Cultius Cel·lulars T2 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 12/03/2015
Descargas 4

Vista previa del texto

1 TEMA 1. INTRODUCCIÓ, HISTÒRIA I EQUIPAMENT BÀSIC.
2 TEMA 2. PRINCIPIS BÀSICS DE CULTIUS CEL·LULARS.
2.1 CULTIU PRIMARI Tota línia cel·lular que es pugui cultivar prové d’un organisme. El cultiu primari és aquell que obtenim directament d’aquest, a partir d’un fragment de teixit n’aïllem les cèl·lules i les cultivem. En el teixit, les cèl·lules estan unides entre elles i amb la MEC, i per aïllar-les el primer que cal és separar-les.
2.1.1 D’explant Aquest mètode es fa per a cèl·lules sensibles a disgregació enzimàtica. És molt més lent comparat amb aquest.
1 Disgregació mecànica: agafem un tros de teixit que haurem conservat en solució salina isotònica i el tallem en fragments el més petit possibles amb unes tisores o bisturí estèril.
2 Posem els fragments en un flascó o placa i una mica de medi. Llavors les cèl·lules començaran a separar-se del teixit (“explant”) i colonitzaran aquest medi.
3 Al cap d’un temps retirem l’explant i afegim més medi.
2.1.2 Per disgregació enzimàtica És un tractament que es basa en utilitzar tripsina per tallar les unions cèl·lula-cèl·lula i cèl·lula-MEC. És important el control de la temperatura d’aquest tipus de cultiu, ja que si el fem a 37ºC la tripsina tallarà molt ràpidament i el procés serà molt més curt, mentre que si el fem a 4 ºC pot ser molt més llarg doncs no hi ha perill que la tripsina digereixi les proteïnes de membrana.
En aquest tipus de cultius, és important que abans d’aplicar-hi la tripsina fem un rentat amb solució salina lliure de Ca i Mg, doncs les cadherines utilitzen aquests ions per estabilitzar les unions cèl·lulacèl·lula. D’aquesta manera les unions seran més febles i el tractament amb tripsina serà més curt i eficient.
Quan treballem amb teixits molt rics en col·làgen, en lloc de treballar amb tripsina treballem amb col·lagenasa per aconseguir una major eficiència.
Un cop tenim les colònies, podem separar-les del medi per subcultivar-les amb una “llengua de gat”.
Procés que cal fer amb molta cura perquè les cèl·lules són molt sensibles a l’impacte mecànic.
2.2 SELECCIÓ DE LA CÈL·LULA D’INTERÈS.
Del fragment que hem disgregat mecànicament i enzimàticament obtenim una suspensió cel·lular.
Normalment, les biòpsies contenen molts tipus cel·lulars que cal separar per tal de seleccionar aquells que ens interessen per al nostre cultiu. Si sabem que les cèl·lules del teixit tenen pesos o mides diferents podem fer una centrifugació.
Un altre mètode de separació més sofisticat consisteix en què apliquem a la mescla cel·lular un anticòs amb afinitat per una proteïna cel·lular concreta. Si unim l’anticòs amb una molècula de ferritina, i seguidament hi apliquem un camp magnètic, les cèl·lules marcades seran atretes per aquest i migraran cap a un pol del tub, la qual cosa ens permetrà separar-les fàcilment.
MACS: un anticòs porta una regió paramagnètica que reconeix una proteïna. Quan el camp magnètic s’activa, les cèl·lules marcades queden retingudes i la resta elueixen. Seguidament desactivem el camp magnètic i recolim les cèl·lules d’interès.
FACS o citometria de flux: en aquest cas els anticossos estan marcats amb un fluorocrom, un compost que quan s’excita emet fluorescència. Les cèl·lules passen per un dispositiu que emet un raig làser, i quan ho fan interrompen aquest feix lluminós. Si la cèl·lula ve marcada amb el fluorocrom, aquest és excitat pel raig, emet fluorescència i pot ser detectada. El sistema reconeixerà la cèl·lula i la posarà dins d’una gota amb càrrega, que ens permetrà separar-la de la resta.
Ara ja tenim el tipus cel·lular d’interès aïllat. Podem començar a cultivar una línia cel·lular.
