Métodos de estudio ecología microbiana III (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 2º curso
Asignatura ecología microbiana
Año del apunte 2014
Páginas 27
Fecha de subida 24/10/2014
Descargas 6

Vista previa del texto

Métodos de estudio de la ecología microbiana III Enriquecimiento: separar los organismos de interés de una comunidad microbiana, y que permite aislarlos después en un cultivo anéxico. El aislamiento es importante porque se obtienen para estudios detallados y controlados de laboratorio y para su aplicación en biotecnología y en microbiología ambiental e industrial.
Enriquecimiento y aislamiento En un ambiente natural no es frecuente encontrar un solo tipo de microorganismo. Lo que existen son comunidades microbianas, y el desarrollo de métodos y procedimientos que permitan el aislamiento y cultivo de microorganismos de interés es un reto para el ecólogo microbiano. El enfoque más corriente para alcanzar este propósito es la técnica del cultivo de enriquecimiento. Este método requiere que el medio de cultivo y las condiciones de incubación sean selectivos para el organismo que se desea aislar y contraselectivos para los organismos no deseados. Por tanto, necesitamos reproducir lo más fielmente posible los recursos y las condiciones que se dan en este nicho ecológico y buscar luego los habitantes potenciales de aquel hábitat capaces de desarrollarse en las condiciones de enriquecimiento seleccionadas.
Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito es necesario contar con un inóculo apropiado (una muestra que contenga el microorganismo). Por tanto, la metodología del cultivo de enriquecimiento se inicia con la elección del hábitat adecuado. El cultivo de enriquecimiento suele establecerse sembrando el inóculo directamente en un medio altamente selectivo; muchos de los procariotas más frecuentes pueden aislarse de esta manera. Por ejemplo, el gran microbiólogo holandés Martinus Beijerinck, a quien se deben las primeras técnicas de cultivo de enriquecimiento, aisló por primera vez la bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacter por medio de lo que después se convirtió en una estrategia clásica de enriquecimiento. Como Azotobacter puede crecer rápidamente fijando N2 del aire, los medios de enriquecimiento carentes de amoniaco u otras formas de nitrógeno fijado son muy selectivos para este organismo; las bacterias no fijadoras de nitrógeno o las bacterias fijadoras de nitrógeno anaeróbicas son contraseleccionadas con este método.
Literalmente son centenares los métodos que se han ideado para los cultivos de enriquecimiento.
Tanto el medio de cultivo como las condiciones de incubación son críticos para que tenga éxito un cultivo de enriquecimiento; es decir, deben optimizarse tanto los recursos como las condiciones para tener las mejores posibilidades de enriquecer el microorganismo que interesa.
La columna de Winogradsky Tradicionalmente, la columna de Winogradsky se ha utilizado en el cultivo de enriquecimiento para el aislamiento de bacterias fototróficas rojas y verdes, de bacterias sulfato reductoras y de muchos oros anaerobios. El nombre corresponde al famoso microbiólogo ruso Sergei Winogradsky, quien utilizo la columna por primera vez a finales del siglo XIX ara estudiar microorganismos del suelo. La columna de Winogradsky es un ecosistema anóxico en miniatura que puede usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento.
La columna de Winogradsky se prepara con un cilindro de vidrio grande que se llena aproximadamente hasta la mitad con lodo rico en materia orgánica, y que preferiblemente contenga sulfuro. Los sustratos de carbono se mezclan previamente con el lodo; éstos determinarán que organismos serán enriquecidos, pero deben evitarse los sustratos fácilmente fermentables (que pueden llevar a una formación excesiva de gas). Al lodo se le añade CaCO3 y CaSO4 como tampón y como fuente de sulfato, respectivamente. El lodo se compacta en el envase, cuidando de no atrapar el aire. El lodo se cubre con agua de un lago, embalse o acequia (o agua de mar si se prepara una columna marina), y se tapa el cilindro para evitar la evaporación. Se coloca el cilindro cerca de una ventana donde reciba luz solar atenuada y se deja durante varias semanas.
En una columna de Winogradsky típica se desarrolla una mezcla de microorganismos. Las algas y cianobacterias ocupan rápidamente la parte superior y al producir O2 ayudan a mantener esta zona óxica. El proceso de descomposición en el sedimento lleva rápidamente a la producción de ácidos orgánicos, alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias sulfato reductoras. El sulfuro producido por las bacterias sulfato reductoras provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre (fotótrofos anoxigénicos). Estos organismos parecen generalmente como zonas de crecimiento en el lodo de la columna, pero también pueden desarrollarse profusamente en el agua si los fotótrofos oxigénicos son escasos. Para el muestreo de bacterias fototróficas de la columna se introduce una pipeta larga con la que se recoge un poco de lodo o agua coloreados. Estas muestras se pueden usar para microscopia y para inocular medios de enriquecimiento para aislamiento y caracterización.
