Sesiones problemas 1 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 2º curso
Asignatura Bioquímica II (Biología molecular)
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 19/04/2016
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Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 PROBLEMAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR SESIÓN 1- Cómo cuantificar cambios de la expresión génica con técnicas como Northern blot / Q-PCR / microarrays o chips de DNA Vamos a ver una serie de conceptos que son básicos y que se preguntaran en la prueba de ensayo.
ELECTROFORESIS DE DNA § En esta técnica se separan los fragmentos de DNA en función de su tamaño.
§ Se utiliza un soporte casi sólido. Los dos principales son: - Agarosa = poro muy grande à resolución para fragmentos DNA grandes - Acrilamida = poro muy pequeño à resolución para fragmentos DNA pequeños * Elegir un tipo de soporte u otro será en función del tamaño del DNA que se analiza. Porque cada uno tiene un tamaño de poro distinto.
Además, se puede jugar con el porcentaje al cual se hacen los geles. No es lo mismo hacer un gel al 5% de acrilamida que un gel al 20%. Del mismo modo que tampoco es lo mismo hacer un gel 0’5% agarosa que al 2%. A mayor porcentaje, el tamaño del poro disminuye.
De modo que, jugando con el porcentaje, podemos separar desde fragmentos de ADN de dos pares de bases hasta megabases(Mb). Cuando interesa trabajar con geles que separen fragmentos con megabases, se utilizaran geles de agarosa. Mientras que cuando se quiera separar fragmentos de ADN muy pequeños, su recurrirá a la acrilamida.
§ El soporte se incorpora en un campo eléctrico (𝐸). Como el DNA tiene carga negativa correrá hacia el polo positivo.
§ Desaparición del efecto carga: en las condiciones electroforéticas normales (visto en prácticas) la separación no ocurre per carga y tamaño sino exclusivamente por tamaño.
Esto se debe a que cuando mayor sea el DNA, mayor será su carga. De modo que es proporcional, la electroforesis se resuelve por tamaño.
§ Tipos de electroforesis: Polo –       + Polo     à Geles unidimensionales = visto el año pasado. Se genera un polo positivo y uno negativo. La mayoría de los geles son de este tipo.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 à Geles bidimensionales = como dice su nombre, se corren los Polo – fragmentos en dos dimensiones. Por ejemplo: 1. A un gel de agarosa se le aplica una primera dimensión, Polo + es decir, los fragmentos de ADN se resuelven en una dirección. Esta electroforesis es sin presencia de Bromuro de etilo*, de modo que el ADN corre con sus estructuras originales (separación por tamaño y morfología).
2. A continuación, se corta la resolución de un carril y se añade en un gel nuevo, pero en posición horizontal.
3. Se aplica la siguiente dimensión en otra dirección. Esta segunda electroforesis se hace en presencia de Bromuro de Polo – etilo* (BrEt), de modo que el ADN queda modificado (separación solo exclusivamente por tamaño).
Polo + - - à Campo pulsante = los polos se localizan en las esquinas y nunca funcionan simultáneamente, sino que se activan siempre por esquinas opuestas. Pulsante indica que los polos se activan + + con una cierta frecuencia, en varios ciclos por segundo. De modo que el 𝐸!⃗ se genera de una esquina a la otra y de forma alternativa formando cruz.
- - Con este método el ADN avanzará haciendo una forma de zigzag.
Se consigue tener un recorrido mucho mayor. Estos geles se utilizan para separar fragmentos de ADN muy grandes (Ej.
+ § + cromosomas de levadura), hasta 6-10 Mb.
Agentes intercalantes y tinción por fluorescencia: como el ADN no es visible necesitamos marcarlo de algún modo. Para ello se usan agentes intercalantes, el más común: - El BrEt es un agente intercalante, es decir, se intercala entre las dos hebras de DNA. Además, tiene fluorescencia, pero solo la emite cuando se intercala entre el ADN y entra en resonancia con las bases. Al intercalarse lo que hace es romper estructuras (puentes de hidrógeno), por lo tanto la estructura del ADN queda modificada (hablamos de un agente cancerígeno). Lo que vemos no es exactamente ADN, sino el BrEt emitiendo fluorescencia en ser irradiado.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 En la imagen se observa una electroforesis para un fragmento de ADN: - Fragmento de fago-lambda (bacteriófago).
