Tema 3 - Blotting (III) - Detecció de metilacions en el DNA (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 27/03/2016
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 DETECCIÓ DE MUTACIONS I METILACIONS EN EL DNA Southern blot RFLPs – Detecció de metilacions en el DNA Com ja havíem dit, a partir dels RFLPs en els Southern blots, a banda de canvis de seqüència, o de determinar la presència i abundància de seqüències, també podem detectar canvis epigenètics (modificacions químiques de les bases nitrogenades.
Metilacions de les dianes de restricció Concretament, ens centrarem un canvi epigenètic fonamental: les metilacions . Per a la detecció de metilacions, utilitzarem enzims les dianes dels quals estiguin metilades preferentment en citosines o en dinucleòtids CG.
En el Southern blot usarem doncs enzims de restricció sensibles i insensibles a les metilacions (per comparar els dos patrons, el metilat i el no metilat). El procediment més freqüent és el que utilitza dos enzims isoesquizòmers, com ara HpaII i MspI. Aquests enzims discriminen si les C estan o no metilades.
Els isoesquizòmers són enzims que reconeixen la mateixa seqüència i produeixen el mateix tall tot i provenir de diferents espècies.
- HpaII. Sensible a la metilació; quan la seqüència està metilada, l’enzim no la talla. La seva diana de restricció és CCGG.
MspI. Insensible a la metilació; quan la seqüència està metilada, l’enzim és capaç de tallar-la igual. La seva diana de restricció també és CCGG.
En el Southern blot, el que fem és digerir un fragment amb els dos enzims i comparar els fragments generats per la digestió dels dos enzims.
Comparació de patrons a) Diana no metilada. Tenim tres dianes que reconeixen els dos enzims. Cap de les dianes està metilada. Quan digerim amb els dos enzims, els dos tallaran les mateixes dianes, i obtindrem el mateix patró de restricció en ambdós casos.
b) Diana metilada. Quan la diana està metilada, l’enzim HpaII no la reconeix i no la talla, com si s’hagués perdut la diana. L’enzim MspI és sí que la reconeix i si que talla. El patró de restricció obtingut amb aquest enzim serà el mateix que en el cas en que la diana no està metilada. És per això que s’utilitza l’enzim MspI com a patró de referència. Si hi ha metilació, el patró de restricció de HpaII canviarà en comparació amb el de MspI.
87 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Com veiem a la imatge, en el carril de HpaII desapareixen dues bandes i n’apareix una de nova corresponent a la suma de les dues que han desaparegut (donarà el mateix pes).
Per tant això ens indicarà la presència d’una metilació.
En el cas de LOH (pèrdua d’heterozigositat), no sempre desapareixen les bandes; poden presentar-se però menys intenses. No tot el 100% de les còpies de DNA estaran metilades en el mateix punt. Llavors, algunes còpies presentaran el patró metilació corresponent a l’alíquota de MspI (les que tinguin les dianes sense metilar) però seran menys intenses.
Per saber la proporció de dianes metilades hem de calcular la proporció de la intensitat que s’ha perdut en el carril digerit amb HpaII comparant amb el que s’ha digerit amb MspI. És a dir, per saber que una pèrdua d’intensitat no és degut a que hi ha menys quantitat de DNA en un carril que en un altre, hem de comparar les bandes del mateix carril entre si; ens hem de fixar en la intensitat relativa de les bandes.
El % de pèrdua d’intensitat d’una banda indica el % de còpies metilades i no metilades. Si no apareix la banda, estarà metilat al 100%. Si només hi ha un 50% de pèrdua d’intensitat, la meitat de les còpies de DNA estaran metilades i l’altre meitat no.
88 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Ratolins transgènics El grau de metilació de la regió promotora dels transgens es determina comparant la intensitat relativa de la banda d’1,04 kb obtinguda per MspI amb l’obtinguda per HpaII.
En aquest esquema només es mostren els resultats de la banda que presenta diferents intensitats en cada mostra (es dona per suposat que la resta té la mateixa intensitat). Els resultats que observem són els següents: - Dues primeres mostres. La intensitat entre bandes és exactament igual: no hi ha hagut metilació.
Dues últimes mostres. La intensitat entre les bandes és diferent: sí hi ha hagut metilació.
En aquesta imatge tenim la digestió d’un transgen en ratolins amb els dos enzims. Només es mostra una banda. En els dos primers casos, hi ha la mateixa intensitat de bandes amb els dos enzims; concloem que no hi ha metilació. En canvi en els dos darrers casos hi ha una banda més tènue al segon carril; aquesta banda correspon a còpies metilades.
El transgen es comporta com una seqüència estranya i les cèl·lules l’acostumen a metilar; molts transgens que són de còpia única pateixen metilacions que fan que no s’expressin.
89 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 La hidroximetilació Com hem dit, els transgens inserits es comporten com a seqüències estranyes en l’organisme. Com a mecanisme de defensa d’aquest, les cèl·lules tendeixen a metilar-les per protegir-se.
Això també passa en insercions de transposons i d’elements mòbils; la majoria de mamífers metilen les seqüències estranyes per evitar la inestabilitat que generen en el genoma. En els processos tumorals és al contrari; es donen hipometilacions en aquestes seqüències, cosa que provoca inestabilitat genòmica i càncer.
Un dels marcadors més importants del DNA és la citosina metilada (5- metil citosina).
Aquesta citosina, almenys en els mamífers, està implicada en la regulació de l’expressió gènica, de manera que quan hi ha hipermetilació hi ha silenciament del gen, i quan hi ha hipometilació hi ha expressió del gen.