La columna de Winogradsky se ha usado para enriquecer diversos procariotas, tanto aerobios como anaerobios. Además de producir un inóculo listo para un cultivo de enriquecimiento, a la columna también se le puede añadir un compuesto particular para probar la hipótesis de si en el inóculo existe uno o varios organismos que pueden degradarlo. Una vez se ha establecido un enriquecimiento, se puede intentar hacer cultivos axénicos.
Sesgo en el enriquecimiento Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta poderosa, en muchos casos se produce un sesgo en el enriquecimiento. En los cultivos líquidos de enriquecimiento típicos, el organismo más adaptado a las condiciones escogidas puede convertirse en la población dominante. Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos de laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del ecosistema microbiano, en lugar de ser el mayoritario del ecosistema microbiano o el más relevante desde el punto de vista ecológico.
El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse cuando se comparan los métodos de dilución con el clásico enriquecimiento en líquido. La dilución del inóculo seguida de un enriquecimiento, a menudo da lugar a un organismo diferente que cuando se enriquece un inóculo sin diluir. Se cree que la dilución elimina aquellas poblaciones minoritarias pero de rápido crecimiento, dando de este modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la comunidad. Por tanto, la dilución del inóculo es una práctica común en el cultivo de enriquecimiento en la microbiología actual.
Aislamiento en cultivo axénico Los cultivos axénicos (o “puros”) se pueden obtener de muchas maneras a partir de un enriquecimiento; los métodos empleados más frecuentemente son la siembra por estría en superficie (en placa de Petri), la siembra en profundidad (agar-shake) y la dilución en líquido.
Para aquellos microorganismos que crecen bien en medio de cultivo sólido (con agar), el método de elección es la siembra por estría. A partir de una población muzta, mediante la siembra por estría se obtienen colonias separadas: repitiendo esta técnica con una de estas colonias aisladas se consigue un cultivo axénico, que puede ser transferido a un medio líquido.
Las placas sembradas de este modo e incubadas en las condiciones adecuadas (por ejemplo, una jarra anóxica para anaerobios, nos permiten aislar tanto microorganismos aerobios como anaerobios.
Siembra en profundidad y número más probable (NMP) El método de siembra en profundidad consiste en la dilución de un cultivo mixto en tubos de agar fundido; cuando el agar solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el tubo de agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por estría en placa. Es un método de gran utilidad para purificar determinados tipos de microorganismos anaerobios, por ejemplo, las bacterias fototróficas del azufre y sulfato reductoras de las columnas de Winogradsky. Es posible obtener cultivos axénicos mediante diluciones sucesivas de una suspensión de células en tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida en el tubo de mayor dilución utilizada como inóculo, se puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal manera que se acabe obteniendo un cultivo axénico. Un procedimiento similar sin usar agar es la dilución seriada de un inóculo en un medio líquido hasta que el tubo o tubos finales de la serie no muestran crecimiento. Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el último tubo que muestre crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 células o menos. Si se repite varias veces este proceso se obtienen cultivos axénicos. Esta técnica se conoce como la técnica del número más probable (NMP), y se ha usado para estimar el número de microorganismos en alimentos, aguas residuales y en otras muestras donde hay que evaluar rutinariamente el número de células. Se puede hacer con medios altamente selectivos y condiciones de incubación dirigidos a uno o a un pequeño grupo de organismos, como por ejemplo un determinado patógeno, o usando un medio complejo para obtener una estimación del número total de células.
Con independencia del método utilizado para purificar el cultivo, una vez obtenido un supuesto cultivo axénico es esencial comprobar su pureza, Se utiliza para ello una combinación de técnicas microscópicas, observación de las características de la colonia en placas, o en siembras en profundidad en tubo, y comprobación del crecimiento en medios donde el microorganismo que nos interesa aislar crece muy poco, pero que favorecen el crecimiento de los microorganismos acompañantes. La observación microscópica de un solo tupo morfológico de célula, junto con unas características uniformes de la colonia y ausencia de contaminación en test con diversos medios de cultivo, puede tomarse como prueba de que un cultivo es axénico (puro).
Muchos estudios en ecología microbiana no necesitan aislar los organismos, ni siquiera idenificarlos por microscopía con las tinciones descritas.
A menudo el objetivo de un estudio es evaluar la biodiversidad de un hábitat sin emplear técnicas de cultivo, ni observar células. Con este objetivo, se han aislado y caracterizado genes específicos como medida de la biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes específicos están ligados frecuentemente a organismos específicos, la detección del gen implica la presencia del organismo. Las principales técnicas en este tipo de análisis de comunidades microbianas son la reacción en cadena de la polimerasa (OCR), la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE), la clonación molecular y la secuenciación y análisis de DNA.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y análisis de la comunidad microbiana Los pasos principales de la PCR son: 1) Una sonda de ácido nucleico hibrida una secuencia complementaria en un gen diana, 2) La DNA polimerasa copia el gen diana 3) 3) se consiguen múltiples copias del gen diana mediante ciclos sucesivos de separación de las cadenas de DNA, unión de los cebadores y nueva síntesis. A partir de una sola copia de un gen, se pueden obtener varios millones de copias y el DNA amplificado puede observarse en un gel.