- Presenta unas 50kb (50.000 bp).
- El ADN se ha digerido con enzimas de restricción (EcoRI y BamHI).
- Obtenemos el patrón de restricción para dos enzimas de restricción distintos.
- Con ellos podemos hacer un mapa de restricción.
* Los enzimas de restricción son enzimas que reconocen una secuencia específica del ADN y la cortan.
TRASNFERENCIA A FILTROS (SB Y NB) § Cuando se hace un Southern o Northern Blot, se debe marcar una sonda.
§ Recordatorio WB à electroforesis y transferencia proteínas a un membrana (mucho más resistente para trabajar con ella que los geles de agarosa y acrilamida) donde son reconocidas/marcadas mediante un anticuerpo (Ab) que reconoce una proteína específica.
§ El mismo proceso aplicado al WB se puede aplicar al ADN, pero en lugar de utilizar Ab, se usan otros trozos de ADN que deben marcarse § Estos trozos/sondas pueden marcarse de distintos modos; veremos el marcaje radioactivo, que puede hacerse de distintos modos: 1. Marcando un extremo 5’: mediante T4 polinucleótido quinasa (aislada del bacteriófago T4). Es una quinasa que fosforila ADN en 5’.
De modo que necesitaremos ADN con un extremo 5’ libre al cual Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 añadiremos T4 quinasa y ATP. La quinasa cogerá el Pi y lo incorporará en el extremo 5’ del ADN. Si se utiliza un ATP cuyo Pi* es radioactivo, el ADN quedará marcado por radioactividad. La mayoría de los fragmentos de ADN tendrán en consecuencia un fosfato en su extremo 5’.
* Si el ADN que marcamos es un producto de PCR no tendrá Pi* porque el extremo 5’ ya vendría marcado por los óligos sintéticos (las máquinas los sintetizan sin Pi) utilizados en esta técnica de amplificación.
De modo que este método requiere una reacción de equilibrio que es de hecho la diferencia entre exchange y forward reaction: - Exchange (R. De intercambio): cuando hay Pi - Forward reaction (R. Directa): cuando no hay Pi El resultado para ambas técnicas, será un extremo 5’ radioactivos. Si se utiliza una reacción directa todos extremos 5’ serán radioactivos. Mientras que si se utiliza una reacción de intercambio, habra un porcenatje de los extremos 5’ que tendrá Pi* y otro porcentaje que tendré Pi no radioactivo.
2. Marcando toda la cadena: mediante Klenow DNA polimerasa. Se trata de un fragmento proteolítico de la DNA polimerasa I de E. Coli. Se sabe que esta polimerasa tiene 3 actividades, de las cuales Klenow solo presenta actividad ADN polimerasa y exonucleasa 3’ à 5’. Se utiliza porque es muy estable.
* Actividades de la DNA polimerasa I: DNA polimerasa, exonucleasa 3’ ! 5’ (corrección) y exonucleasa 5’ ! 3’ (reparación).
Lo que se hace es sintetizar DNA radioactivo. Para lo cual necesitamos: moldes + cebadores + dNTP (deoxinucleótidos) + klenow.
5’ 3’ 3’ 5’ + dNTP + Klenow Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 Si juntamos todos estos componentes bajo las condiciones adecuadas, sintetizaremos ADN. Como además se añade dentro de los dNTP à dATP* (radioactivo), el ADN que se sintetice será radioactivo.
* ¿Puede utilizarse el mismo ATP que para T4 quinasa? No, debido a que es necesario que el Pi* se encuentre en posición alfa, y el fosfato del ATP de T4 se encuentra en posición gamma. Estando en esta posición , no llegaría a incorporarse en el ADN, ya que en el ADN solo se incorpora la base, el azúcar y el primer fosfato (alfa) dl ATP. Además, hay un segundo motivo por el cual no podemos utilizar el mismo ATP de T4, y esto es que necesitamos deoxinucleótidos (dATP/dNTP) y claramente ATP no lo es.