2.3 CULTIU DE LA LÍNIA CEL·LULAR I EXPANSIÓ.
Per cultivar les cèl·luls cal posar-les en un medi de cultiu. Les cèl·lules que necessiten adhesió per créixer s’estenen per tota la superfície de la placa/flascó, i quan això passa deixen de dividir-se. És el fenomen anomenat “inhibició per contacte”: cessament de la proliferació cel·lular perquè una cèl·lula està envoltada d’altres cèl·lules.
Quan s’han dividit suficientment es fa una tripsinització, rentat amb PBSA per eliminar restes de Ca i Mg i una resuspensió. Comptem el nombre de cèl·lules per unitat de volum que hi ha amb l’hemocitòmetre, seleccionem el volum de suspensió cel·lular que conté el nombre de cèl·lules que volem i fem un subcultiu. Si fem aquest procés successivament obtindrem una expansió del cultiu.
2.3.1 Dinàmica de creixement dels cultius cel·lulars.
Tots els cultius segueixen la dinàmica del gràfic: una primera fase de latència o “lag phase”, que dura 24h i en la qual les cèl·lules no es divideixen perquè s’estan adherint a la superfície. A partir d’aquí, s’entra en la fase de creixement exponencial, i s’acaba quan s’ha ocupat tota la superfície degut a la inhibició per contacte com ja hem dit (“fase plateau”).
Si volem fer l’expansió ben feta, cal tripsinitzar i subcultivar abans de la fase plateau. En aquesta fase, algunes de les cèl·lules passen a l’estat G0, de manera que quan proliferin ho faran més lentament perquè hauran de re-incorporar-se al cicle cel·lular.
2.4 CLONATGE A vegades ens interessa tenir cèl·lules que siguin genèticament idèntiques entre elles. La clau està en diluïr molt el tipus cel·lular del cultiu primari d’una mostra, de manera que quan sembrem faran colònies independents, molt separades les unes de les altres. Aquest tipus de cultiu és millor si es fa en medi semisòlid com methocel o agarosa, perquè les cèl·lules queden atrapades a la gelatina i fan colònies en llocs molt focalitzats. Tanmateix, aquest mètode no sempre funciona, doncs les cèl·lules necessiten la proximitat d’altres cèl·lules per a poder replicar-se. Les cèl·lules autocrines poden autoestimular-se amb factors de creixement i proliferar independentment per la resta; per això van millor per a fer clons.
Per recuperar les colònies fruit del clonatge podem fer-ho amb uns anells d’acer que es posen sobre la colònia, i llavors només tripsinitzem aquella que ens interessa per a fer tot el procés posterior (rentat, resuspensió, subcultivació). Si fem créixer les colònies en medi semisòlid les podem “xuclar” amb una pipeta.
2.5 CRIOPRESERVACIÓ Un cop hem fet l’expansió del cultiu cal fer la criopreservació per tal de mantenir els stocks de cèl·lules congelades. Per fer-ho, cal aplicar al medi de cultiu un crioprotector com pot ser el dimetilsulfòxid (DMSO) o el glicerol. El què fan aquests compostos és substituïr l’aigua de l’interior cel·lular perquè quan es congelin no es formin cristalls que poden llisar la cèl·lula. S’utilitzen en concentració del 10%. Després es procedeix a la congelació, baixant la temperatura un grau per minut (molt lentament) fins arribar a -80ºC. Si es vol, després podem aplicar-hi N líquid.
Per descongelar els stocks cel·lulars, ho podem fer directament al bany maria a 37ºC, procurant que l’aigua només toqui la part de baix del vial i no arribi al tap perquè podria contaminar-lo.
2.6 AVANTATGES I DESAVANTATGES DEL TREBALL AMB CULTIUS.
Cal dir que en general ens ofereixen molts avantatges. El més important és que ens permet reproduïr l’experimentació, i que ens permet tenir cèl·lules caracteritzades. La caracterització és essencial, perquè així si un cultiu surt malament podrem saber si és perquè les cèl·lules de dues línies cel·lulars se’ns han barrejat.