¿Qué genes pueden usarse como diana? Un gen que se amplifica frecuentemente es el que codifica el RNA ribosómico 16S. El gen 16S rRNA se puede usar para establecer relaciones filogenéticas. De la misma forma, el análisis de la secuencia de genes de rRNA 16S amplificados a partir de una comunidad microbiana puede ofrecer una imagen filogenética de esa comunidad. De manera alternativa, también pueden ser dianas los genes metabólicos que codifican proteínas particulares del metabolismo de un organismo específico (o de un grupo de organismos relacionados). Con independencia del gen (o genes) escogido para la amplificación por PCR, es imprescindible que los cebadores tengan una elevada especificidad. Si la fuente de DNA es una muestra natural, el diseño de los cebadores es crítico para que los resultados no sean ambiguos y difícilmente interpretables.
En un ejemplo típico, el DNA total de la comunidad del hábitat que se quiere estudiar. Se dispone de reactivos comerciales (kits) con el fin de obtener un DNA puro, sin restos de sustancias de la muestra que podrían interferir con la PCR (por ejemplo, suelo, metales y otros componentes físicos y químicos del hábitat). El DNA obtenido es una mezcla del DNA genómico de todos los microorganismos presentes originalmente en el hábitat. La tarea de la PCR es capturar el gen o los genes diana que interesan en esta mezcla y hacer las copias suficientes para análisis posteriores.
El resultado final de la secuencia del análisis molecular de una comunidad microbiana a partir de una muestra ambiental son bandas del gen diana en un gel. El hecho ideal es la aparición de una sola banda de una muestra dada (el tamaño del fragmento DNA amplificado viene determinado por la distancia entre los cebadores.
Si el objetivo fundamental es la secuenciación, los productos de la PCR, que por lo general son una mezcla de las variantes del gen diana presente en la muestra tienen que poder diferenciarse.
Un método clave en la separación de productos de la PCR es la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente.
Resultados del análisis filogenético de la PCR El análisis filogenético por PCR de las comunidades microbianas ha dado resultados sorprendentes. Con el rRNA 16S como gen diana, se ha comprobado que la mayoría de comunidades microbianas contienen varios organismos filogenéticamente distintos, cuyas seuencias de rRNA no se emparejan con ninguno de los cultivos de laboratorio.
De hecho, en muchos casos en los que se han refinado estos métodos para permitir tanto análisis cualitativos, como cuantitativos, ¡resulta que los miembros más abundantes de las comunidades naturales son especies que hasta ahora no han podido ser cultivadas en el laboratorio! Este problema indica que nuestro conocimiento de la diversidad microbiana a partir de cultivos de enriquecimiento presenta sesgos, lo cual supone un serio problema para los estudios de biodiversidad.
Diversidad microbiana De las interacciones de los genomas microbianos con el entorno surgieron nuevas especies de microorganismos, lo que causó una gran diversidad microbiana y alteró el ecosistema. Los 3000 MA de evolución microbiana supusieron cambios muy limitados en cuanto al tamaño y a la morfología. El ritmo de la evolución microbiana fue terriblemente lento comparado con la escala de tiempo de evolución de los organismos pluricelulares. De acuerdo con las ideas de Darwin, las mutaciones, la recombinación genética y la selección natural fueron importantes en la evolución de nuevas especies microbianas. Las variaciones genéticas y la selección natural favorecieron la proliferación de algunos tipos de microorganismos y la excitación de otros. A medida que la evolución avanzaba, aparecieron nuevos tipos de microorganismos, de modo que aumentó la diversidad del mundo microbiano.
Algunos de los nuevos y diversos microorganismos representaron nuevas especies (especie deriva del morfemo latino spec que significa mirar u observar el tipo, aspecto o forma de algo). Las fuerzas que gobernaron la evolución fueron las mismas que las que impulsaron la aparición de nuevas especies de los microorganismos. No obstante, la diversificación de los microorganismos ha estado produciendo durante unos 3850 MA, en comparación con los solo 600 MA para los macroorganismos. Por tanto ha habido considerablemente más tiempo para la evolución de numerosas especies microbianas. La gran diversidad del mundo microbiano aún está por descubrir.
Diversidad del dominio Bacteria Las Aquificales (línea Aquifex) representan el grupo de especies bacterianas de raíces más profundas, esto es, la rama evolutiva más antigua en el dominio Bacteria. El examen de las propiedades de Aquifex permite conocer la ecología y la fisiología primitivas de las bacterias. Las especies Aquifex utilizan H2, S2O32- (tiosulfato) y S0 (azufre) como donadores de electrones para reducir el oxígeno a agua (de ahí el nombre de Aquifex que significa hacedor de agua). De este modo transfieren la energía de los donadores de electrones a los productos químicos celulares, particularmente ATP. De hecho el agua es un producto metabólico residual de esta transferencia de energía.