§ Por lo tanto, es importante saber diferencia entre WB, SB y NB: - WB à electroforesis de proteínas transferida a un membrana (mucho más resistente que un gel de acrilamida, permite poder trabajar con ella). Si se hace con gel agarosa todavía son más frágiles que los de acrilamida.
- SB à electroforesis de DNA y transferencia a membrana (*Southern: si que existió un hombre llamado así, que fue el inventor del SB, Edwin Southern.
En los casos de Western y Northern no existió nunca nadie con esos apellidos).
- NB à electroforesis de RNA y transferencia a membrana. En este tipo de técnicas se estudia lo que le ocurre a un o dos genes.
En la imagen se observan los resultado de un NB (RNA).
Wild type Alguna mutación? Lo que se quiere estudiar es lo que le pasa a un mRNA específico bajo diversas condiciones aplicadas en la Tiempo electroforesis.
En aquellos puntos con mayor señal radioactiva, implica que en la muestra de RNA había una mayor cantidad de mRNA.
Básicamente lo mismo que en el WB: en aquellos puntos Control presencia rRNA donde la banda es más ancha o la marca de los Ab es mayor, esto significa que hay mayor cantidad de proteína.
§ En el NB, puede estudiarse 1 solo gen o más de uno. En el caso de querer estudiar lo que está ocurriendo en 2 genes, se puede realizar una hibridación con 2 sondas específica. Y los mismo con 10 genes y más. Pero para un número muy elevado de genes este proceso es muy lentoà se usan los microarrays.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 MICROARRAY § Un microarray permite observar lo que le ocurre a todo el transcriptoma de un organismo, es decir, que es lo que les ocurres a nivel de transcripción a todos los genes de un organismo § Tiene el tamaño de un porta pequeño (10 x 3cm) § Caben hasta 200.000 puntos, cada punto correspondiente a un gen. Dado que en el genoma humano tenemos aproximadamente 30.000 genes, se pueden estudiar todos los genes de un humano (incluso varias veces).
§ Un microarray permite estudiar qué es lo que le sucede a nivel de expresión a todos los genes humanos.
§ Fabricados por casas comerciales debido a que cada vez más presenta aplicaciones clínicas § ¿Cómo funciona? Supongamos que se quiere estudiar qué es lo que le pasa al transcriptoma de unas células de cultivo bajo dos condiciones distintas (sample 1 y sample 2): 1.
Suponemos estudio trasncritpoma de células de un tumor (sample 1) en comparación con las células de tejido sano (simple 2). Se quiere saber qué genes están expresando 2.
Obtención RNA 3.
Se hace cDNA (DNA complementario) mediante un enzima (transcriptasa reversa) capaz de sintetizar DNA a partir de RNA 4.
La síntesis de cDNA se hace a partir de nucleótidos fluorescentes. Cada condición presentará distinto color: - cDNA sample 1 à fluorescencia roja - cDNA sample 2 à fluorescencia verde 5. Finalmente se añaden en el microarray Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 6. Como en cada punto hay secuencias pequeñas de cada uno de los genes, si dicho gen hibrida se observará fluorescencia. Por lo tanto, se lava el microarray y se escanea con luz UV.
§ Análisis de los resultados: se estudia si la luz de cada punto es verde, roja, negro o gris.
Esto lo hace un ordenador porque el objetivo es que sea cuantitativo. Puntos que se observan: - Verde à gen solo se expresa en simple 2 - Rojo à gen solo se expresa en simple 1 - Amarillos à se expresan ambos genes por igual - Marrón à se expresan los dos pero más la condición 1 que la 2.
Mini-sección de un microarray *Cuando dos genes tienen patrones de expresión similares esto implica que tiene una regulación parecida a nivel de transcripción. Esto implica que como aplicación clínica pueden tenerse como “target” los factores de transcripción.
