Tema 3: Expresión génica en bacterias II (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Microbiología Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 17
Fecha de subida 04/10/2017
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21/02/17 Tema 3. Expresión en bacterias II.
¿Cómo se enteran las bacterias de lo que pasa en el exterior? Sistema de 2 componentes: mecanismo general que tienen las bacterias. PROTE RECEPTORA Y PROTE REGULADORA.
Izquierda: Tenemos la membrana externa y una prote de membrana (prote receptora) y hay un factor externo: amoniaco, sulfato, cambio de Ph… Como consecuencia de este factor la prote interacciona con el PH o con lo que sea y la prote receptora sufre un cambio conformacional. A la izquierda tenemos una prote reguladora inactiva. Ahora bien (derecha), cuando la prote sensora (receptora) se entera de que hay amonio cambia la conformación, coge la prote reguladora y la activa por una fosforilación. Una vez activada tiene que buscar una caja específica para el regulador, interacciona con esta caja (secuencia específica) y provoca un cambio de conformación especifica en el DNA para que haya transcripción del gen expresado en el factor externo. La prote reguladora estimula la transcripción.
Siguiente diapo.
Prote sensora se entera de lo que pasa fuera, a la derecha, prote que responde en función de lo que pase fuera. A la izquierda tenemos un dominio imput que reconocerá la presencia de un factor externo, por ejemplo, la presencia de amonio. Una vez este dominio reconozca, hay un cambio de conformación y, como consecuencia, hay una fosforilación de la histidina.
Entocnes este sensor se acaba de activar. El siguiente paso será activar el regulador, ¿como lo activamos? Porque esta fosforilación de histidina, la pasa a un dominio amino terminal donde hay un aspartato (D). Es el dominio amino terminal del regulador que a la vez sufre un cambio de conformación y este cambio permite que este regulador activo interaccione con la secuencia de DNA especifica que responde a este estimulo.
Me entero de que hay amonio, cambio de conformación, fosforilo histidina, la histidina sabe que fuera hay amonio, la histidina se lo chiva al aspartato que es la molécula receptora (reguladora) y ella interacciona con el DNA (el dominio carboxi es el que interacciona con el DNA que se encuentran los genes que han de responder a este estimulo externo).
27/02/17 Hay una molécula sensora que estaba a nivel de la envoltura y un regulador. Tiene un amino terminal que detecta mediante una fosforilación, se activa el C terminal que a la vez fosforilaba al amino terminal de regulador que tb afectaba al C terminal del regulador.
Obviamente esto es un ciclo, yo detecto señal input, el sensor se activa pq detecta la señal, a partir de aquí activa el regulador (que es la molécula del medio de la diapo), como el sensor ha pasado el radical fosfato se recicla (por abajo) y la molé cula sensora puede volver a empezar. El regulador interacciona con el DNA y una vez interacciona se recicla y puede volver a ser activada. Habrá una respuesta genética correspondiente a la señal que haya. Es la respuesta de 2 componentes: porque hay un sensor y un regulador.
No siempre es así este dibujo.
1.
2.
Estructura canónica que hemos explicado.
Variantes como consecuencia de evolución o recombinaciones: en el del medio tenemos un dominio sensor, el señor con la histidina correspondiente que es fosforilada y enganchada al mismo polipéptido. Tenemos el dominio de activación del regulador (D) y después el c terminal que interaccionaría con la región correspondiente. Por tanto aunque sea un único péptido da igual, sigue siendo un sistema de dos componentes porque tiene un regulador y un sensor.
Vamos a ver ahora ejemplos de pequeñas moléculas que lo que hacen es regular la expresión Tetrafosfato de guanosina es el regulador del anabolismo en bacterias , TTP al cual se le han añadido 3 fosfato más.
génica.