Biodiversidad Pedròs-Aillo *La cola del final representa los microorganismos menos abundantes los grupos raros, y es muy larga.
a) Los gráficos representan el número de individuos en función de los grupos.
La curva total representa la biodiversidad y está compuesta por dos secciones: -1) diversidad (rojo), que contiene los grupos más abundantes, responsables del flujo de carbón y energía en un ecosistema dado.
-2) La sección azul de la curva se corresponde con los grupos raros (menos abundantes). Que sobrevive en la población manteniéndose con un número reducido de individuos generalmente en sus formas de resistencia, este banco de semillas recibe nuevas especies por inmigración. Debido a la fácil dispersión de microorganismos, parece que esencialmente todos los microorganismos alcanzan este ecosistema periódicamente. Estos grupos menos abundantes no experimenta ataques víricos, y la predación es menor que la que sufren los grupos más representativos del ecosistema, como la extinción es poco probable y por el contrario la migración es elevada, esta fracción de la curva que incluye los grupos menos abundantes es muy larga, y abarcaría la mayor parte de la biodiversidad total de microorganismos.
b) La misma curva ilustra las porciones de biodiversidad que pueden ser estudiadas por distintas técnicas.
De modo que las técnicas moleculares pueden acceder a la porción roja que representa la diversidad (los grupos más abundantes en el ecosistema dado), mientras que el resto de la biodiversidad es poco accesible para estas técnicas porque los distintos grupos están poco representados como para obtener muestras con la cantidad suficiente de su material genético. Por otro lado pocos grupos pueden ser aislados en cultivos puros, pero estos pueden provenir tanto de la parte de diversidad como de la de biodiversidad.
Hay un 99% que muchas veces no es posible obtener por las técnicas clásicas, por desconocimiento de las condiciones en las que debe ser cultivadas o por imposibilidad de reproducir este medio en el laboratorio.
Métodos de extracción de ácidos nucleicos En la extracción de los ácidos nucleicos, éstos se separan de cualquier otro compuesto proveniente de las células o del ambiente del cual se tomaron las muestras (p. ej. en muestras de suelos debemos considerar la alta concentración de ácidos húmicos, que son materia orgánica parcialmente degradada que no es soluble en agua a pH bajo y tiene un poder quelante muy alto, por lo que interfieren con la amplificación del ADN).
Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular, para lo cual se utilizan los buffers de extracción que contienen 1) Detergentes, como sodio dodecilo sulfato (SDS) 2) Una molécula quelante (p. ej. EDTA, ácido etileno amino tetra acético) cuya forma completamente deprotonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución, quitando a los cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las DNasas; 3) sales que forman una capa iónica suave que recubre al DNA protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación 4) Tris-HCl 20mM con pH entre 7.5 y 8.2 para mantener el pH de la solución estable; 5) Proteinasa K (concentración final 0.5 ml ml-1) para degradar proteínas o enzimas.
Durante este paso con buffer de extracción es común someter la muestra a tres o cuatro ciclos de incubación a temperaturas entre los 50ºC y 70ºC alternados con agitación de la muestra e incubación a 4 ºC. La temperatura de incubación no puede ser mayor a los 80ºC, ya que a esta temperatura se comienza a degradar el ADN. Estas incubaciones facilitan la ruptura de lípidos en la membrana celular, permitiendo la liberación del ADN de la estructura celular.
Posteriormente, resulta necesario tratar las muestras con dos extracciones de fenol para eliminar las proteínas (como nucleasas); para ello se agrega el mismo volumen de fenol que de muestra, se mezcla bien y centrifuga, recuperando el sobrenadante con cuidado de no acarrear las proteínas que quedan en la interfase.
Después de la extracción con fenol, es común llevar a cabo otra extracción con cloroformo para acabar de limpiar la muestra de cualquier residuo lipídico.
Una vez concluido este paso, se lleva a cabo la precipitación del ADN con etanol absoluto y con una sal a alta concentración.
Por otra parte, con la adición de la sal, el ADN que está cargado negativamente va a obtener una capa iónica positiva que permite su precipitación.
Posteriormente, se centrifuga la muestra, se remueve la fase acuosa y se lava la pastilla de ADN con etanol al 70% para eliminar todas las sales que permanezcan en la solución.
Las muestras se vuelven a centrifugar elimina el etanol y se deja secar el ADN hasta que no haya más trazas de alcohol.
______________________________________________________________________ Los RNA ribosómicos son unas de las macromoléculas mejor conservadas desde el punto de vista evolutivo en todos los sistemas vivos. Sus funciones como sistemas de procesamiento de información debieron de establecerse en los primeros antepasados comunes de los dominios Bacteria, Archaea y Eucharya. Los genes del rRNA en todos los organismos actuales comparten un ancestro común, y no parecen haber sido objeto de transferencia génica lateral entre especies. Debido a lo necesario de sus funciones, han conservado bien grandes regiones de los genes rRNA, y sus secuencias pueden utilizarse para medir distancias filogenéticas incluso entre organismos que tienen poca relación entre sí. Esencialmente los cambios en las secuencias de nucleótidos indican cambios evolutivos.