§ El ordenador genera los Heat Maps, nos clasifica los genes en función de patrones de expresión parecidos: - Columnas (vertical) = cada columna representa un microarray - Filas (horizontal) = cada línea representa un gen zoom Los colores ahora tienen distinto significado, ahora respecto al estado basal: - Negro à significa que no hay inducción - Verde à significa que hay represión - Rojo à significa que hay inducción - Gris à significa que no se tiene información (por ejemplo, que la secuencia de DNA no se haya enganchado correctamente al porta).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 *Diferencias entre las técnicas NB y microarray: - NB: podemos estudiar muchas condiciones distintas, pero para tantos genes como permita el gel - Microarray: podemos estudiar únicamente dos condiciones, pero lo vemos en todos los genes del organismo.
La información obtenida en cada caso es distinta.
PCR vs Q-PCR Para sintetizar oligonucleótidos en el laboratorio podemos usar técnicas distintas: PCR o síntesis de oligonucleótidos en dirección 3’ a 5’. A continuación se estudia la PCR § Técnica de amplificación del DNA.
§ Serán necesarios: cebadores § Importante: requiere un DNAp (DNA polimerasa) que sea termoestable, es decir, que nos permita hacer varios ciclos de: síntesis + separación cadenas + unión cebador + síntesis de nuevo § Por lo general , las técnica de PCR no son cuantitativas. Aun que todas las PCR partan de lo mismo, unas obtendrán cantidades mucho mayores que otras.
§ ¿Qué se hace para que la PCR sea cuantitativa? à Q-PCR (o RT-PCR = Real time PCR) = se acopla la máquina de PCR a un lector de fluorescencia. La PCR clásica permite ver el punto final, mientras que la Q-PCR permite estudiar amplificación a tiempo real. Se hace la reacción en presencia de agentes intercalantes. De este modo, a medida que se va amplificando el DNA ira dando lecturas cada vez mayores hasta alcanzar la saturación.
! En función de la curva obtenida, lo que se hará es determinar de cuantas moléculas se parte. Lo importante es tener un buen control patrón.
En función de esta curva se puede ver cuanto DNA se tenía de partida.
- X partimos de 1 molécula DNA - X partimos de 100 moléculas DNA - X partimos de 10.000 moléculas DNA Solo cambia la detección de síntesis, el resto es lo mismo (pendiente y saturación final).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 2/11/2015 PREGUNTAS TIPO EXAMEN £ Los enzimas de restricción reconocen secuencias aleatorias de DNA. Por ello se utilizan para obtener mapas de restricción de los plásmidos.
£ Los geles de agarosa en campo pulsante permiten remover fragmentos de DNA hasta del tamaño de un cromosoma de levadura (5-6Megabases).
£ En los geles de DNA, el porcentaje de agarosa define el rango de resolución de los fragmentos de DNA. A mayor porcentaje, los fragmentos de DNA que puedes resolver son más pequeños.
£ Los agentes intercalantes (como el bromuro de etidio) emiten fluorescencia al intercalarse entre las dos hebras de DNA.
£ Si marcamos el extremos 5’ de un fragmento de DNA con T4 polinucleótido quinasa, debemos usar ATP cuyo fosfatos radioactivo sea el alfa.
£ Normalmente se consiguen sondas con mayor radioactividad específica si las marcamos en el extremo 5’ mediante T4 polinucleótido quinasa que si las marcamos mediante Klenow polimerasa (random priming).
£ La principal diferencia entre un Southern Blot y un Northen Blot es que en el primero la sonda se hibrida con DNA y en el segundo con RNA.
£ En los microarrays normalmente se marca fluorescentemente el cDNA obtenido a partir de RNA aislado de dos muestras o tejidos distintos.
£ Para analizar los microarrays, los “heat-maps” permiten la visualización de las familias de genes con un patrón de expresión similar.
£ £ La PCR es una técnica cuantitativa.
En la Q-PCR (Real Time-PCR) podemos calcular la concentración de molde de partida en función de la pendiente de la curva de amplificación.
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