Mutante auxotrófico para un aa, ¿qué quería decir? Quería decir que es incapaz de fabricar un aa, por ejemplo triptófano. Está creciendo en un medio mineral + glucosa como fuente de carbono y para que crezca le ponemos triptófano porque sino no puede fabricarlo, cogemos este cultivo, los centrifugamos y lo resuspendremos en un medio mínimo con glucosa pero sin triptófano. Eliminamos el aa que el mutante no puede fabricar. Las células no pueden fabricar triptófano por tanto bloquearemos la síntesis de proteínas al cabo de unos minutos, consecuencias: 1. La fase I (fase de inicio de rep) hemos dicho que dependía de la fase I (fabricamos prote dnaA para poder abrir el cromosoma) entonces inhibiremos el inicio de la replicación del DNA porque no podemos fabricar ningún tipo de prote, incluída la DnaA.
2. La célula acumula tetrafosfato de guanosina debido a que no puede fabricar protes porque le falta un aa y: 2.1. Inhibimos la síntesis de RNA ribosomal 2.2. Inhibimos la síntesis de tRNA 2.3. Inhibimos la síntesis de protes que participan en el proceso de elongación del rna mensajero, si no tenemos protes, ¿para qué queremos transcribir? 2.4. Paralelamente estimulamos diversos operones catabólicos, fundamentalmente proteasas, porque si tenemos una prote y la degradamos, ¿qué obtenemos? Aminoácidos, y nos falta un aminoácido, alguna cosa rascaremos xd.
2.5. Inhibimos la síntesis de lípidos porque si inhibimos la síntesis de protes inhibimos la fase I del ciclo celular, pero la célula puede continuar creciendo y fabricar membrana, ¿tiene sentido fabricar membrana cuando no podemos fabricar protes? No, inhibimos los lípidos para inhibir la síntesis de membranas, las células no forman filamentos, se quedan quietas.
2.6. Si no tenemos síntesis de DNA tampoco tiene sentido que fabriquemos nucleótidos.
Es una situación de estrés nutricional en la cual la célula bloquea todo. Este tipo de respuestas se denominan respuestas pleiotrópicas, es decir, que tienen muchas formas porque una carencia de un aminoácido determina un seguido de fenotipos o manifestaciones muy diferentes, aparentemente no parecen estar conectadas entre sí si no supiéramos que es todo por el triptófano.
Gráfica.
Este sistema de control de metabolismo anabólico en bacterias no solo responde a la carencia de un aa, tb al cambio de medio.
Grafica de crecimiento, está creciendo a unas determinadas condiciones y le hacemos un shift up= están en un medio pobre y lo pasamos a un medio rico y vemos qué le pasa a la síntesis de RNA, protes y DNA: 1. Inmediatamente se dispara la síntesis de RNA (será ribosomal). La célula tenia pocos ribosomas y al pasar a un medio rico aumenta para poder fabricar más prote.
2. Tb aumenta la síntesis de protes 3. DNA tb pero no mucho Hacemos un shift down (al revés).
1. La síntesis de RNA ribosomal se ralentiza. Se atura, lo que hacemos es dejar de fabricar y nos quedamos con el que tengamos.
2. Protes igual 3. DNA un poco tb Tb va asociado al cambio de un medio pobre a rico y viceversa.
¿Qué quiere decir medio pobre y medio rico? Tabla resumen.
Un medio rico sería el LB: lleva: extracto de levadura, triptona, nacl pero no glucosa. Uno mínimo puede ser con glucosa, glicerol y succinato.
• • (P) = POBRE: absencia de una fuente de aa solo tiene una fuente de carbono.
( R ) = RICO: fuente de aa y/o de vitaminas.
Vamos a ver por qué se fabrica tetrafosfato de guanosina, cómo se regula.
1. hacia arriba, medio rico, tenemos un ribosoma con tRNA cargado , tenemos el trna con el péptido y se coloca otro trna cargado con un aa (circulo verde). Entonces, tenemos todos los factores de elongación del ribosoma, protes EF-Tu y gastando GDP transfieren el aa a la cadena que está creciendo y continúan la elongación del péptido.
Elongación normal de la cadena polipeptídica cuando tenemos un RNA cargado.
Fuentes de energía: GTP y GDP. Sobre todo GTP.