La comparación de las moléculas de rRNA aisladas de diferentes organismos sirve para determinar las relaciones evolutivas de todos los seres vivos. Existen muchas secuencias nucleotídicas posibles de moléculas de rRNA. Cualquier homología en dos secuencias de nucleótidos sugiere la existencia de una relación filogenética entre dichas secuencias y los organismos que las contienen, En particular, el rRNA 16S de bacterias y arqueas se usa para determinar las relaciones filogenéticas entre estos microorganismos. En el caso de los eucariotas, se analiza el rRNA 18S.
La ventaja de utilizar los rRNA 16S y 18S es que ambos se encuentran en todos os organismos, son moléculas suficientemente grandes como para proporcionar un número significativo de nucleótidos que permitan la comparación de secuencias, y sin embargo, son lo suficientemente pequeñas para analizarlas convenientemente. Por esta razón, Woese alegó que: 1. Se encuentran universalmente distribuidos en todos los organismos.
2. Poseen grandes regiones muy conservadas, útiles para establecer relaciones filogenéticas lejanas.
3. Presentan suficientes regiones variables para evaluar relaciones próximas.
4. No son susceptibles a cambios de secuencia rápidos por selección, dada su función central en la expresión génica.
Las comparaciones de las secuencias de nucleótidos 16S permiten el cálculo de distancias evolutivas y la construcción de árboles filogenéticos que muestran posiciones y relaciones evolutivas relativas. La filogenia resultante, basada en análisis del rRNA 16S, reveló los dominios separados Archaea, Bacteria y Eucharya. Los estudios filogenéticos moleculares proporcionan una visión de la evolución a gran escala. Cuando se considera de esta manera, no puede ignorarse el papel fundamental de los microorganismos en la historia de la evolución de la vida en la Tierra.
Se pueden usar varios métodos para analizar estas moléculas de rRNA.
En la aproximación analítica original, las células se cultivaran en presencia de isótopo radiactivo 32P, de modo que el fosfato marcado radiactivamente se incorpora en los ácidos nucleicos, como los rRNA. Se obtiene el rRNA de las células en grandes cantidades y se digiere con ribonucleasa T1. Esta enzima corta el rRNA de tal modo que cada nucleótido generado termina con un residuo de guanina en la posición 3’-OH. En general, los oligonucleótidos se separaran por electroforesis en gel y se determinan sus secuencias nucleotídicas. Los oligonucleótidos con 6 o más nucleótidos se catalogan por comparación con los obtenidos a partir de los rRNA de otros microorganismos. Los oligonucleótidos se eligen de ese tamaño porque es probable que cada uno aparezca solamente una vez en una molécula de rRNA 16S, y además por lo general aparecen 25 de tales secuencias, lo cual suministra una base suficiente para la comparación Los catálogos de oligonucleótidos de diferentes organismos se comparan mediante un índice matemático de semejanza SAB, que compara la homología de las secuencias de un microorganismo A con las de un microorganismo B. SAB = 2NAB / (NA + NB), donde NA y NB representan el número total de oligonucleótidos en los catálogos de secuencias de los microorganismos A y B, respectivamente, y NAB representa el número total de secuencias idénticas de oligonucleótidos en los catálogos.
Otro método para el análisis de las secuencias del rRNA consiste en extraer el rRNA para analizarlo directamente, o utilizar el rRNA como molde (template) para hacer una copia de DNA complementario y entonces usar la PCR para producir DNA suficiente para el análisis. Si se desea obtener rRNA con fines analíticos, la rotura de las células se realiza normalmente en presencia de DNasa con el fin de degradar todo el DNA.
Entonces se extrae el RNA con fenol acuoso. Las moléculas grandes de RNA se separan en la fase acuosa. Tras la precipitación del RNA con alcohol y sal, se añade un cebador (primer) de DNA complementario de la región conservada del rRNA 16S. Puede usarse entonces la transcriptasa inversa para generar los cDNA. Los cDNA se amplifican mediante PCR, y se determinan las secuencias nucleotídicas completas de los cDNA, de modo que pueden deducirse las secuencias nucleotídicas de los rRNA a partir de estos análisis, La reacción en cadena de la polimerasa también puede usarse para amplificar el DNA que codifica los genes del rRNA. Este procedimiento usa, como moldes de la PCR, cebadores sintéticos complementarios de las secuencias conservadas en el rRNA.
La amplificación por PCR del DNA que codifica el rRNA requiere menos células que la secuenciación directa del rRNA. También es más rápida y más adecuada para los estudios a gran escala. Rutinariamente se emplean ocho cebadores para obtener las secuencias, prácticamente completas, del rRNA 16S; sólo unos 30 nucleótidos del extremo 3’-OH no pueden secuenciarse con estos cebadores. La secuenciación de los rRNA 16S con este método –ya se han realizado más de 5000- pone de manifiesto secuencias de identificación específicas, o secuencias signatura (signature sequences), que pueden definir a los miembros de los dominios Bacteria, Archaea y Eucharya.