Fa 7 anys es va trobar que la forma hidroxilada de la 5 – metil citosina, l’anomenada 5 hidroxi metil citosina, es pot considerar com un marcador epigenètic. Si la metil citosina va ser considerada per alguns com la 5ena base del DNA, aquesta hidroxilada va ser considerada com la 6ena.
Es va trobar inicialment en bacteriòfags de tipus T com a mecanismes de protecció del DNA quan infectaven bacteris; la forma glucosilada de la base impedia que els enzims de restricció l’afectessin.
També s’ha trobat en mamífers que aquesta forma hidroxilada està associada a canvis en l’expressió gènica, sobretot en cèl·lules del sistema nerviós.
Aquesta forma s’origina per l’acció d’enzims que tan poden oxidar la citosina de la 5 – metil citosina, com la poden hidroxilar. També hi ha enzims que la modifiquen donant lloc a altres formes com la 5 – formilcitosina i la 5 – carboxil citosina. Aquestes transformacions són considerades com a via de desmetilació, perquè aquestes formes (la formil i la carboxil) són escindides com a bases rares (per una glucosidasa de la timina del DNA), donen lloc a punts abàsics que són reparats pel mecanisme de reparació retornant a una citosina.
90 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Així doncs, la 5-metilcitosina silencia i la seva forma hidroxilada activa l’expressió gènica.
Quan hidroxilem la base, podem estar expressant gens que anteriorment estaven silenciats.
Aquest canvis de patró de metilació o hidroximetilació de les citosines és un element a analitzar de cara a algunes patologies lligades al sistema nerviós que van associades a canvis de metilació de les citosines. Alteracions en aquestes bases són indicadors de diagnòstic de certes patologies.
Com hem dit, l’enzim HpaII és sensible a qualsevol metilació; no tallarà si troba 5mc ni si troba 5hmc. En canvi MspI no es veu afectat per la metilació. Per tant, no podrem discriminar si les cèl·lules es troben metilades per la forma 5mc o per la forma 5hmc. Ara bé; MspI no pot tallar la forma glucosilada (5-ghmC). Per tant el que fem és tractar el DNA per transformar la 5hidroximetilcitosina en glucosil 5 – hidroximetilcitosina mitjançant una glucosil transferasa.
Llavors podrem distingir si les citosines metilades són la 5hmC o la 5mC.
91 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Treballarem amb dues mostres del DNA; una la tractarem amb glucosil transferasa i l’altra no. Tot seguit es digereix amb els dos enzims. HpaII ens donarà el mateix patró hi hagi el que hi hagi perquè no detecta res. L’enzim MspI no detectarà la 5-hidroximetilcitosina, i tallarà el fragment, però si està present la 5-ghmc, no la podrà tallar, i aleshores podrem distingir els patrons de tall.
10/03/16 S’han incorporat múltiples enzims per la detecció de canvis epigenètics. Alguns simplement detecten metilacions, són específics de dianes metilades (tallen si està la diana metilada).
Alguns són enzims que detecten metilacions, és a dir, són específics de dianes que estan metilades.
92 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Així doncs tenim dues estratègies d’ús de cara als enzims de restricció disponibles: - - Enzims isoesquizòmers. Un serà sensible a la metilació i un no (com els que hem vist).
Aquesta estratègia permet un control robust; sabrem que el canvi de patró de restricció no és degut a una mutació, sinó a una metilació.
Endonucleases específiques de metilacions. Només tallaran quan trobin metilacions. Aquí el control no és tan robust.
Aquests enzims que tallen de forma específica les metilacions, com ara el McrBC, detecten citosines metilades i tallen quan en troben dues seguides d’una purina quan estan en dues cadenes oposades i a una distància que pot arribar fins a 3 kb. McrBC talla sempre que hi hagi dues citosines metilades, sense diferenciar si són 5mC o 5hmC.
L’especificitat de les dues estratègies és diferent; aquesta darrera únicament s’utilitza per detectar citosines metilades. Aquests enzims específics de metilació funcionen al revés que les parelles d’isoesquizòmers, ja que tallen quan troben una metilació. En funció del que vulguem detectar triarem uns enzims o uns altres.
Usant enzims específics de metilació, els canvis podrien ser originats per mutacions i no per metilacions. Així doncs, les parelles d’isoesquizòmers ofereixen un control molt més robust que la que donen els enzims que tallen únicament per metilacions.
Per estudiar el grau de metilació, la hidroximetilació o qualsevol altre forma oxidada de la 5metilcitosina, podem fer servir tècniques analítiques de cromatografia, espectrometria de gasos... ara bé, hi ha tècniques analítiques molt costoses.
93 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Les tècniques més econòmiques són les que utilitzen sistemes de detecció immunològica o anticossos. En casos de formes oxidades estranyes, el que s’intenta és potenciar el senyal ja que acostuma a emetre un senyal molt dèbil. Llavors, en lloc de conjugar anticossos secundaris amb peroxidases, els conjuguem amb biotines mitjançant una tercera capa amb estreptomicina. Aquesta capa incrementa el senyal dels grups químics que tenen incorporades les peroxidases, de manera que el senyal és més potent.
Les tècniques de seqüenciació de noves generació permeten també saber la distribució de les formes estranyes de les bases nitrogenades.
94 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Alternatives al blotting A partir de les tècniques de blotting n’han derivat moltes altres basades en la PCR, hibridacions in situ fluorescent... A més, en ocasions es necessària informació complementària a l’ús dels blottings.
95 ...