2. Hacia abajo: medio pobre, tenemos elevada cantidad de tRNA libres, en la bola roja no hay aa, el trna entra en el ribosoma, como no tiene aa se va, va entrando trna y saliendo, lo que sucede es que todos los enzimas de circulo rosa, están energetizados (y están interaccionando con el GTP para que pueda haber la elongación). Pero como esto no puede progresar porque no paran de entrar trnas libres, después de un tiempo, el enzima RelA se aburre de que la estemos energetizando y no podamos seguir hacia delante. Esta prote coge el GTP que participa en el proceso de elongación, interacciona con el ATP y formamos ppgpp. Fruto de la aturación de la síntesis de protes y de que la célula debe desenergetizar. RelA detecta que va aumentando el grado de energetización y que esto no va hacia delante y entonces fabrica eso. Hay mucha energía que no sirve para nada porque no se formarán proteínas.
Lo que fabricamos después debemos de poderlo desfabricar.
Ciclo del ppGpp.
¿Cuál es el proceso reversible? Importante!!! El pppGppp es el primer producto q se fabrica pasa a (ppgpp) tetrafosfato de guanosina que es el efector, interacciona con la RNA polimerasa (tiene un cambio en la expresión génica, inhibiéndola maybe ahora veremos), pero además este proceso es reversible. Hay un enzima SpoT que coge el ppGpp coge el fosfato de la cola y regenera el GDP. La sisntesis de tetrafosfato de guanosina es reversible. Siempre que haya un medio pobre o carencias de aa vamos fabricando tetrasfosfato de guanosina y lo vamos reciclando. En caso de nuestro mutante, imaginemos que le añadimos triptófano, por tanto no continuará fabricando tetrafosfato de guanosina (porque venía de la presencia de tRNAs libres, entonces como esto no pasa la célula no deberá desenergetizar. Dejaríamos de fabricar ppGpp y lo eliminamos a partir de Spot.
• • Carencia de aminoácido -> relA Si al cabo de un tiempo continua fabricando, recuperamos el a -> hidrolizamos con SpoT y tetrafosfato de guanosina vuelve a bajar.
Pregunta, ¿por qué este gen se llama Rel? El tetrafosfato de guanosina dispara todas las respuestas cuando hay medio pobre o carencia de aa, está codificado en el gen RelA…. Rel = relajar, cuando inactivamos la síntesis de ppGpp la celula ya no hace toda esa respuesta tan crítica, está totalmente relajada porque le falta el control de todo el anabolismo celular (todas estas vías de inhibición).
El ppGpp, que es el producto de RelA, es quien controla todo este anabolismo celular. El mutante RelA, cuando hacemos un shift down el RNA continua creciendo, hemos perdido totalmente el control de la maquinaria de la síntesis de proteínas . Lo contrario de perder el control es algo relajado, de ahí RelA, han perdido el control de toda la maquinaria biosintética.
Vías de cómo actúa el ppgpp 1. Directas: Dibujo.
1.1. Acción sobre el acceso de NTPs. Representa la estructura global del holoenzima RNApolimerasa. Hay una subunidad catalítica, que es la beta. Entran los NTP (Ribonucleotido trifosfato) y se van copiando delante del molde correspondiente. Lo rojo es el tetrafosfato de guanosina. Un ppGpp tiene más volumen que un NTP, cuando aumenta la concentración de ppGpp, la RNA polimerasa se atraganta, como es más grande tiene un tiempo de residencia más alto en el canalón de acceso al lugar catalítico, el de los NTPs es más pequeño. Si estamos interfiriendo porque pasa mucho tiempo el ppGpp, estamos impidiendo que otros NTPs puedan pasar, por tanto comporta una disminución en la tasa de transcricpión global de la célula.
1.2. Modulación del reconocimiento de la región promotora. Interviene otra prote, la DksA , esta prote puede interaccionar con el ppGpp, cuando el ppGpp interacciona, produce un cambio en la conformación de la prote y la dksa con este cambio es capaz de interaccionar con el factor sigma que reconoce al promotor (no se une!! Lo reconoce!!) esta prote dksa, modulada por la interacción de ppGpp, interacciona con el DNA (¿o RNA?) y el factor sigma e impide la unión de la RNA polimerasa al promotor, por tanto estamos inhibiendo la transcripción. ¿Esto pasa en todos los genes? No. Sigma reconoce a promotor solo -35 y + 10 acordar! Esto solo pasa en algunos genes que tiene una secuencia consenso llamada “secuencia consenso de estringencia”.