Métodos dependientes de PCR *Clonación molecular La clonación molecular está en la base de la mayoría de los procedimientos de ingeniería genética y ha facilitado enormemente el análisis de cualquier genoma. La finalidad de la clonación molecular (también llamada clonación genética) es aislar grandes cantidades de genes específicos o fragmentos cromosómicos en forma pura.
Aunque teóricamente es posible aislar físicamente fragmentos de DNA puro mediante digestión de DNA cromosómico con enzimas de restricción, una ligera reflexión demostrará la imposibilidad de la aproximación experimental.
La clonación molecular puede dividirse en varias etapas: 1. Aislamiento y fragmentación del DNA de partida. Éste puede ser DNa genómico de un organismo de interés, DNA sintetizado a partir de un molde de RNA por la transcriptasa reversa, o DNA sintetizado por PCR, o incluso DNa totalmente sintético hecho in vitro. Si la fuente es DNa genómico se corta por lo general con enzimas de restricción para originar una serie de fragmentos.
2. Unión de los fragmentos de DNA a un vector de clonación con DNa ligasa. Los pequeños elementos genéticos usados para replicar genes se conocen como vectores de clonación. Los vectores de clonación están generalmente diseñados para permitir la recombinación de DNa foráneo en un sitio de restricción que corta el vector sin afectar a su replicación. Si el DNA de partida y el vector se cortan con la misma enzima de restricción, la unión puede lograrse por acoplamiento de las regiones monocatenarias llamadas “extremos cohesivos!. Los “extremos romos” generados por diferentes enzimas de restricción puede también unirse mediante el uso de adaptadores (DNA linkers).
Introducción y mantenimiento en un organismo hospedador. El DNA recombinante generado en el tubo de ensayo se introduce en un organismo hospedador, por ejemplo, mediante transformación con el DNA donde pueda replicarse. La transferencia del DNA al hospedador genera a menudo una mezcla de clones. Algunas células contienen el gen deseado clonado mientras otras células contienen otros clones generados por unión de otros fragmentos de DNA al vector. Esta mezcla de clones se denomina genoteca o librería de genes ya que pueden purificarse muchos clones a partir de la mezcla, conteniendo cada uno diferentes segmentos de DNA clonados procedentes del organismo elegido.
Existen técnicas de clasificación de microorganismos basadas en sel DNA con las que es posible distinguir microorganismos a nivel de especie y de cepa. v El RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) fue la primera en ser utilizada. Se extrae el DNA (el genoma completo) de cada cepa, se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos obtenidos se separan y visualizan por electroforesis en geles de agarosa. Se obtienen patrones de bandas con buena reproducibilidad pero por lo general muy complejos. La forma como más se ha utilizado el RFLP es estudiando el polimorfismo de regiones particulares. Para hacer una ribotipificación se transfieren los fragmentos a una membrana, se hibridan con una sonda de rRNA marcada y se visualizan únicamente los fragmentos hibridados, que se pueden comparar con cepas de referencia.
Otras técnicas se basan en el PCR y se caracterizan por su simplicidad y rapidez. El RAPD (análisis de DNA polimórfico amplificado al azar), conocido también como APPCR (PCR cebado arbitrariamente) consiste en amplificar al azar regiones del DNA extraído de los microorganismos.
Los cebadores se escogen al azar, por lo que no es necesario contar con información sobre secuencias específicas del microorganismo a tipificar.
Se utilizan temperaturas de alineamiento bajas, de manera que se obtengan productos de PCR que permitan el alineamiento de los cebadores a pesar de que existan una o dos bases que no coincidan.
Después de su separación mediante electroforesis en geles de agarosa se obtienen patrones simples de fragmentos de DNA de diferentes tamaños.
El problema de esta técnica es su sensibilidad a las condiciones de reacción, por lo que es difícil en ocasiones obtener una reproducibilidad inter-laboratorios adecuada.
El AFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados) es una combinación de PCR y el uso de enzimas de restricción. Se basa en la amplificación por PCR de fragmentos de restricción de DNA genómico. Se realiza en tres etapas: a) Restricción del DNA y ligamiento de los adaptadores. Se realiza la restricción con dos enzimas que producen fragmentos de DNA con dos tipos diferentes de extremos pegajosos. A éstos se ligan adaptadores, que son oligonucleótidos cortos que funcionarán como los sitios de alineamiento de los cebadores. b) Amplificación selectiva de algunos de los fragmentos de restricción. Se usan dos cebadores diferentes conteniendo la misma secuencia que los adaptadores más varias bases contiguas al sitio de restricción. Se utilizan condiciones estrictas, de manera que se amplifican únicamente los fragmentos en los que las extensiones del cebador (las bases que se añaden) coinciden exactamente con los nucleótidos adyacentes al sitio de restricción. c) Separación de fragmentos por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (geles de secuenciación). Generalmente se obtienen patrones de 50 a 100 fragmentos, con mucha reproducibilidad, debido a las condiciones estrictas del alineamiento.