Els cultius també ens permeten un alt rendiment en quant a producció a gran escala d’hormones, proteïnes, productes bioquímics, etc. En l’àmbit industrial, les línies cel·lulars productores poden tenir alteracions però el seu cariotip no pot variar més d’un 5% respecte la cèl·lula original.
Un dels principals desavantatges dels cultius és que aquestes tendeixen a inestabiltizar-se genèticament, siguin del tipus que siguin. Sabem que les línies que procedeixen de tumors ja de per si soles presenten aquestes alteraciions. Aquesta inestabilitat pot presentar problemes en determinats tipus d’experimentació.
2.6.1 BIOREACTORS En producció industrial és important el treball amb bioreactors. Aquests ens permeten tenir les cèl·lules en suspensió i continu moviment, per tal de que aquestes produeixin de forma òptima el producte que ens interessa. D’aquest conjunt cel·lular n’anomenem “lot”. Si cultivem en placa, no podem tenir lots, perquè produïm el producte de forma seqüencial (s’han desenvolupat tècniques a gran escala per produïr d’aquesta forma, també). Un cop tenim en el bioreactor la quantitat suficient de producte que volem, el parem, purifiquem el medi per extreure el producte i eliminem el lot cel·lular, substituïnt-lo per un de nou i de més eficient.
Alguns bioreactors permeten filtrar només el producte i deixar les cèl·lules, però és un mètode poc eficient perquè moltes cèl·lules es moren en el procés. Es pot fer si les cèl·lules són realment resistents.
2.7 CÈL·LULES TRANSFORMADES I CÈL·LULES IMMORTALITZADES.
La corba de la gràfica representa el nombre de cèl·lules en funció del temps. Si només regenerem el medi i no canviem el nombre de cèl·lules (cultiu en “batch”), quan arribem a un determinat nombre de divisions aquestes entren en senescència i finalment moren. A vegades per atzar algunes cèl·lules de la població senescent superen aquesta fase i s’immortalitzen. Se sap que un dels mecanismes per aconseguir aquest estat és l’activació del gen de la telomerasa. El gen de la telomerasa té un RNA propi que permet retrotranscriure’s a DNA (Alerta: una cèl·lula immortalitzada viu eternament, sempre i quan tingui els nutrients i les condicions essencials per viure).
Cal distingir entre línia immortalitzada i línia transformada. La línia transformada està immortalitzada però té altres característiques, com per exemple que poden créixer sense inhibició per contacte. Les cèl·lules normals en general (excepte els queratinòcits de la nostra pell i altres cèl·lules epitelials, que fan estrats) formen una sola monocapa fins que se’ls acaba l’espai; les cèl·lules transformades creixen les unes sobre les altres quan això passa i formen el que s’anomena un “foci”. Si injectem cèl·lules transformades en animals immunodeprimits els provoquem tumors, i a més tenen capacitat angiogènica, és a dir, produeixen molècules que estimulen a les cèl·lules dels vasos sanguinis a formar venes i capil·lars per irrigar-les. A més, tenen un nivell més alt de saturació.
Les cèl·lules tumorals són transformades. Les línies cel·lulars establides a partir de tumors es consideren transformades. És possible transformar cèl·lules immortalitzades, però no sempre les cèl·lules transformades poden immortalitzar-se.
En la gràfica veiem dues línies que ens indiquen la velocitat de replicació de cèl·lules normals i cèl·lules transformades. La pendent de la recta de les cèl·lules normals és més baixa que la de les transformades, la qual cosa ens indica que el temps necessari per duplicar la població cel·lular en poblacions de cèl·lules transformades és més petit. El ràpid creixement de les cèl·lules transformades és degut a que secreten factors de creixement autocrins que autoestimulen el seu propi creixement. (Nota: Quan comparem velocitats de creixement de cèl·lules hem de procurar que sempre estiguem parlant del mateix tipus cel·lular).
Més característiques de les cèl·lules transformades: tenen una alta taxa de mutació, són independents d’ancoratge, produeixen proteïnes poc habituals degut a la seva inestabilitat genètica (per exemple cèl·lules epitelials que en comptes de fer filaments intermedis de queratina els fan de vimentina). A més, la variabilitat del nombre de cromosomes en cèl·lules transformades és molt més alta que en les cèl·lules normals.
...