Se nos ha olvidado comentar que toda esta respuesta de carencia de un aa es la llamada “astringente”, entonces, todos los promotores bacterianos que están sometidos al control de la prote dksa, lo están porque esta secuencia especifica es la que se engancha la dks modulada por el tetra guanosina por tanto hay muchos operones que serán modulados, sino tienen esta secuencia no serán modulados por dks.
2. Indirectas; 2.1. Incremento de la disponibilidad de RNA polimerasa y variació de la concentración de determinados DNTPs. Kis orinitires fuertes (mucha afinidad por rna polimerasa son los Prrn, de donde viene esto? De RNA ribosomal. ¿Quién era la molécula que en el peso seco de la célula estaba más representada? RNA ribosomal, esto se consigue porque los promotores del RNAr son muy fuertes. Esto quiere decir que en condiciones normales la RNA polimerasa tiene una afinidad muy grande por los promotores del RNA ribosomal, por tanto los otros son promotores discriminados.
En los promotores en los cuales hay una región como la de antes, la rnA Polimerasa pierde afinidad debido a los ppGpps, los promotores del RNA ribosomal tienen esta secuencia especifica, por tanto cuando fabricamos ppGpp ¿qué le pasa a la RNa polimerasa? Deja de engancharse en los promotores del RNA ribosomal, por tanto, tendremos más moléculas de RNA polimerasa libre. Si además fabricamos más rna ribosomal tb tenemos un aumento de NTPs libres, la pérdida de afinidad de la rna polimerasa por estos promotores fuertes facilita que estos promotores que estaban discriminados ya no lo estén. (Aumenta la síntesis de aminoácidos) hace que estos promotores tengan opción a ser leídos por la RNA polimerasa, en consecuencia tenemos cambios de expresión génica (más NTPs y más polimerasa libre).
Dksa reconoce una secuencia y colabora a que la rna polimerasa no se enganche, esta secuencia la tienen los promotores fuertes.
Iosina mofosfato (IMP) a partir de esto se forma amp o gmp (es el precursor).
Cuando hay mucho tetrafosfato de guanosina que proviene del GTP, el ppGpp es capaz de inhibir la síntesis de IMP deshidrogenasa (tiene un lugar alostérico). En concreto la IMP deshidrogenasa tiene 2 posibilidades, fabricar: 1. AMP 2. GMP Cuando hay elevada concentración de tetrafosfato de guanosina inhibimos la síntesis de GTP por tanto fabricaremos ATP. Como recordamos, esto comporta a que hay bastantes unidades transcripcionales bacterianas que la mayoría comienzan o en guanina o en adenina. Todas la subunidades transcripcionales que tengan como posición +1 (primer nucleótido que se transcribe) una guanina inmediatamente verán disminuída su transcripción porque cuando la rna polimerasa entre al promotor no tendrá mucho GTP y por tanto no podrá empezar la transcripción a la misma velocidad que en condiciones normales, por tanto las que empiezan por G verán inhibida su tasa de transcripción debido a este fenómeno del ppGppp. Es fundamental RelA pq es la que farica ppGpp cuando hay muchos trna libres.
Este proceso de control del anabolismo ES UNIVERSAL EN BACTERIAS, el tetrafosfato de guanosina es el regulador del anabolismo tanto en gram como gram + como arqueas como proteobacterias alpha, beta, gamma..
UNIVERSAL.
Represión por catabolito.
Lo que hace es controlar el catabolismo en las bacterias. Los bacterias tienen una fuente de carbono preferente, a nosotros no a todos nos gusta la misma comida xd.