Ésta y otras técnicas basadas en el PCR han sido automatizadas mediante el uso de cebadores marcados con fluorescencia.
Otros métodos se basan en la comparación de DNA ribosomal (rDNA). El análisis de restricción de DNA ribosomal amplificado (ARDRA) se basa en la obtención de rDNAs mediante amplificación por PCR usando cebadores universales, el producto se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se analizan en geles de agarosa.
Con todas estas metodologías se obtienen patrones de bandas o “huellas digitales” de cada microorganismo. Se determinan, utilizando diferentes tipos de software, las diferencias entre éstos (de acuerdo con la presencia o ausencia de bandas) y se construyen dendogramas. Para identificar los microorganismos clasificados es común incluir en el análisis cepas de referencia o identificar cepas representativas de cada grupo mediante la comparación de secuencias del gen ribosomal 16S.
Generalmente se utilizan enfoques de taxonomía polifásica, incluyendo además de éstos, otros métodos de clasificación y de identificación.
Análisis de comunidades complejas mediante métodos que no requieren cultivo Debido a que se recupera un porcentaje bajo de bacterias cultivables mediante las técnicas tradicionales de diferentes ambientes naturales, ha sido necesaria la búsqueda de metodologías que no dependan del cultivo de los microorganismos. Éstas han permitido explorar la diversidad microbiana, analizar la estructura de comunidades microbianas y han revelado que la diversidad microbiana es mucho mayor de lo que se había considerado.
El primer paso es la extracción y purificación del DNA de las muestras. Ésta puede ser directa (extracción del DNA total de la muestra) o indirecta (extracción de microorganismos de la muestra, seguida de la extracción de DNA de éstos).
Posteriormente se amplifican, mediante PCR, ciertas regiones del gen ribosomal 16S.
Dependiendo del grupo de microorganismos que se desee estudiar, se usan desde cebadores muy generales hasta muy específicos (Fig. 1).
Para la separación de los fragmentos de rDNA 16S amplificados, es necesario construir bibliotecas de clonas de rDNA 16S, cuya posterior secuencia y análisis permite determinar la diversidad microbiana. Es posible identificar o determinar cuáles son los microorganismos conocidos más cercanos a los miembros de la comunidad mediante la comparación de las secuencias de los fragmentos de rDNA 16S con las bases de datos, como RDP (Ribosomal Database Project) o Genbank.
La obtención de “huellas digitales”, que constituyen un patrón o un perfil de la diversidad genética de una comunidad microbiana, son las más utilizadas en la actualidad. En este caso se separan electroforéticamente los fragmentos de rDNA amplificados. La aplicación de electroforesis en geles con gradientes desnaturalizantes, como el DGGE** (electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante) y TGGE (electroforesis en gel con gradiente de temperatura) permiten separar fragmentos de la misma longitud pero con diferentes secuencias, que son las características de los obtenidos mediante la amplificación de regiones de los genes ribosomales del DNA de una comunidad microbiana.
De hecho es posible separar fragmentos que difieren en una sola base. Los agentes desnaturalizantes (una mezcla de urea y formamida en el caso del DGGE y la temperatura en el del TGGE) provocan la separación de las cadenas dobles de DNA.
Éstas contienen dominios con temperaturas de fusión (Tm) característicos, de manera que cuando se alcanza una determinada temperatura o concentración de desnaturalizante, la molécula se funde total o parcialmente y disminuye su velocidad de migración en el gel. Las temperaturas de fusión de esos dominios dependen de variaciones en sus secuencias de bases, por lo que los fragmentos correspondientes a microorganismos diferentes tendrán diferentes posiciones en el gel. Para evitar la separación completa de las dos cadenas, se une una secuencia rica en GC (que requiere condiciones más drásticas de desnaturalización), llamada grapa-GC, en el extremo 5´ de uno de los cebadores, que se coamplifica con el segmento de DNA.
Las bandas se visualizan generalmente tiñendo con bromuro de etidio (Fig. 4).
Es necesario determinar cuál de las regiones variables de los genes ribosomales permiten separar los microorganismos presentes, así como optimizar el gradiente y la duración de la electroforesis para obtener la mejor separación de las bandas. Se realizan geles con gradientes perpendiculares (el gradiente es perpendicular a la dirección de la electroforesis) para conocer el mejor intervalo de temperaturas o concentraciones de desnaturalizante. Se obtiene una curva con forma sigmoidea, en la que a baja temperatura o concentración de desnaturalizante los fragmentos migran como cadenas dobles y a concentraciones altas como cadenas sencillas. Las condiciones útiles son las intermedias, en las que las moléculas se funden parcialmente. El tiempo óptimo, que se determina en electroforesis con gradientes paralelos, es el que permite la máxima resolución entre los fragmentos de DNA investigaron la distribución espacial de la microbiota de una bola de pozol. Utilizaron un enfoque polifásico que incluyó la obtención de huellas digitales por DGGE de fragmentos de DNA obtenidos al amplificar la región V3 de los genes de RNA 16S del DNA extraído de la masa, con cebadores específicos para eubacterias. Demostraron que bacterias del género Streptococcus, que no habían sido detectadas utilizando los métodos tradicionales de cultivo, predominan durante la fermentación.
