les cells epitelials pateixen apoptosis. La penetració a l’endometri genera una elevada angiogenesi.
La implantació es pot produir en la cornea i en el cortex renal tb.
La Z.P té 3 funcions: 1, assegurar que la implantació té lloc en l’úter. 2, protegir l’embrió enfront de l’atac del SI matern ja que l’embrió primerenc encara no té un SI. 3, mantenir les cèlls embrionaries juntes. Si traiem la Z.P les cells no creixen com una massa junta.
36 ...