Ejemplo en E. Coli. Se ha detectado un crecimiento diáuxico, el de la gráfica, diáuxico porque tiene dos formas, tenemos un cultivo creciendo de E. Coli en el tiempo, tenemos una célula que crece en presencia de glucosa y lactosa, dos fuentes de carbono.. Comienza a crecer, llega un punto en el cual comienza a aturarse , esto quiere decir que se ha utilizado una fuente de carbono (glucosa)y necesita un poco de tiempo para readaptar su catabolismo y empezar con el otro (lactosa). Primero empezando comiendo glucosa, cuando acabamos la glucosa necesitamos adaptar nuestro catabolismo y a partir de aquí empezamos a usar lactosa. Por tanto quiere decir que E Coli prefiere la glucosa a la lactosa.
Siguiente gráfica.
Gen LacZ que forma parte del operón Lac que tiene como función degradar lactosa. Lac Z en concreto codifica al enzima Beta galactosidasa que es justamente la que hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa. Veremos la síntesis de galactosidasa en presencia de glucosa o lactosa.
Síntesis de galactosidasa en un cultivo en el que no le hemos añadido nada. Verde.
Abajo lo mismo, pero cuando le añadimos glucosa, la adición de glucosa en el punto de abajo provoca una inhibición en la síntesis de beta galactosidasa por lo tanto el efecto que tiene la glucosa no tiene nada que ver con transporte o nada, actúa a nivel genético porque inhibe la síntesis de beta galactosdidasa y por tanto la síntesis del gen lacZ. El rojo es prácticamente idéntico al cultivo que no tiene glucosa. Por tanto si no hay glucosa hay síntesis de beta glactosidasa elevada, y además, si añadismos glucosa y cAMp, igual, hay síntesis de beta galactosidasa. Añadimos glucosa, inhibe.
Entonces, esto quiere decir que el efecto preferencial de la glucosa por la lactosa se ve abolido cuando en el medio hay glucosa con AMPc.
03/03/17 El gen cya es el gen que codifica la adenilat de ATP.
ciclasa, la cual fabrica AMPcíclico a partir Tenemos un azúcar que ha de penetrar dentro de la célula (el azúcar ha de estar fosforilada para que esté activa!) a la izda tenemos las diferentes enzimas que participan: el fosfoenolpiruvato le da la fosforilación al enzima I, ésta se la da a HPr, etc. Estros 3 componentes son los generales del sistema: en cualquier transporte de azucares están! Son comunes a todos! Hay una zona específica que depende del azúcar. La proteína 2A y 2B^2C. Vamos transmitiendo el radical fosfato, la prote HPr le transmite a los diversos 2A que puedan existir (tendremos un 2A para introducir glucosa, otro para introducir manitol etc tb). También hay otra relación especifica entre el 2B y 2C de cada azúcar, el azúcar interacciona con la enzima y a nivel de membrana interna es fosforilado por el fosfato que viene de 2A. Este es el proceso, una parte general y otra específica. Hablando del transporte de la glucosa, vamos a cone ctar esto con el tema de la adenylato ciclasa. La adenilat ciclasa puede estar en 2 conformaciones: 1. Activa 2. Inactiva Si está inactiva no fabricaremos AMPcíclico. Se activa porque la fosforilamos, ¿qué activa a la adenilat ciclasa? Interacciona con el enzima 2Aglucosa fosforilado, si este enzima puede interaccionar con la adenilat ciclasa, ¿puede interaccionar con otra molécula? Tiene una disyuntiva, puede interaccionar con: 1. la adenilat ciclasa o 2. puede interaccionar con la glucosa, pero tiene más afinidad por la glucosa.
Si en el medio de cultivo hay glucosa, la 2Aglucosa fosforilada fosforilará a la glucosa y la adenilat ciclasa no estará activa y no fabricaremos AMPC.
• • Presencia de glucosa: la célula no activa la adenilat ciclasa y no fabricamos AMPc.
Ausencia de glucosa: activamos la adenilat ciclasa, coge ATP y fabrica AMPcíclico.
Segunda etapa del proceso: Cuando ya tenemos AMPcíclico, veremos cómo el AMPciclico interviene en la expresión génica. Aparece la proteína CRP (c de Camp, R de receptor y P de protein), a veces CRP también se llama CAP (C de Camp, A de acceptor y P de protein, pero es lo mimso prote).