**Un método clave en la separación de productos de la PCR es la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente.
Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE): separación de genes similares La amplificación por PCR con un conjunto de cebadores da lugar generalmente a una única banda de gel que contiene fragmentos de DNA amplificado de un solo tamaño. A pesar de su aparente pureza, la banda puede contener un número elevado de genes muy relacionados, pero no idénticos. Esto sucede porque aunque los lugares donde se unen los cebadores del gen diana están muy conservados, la secuencia de nucleótidos entre esos lugares de unión puede variar como resultado de la divergencia evolutiva del gen diana en las diferentes especies. Para el análisis filogenético de las secuencias de los genes amplificados se necesita un paso extra para distinguir las formas diferentes del gen antes de iniciar la secuenciación. Un método para hacerlo es mediante la clonación molecular.
Otra posibilidad en lugar de la clonación molecular es la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE).
La DGGE es un método de electroforesis en gel que separa los genes del mismo tamaño que difieren en la secuencia de bases. La técnica utiliza un gradiente de una mezcla de urea y formamida que desnaturaliza el DNA. Un fragmento de DNA bicatenario se desplaza por el gel y cuando llega a una determinada concentración “desnaturalizante” se interrumpe.
Las diferencias en las propiedades de separación de las cadenas depende en gran parte de las diferencias en la secuencia de bases. Por tanto, las bandas observadas en un gel de DGGE con formas diferentes de un gen determinado que varían, a veces muy poco, en sus secuencias.
Las bandas individuales obtenidas por DGGE se pueden cortar y secuenciar. Con genes del rRNA 16S, por ejemplo, el análisis por DGGE proporciona una visión detallada del número de filotipos (genes rRNA 16S distintivos) presentes en el hábitat. Secuenciando estas bandas, es posible determinar las especies presentes en la comunidad por comparación de las secuencias de las especies conocidas disponibles a partir de bases de datos apropiadas. Con otros genes (por ejemplo, genes metabólicos) se obtiene información acerca del número de tipos diferentes de organismos presentes en la comunidad que contiene el gen específico. Pero incluso sin secuenciar las bandas, el análisis por DGGE revela la biocomplejidad de un hábitat con respecto a un gen específico, y también se puede emplear para otros análisis de la comunidad, como los enriquecimientos y la FISH.
Versión complementaria del PCR-RFLP.
T-RFLP: polimorfismo de longitudes de fragmentos de restricción terminal para el análisis de comunidades bacterianas de muestras ambientales. En el T-RLFP, el DNA es amplificado por PCR con uno de los dos Primers marcados con fluorescencia. Después de la amplificación, el DNA es tratado con enzimas de restricción y los fragmentos de restricción separados en un gel de acuerdo con su tamaño. Los fragmentos de restricción terminal (TRFs) se marcan con fluorescencia y pueden ser detectados y cuantificados en un secuenciador automático. Se puede construir una base de datos de TRFs a partir de especies conocidas y utilizarla en correlaciones taxonómicas con los haplotipos detectados en el análisis T-RFLP.
Pirosecuenciación Resumen técnica: Se trata de una técnica no fluorescente que mide la liberación de pirofosfato en una reacción de polimerización mediante una serie de reacciones enzimáticas acopladas que liberan luz cada vez que se incorpora un nucleótido; producen una imagen que se analizan para proporcionar flujogramas que, una vez interpretados por el ordenador, devuelven las secuencias de nucleótidos.
Fundamentos técnica: Tenemos una esfera a la que unimos el segmento de DNA que queremos secuenciar.
También necesitaremos un primer para producir la polimerización y una polimerasa para llevar a cabo la acción. Como residuo de la polimerización se liberaran dos residuos de Pi juntos aprovechados por la sulforilasa para producir ATP, ATP utilizado por la luciferasa para una reacción que resulta en la producción de luz.
El segmento de DNA desnaturalizado a secuenciar, y las enzimas: sulforilasa y luciferasa. Todos estos elementos, se introducen en unas celdas o pocillos.
Se van incorporando soluciones de nucleótidos, cada vez de un tipo y una vez comprobado si este era el nucleótido necesario para continuar la cadena en polimerización o no, se lava el pocillo para introducir otro tipo de nucleótidos y así hasta completar el secuenciado. Solo en aquellos pocillos en los que la polimerasa pueda incorporar ese nucleótido veremos luz.
Solo en los pocillos que haya luz, será donde la base introducida era la buscada. Puesto que cuando la polimerasa forma el enlace fosfodiester entre el núcleótido previo y el recien incorporado, se libera PPi, producto utilizado por la enzima sulforilasa como sustrato en una reacción que libera ATP, ATP posteriormente utilizado por la luciferasa en una reacción que supone quimioluminescencia.
Métodos no dependientes de PCR ...