CRP o CAP interacciona con el AMPciclico, forman un complejo y reconocen una secuencia especifica que ya veremos, la consecuencia es que colaboramos a que el promotor que sea coja la conformación adecuada y estimulamos la transcripción adecuada con este gen. La presencia de glucosa está conectada con la expresión génica. Son procesos inversos (cuando hay glucosa y cuando no).
Complejo CRP-Camp.
Operón Lac, donde la CRP size (lugar de unión a la prote CRP unida al cAMP). Este complejo reconoce esta secuencia, colabora para curvar el DNA y el promotor adquiere la conformación adecuada para ser transcrito. La región de reconocimiento de este activador está antes de la región +1, que es donde se encuentran la mayoría de secuencias que son reconocidas por activadores. Todos los genes que estén controlados por la proteína Cap deben tener esta secuencia especifica llamada “cap binding site”, no solo interaccionan las Cap con el Rna sino tb con la RNApolimerasa.
Represión por catabolito.
Cuando no hay glucosa los operones catabólicos se activarán porque E. Coli prefiere glucosa, por tanto, cuando hay glucosa no comerán otra cosa. Cuando no haya glucosa se activarán los operones catabólicos.
• Funciones que regulan: todo lo que es la degradación de azúcares tendrán represión por catabolito que significa que necesitan AMPciclico.
El operón lac tiene un control negativo por inducción, la mayoría de operones catabólicos tienen este tipo de control: mal, lac, gal, ara, etc, tienen: 1. Control negativo por inducción propio del azúcar y además 2. El control por ampciclico (catabolito) debido a la glucosa (represión por catabolito).
Los genes cyt (de citocroms) y ubiG (de ubiquinona). Tanto las ubiquinonas como los citocromos son protes que intervienen en la respiración, esto quiere decir que todos los procesos respiratorios ya sean aerobios o anareobios están controlados por AMPciclico, consecuencia: si le ponemos glucosa a un cultivo de E. Coli, ¿qué hará primero, respirará o fermentará? Fermentará. Porque el AMP controla esto, si ponemos glucosa, no tendremos ampciclico, y sino lo tenemos no podremos estimular la síntesis de citoocroms y ubiquinonas, por tanto, no podremos respirar. Entonces estas bacterias si tienen glucosa, lo primero que harán será fermentar. FERMENTACIÓN EN BACTERIAS NO QUIERE DECIR AUSENCIA DE OXÍGENO, SIGNIFICA QUE USAMOS COMO ACEPTOR FINAL OTRO COMPONENTE. Mientras haya glucosa, fermentaremos. Productos de la fermentación de la glucosa: etanol, ác. Láctico. La fermentación es una fosforilación a nivel de sustrato, cuando se acaba la glucosa, ¿qué le pasará al AMPcíclico? Se sintetizará, podrán expresarse los genes controlados por el AMPcíclico (todos los de la tabla a la izquierda) y podemos respirar porque al no haber glucosa podremos sintetizar los citocroms y ubiquinonas que participan en la respiración, tanto aerobia como anaerobia!!! Muchas toxinas entéricas están reguladas por ampciclico.
Degradación de histidina. Los aa podemos utilizarlos para comer o sintetizar, si los utilizamos para comer el operon de degradación de aa será catabólico y estará bajo el control de AMPciclico. Por ejemplo tox, mientras haya glucosa este operon tox no se expresará, deo es de degradación de nucleótidos y pasa lo mismo (para que la célula se coma la ribosa por las vías de las pentosas) cya y crp también.
PERO no todas las bacterias son iguales.
Bacillus subtilis, filogenéticamente lejos de E. Coli, ¿tendrá represión por catabolito? Sí, cambia la táctica pero sí. A la derecha aparece otra vez HPr, implicada en los procesos de fosforilación, no aparece por ningún lado la glucosa, la fuente de carbono preferida en este caso es la fructosa 1, 6 bifosfato . En E. Coli teníamos la prote cya, ahora tenemos una que es la CcPA (tb prote reguladora), ¿qué hace que esta prote module la función de operones catabólicos? La furctosa 1,6 bisP. Interacciona con HpR y con CcpA, y esto es capaz de interaccionar con el DNA reconociendo una secuencia específica y provocará la expresión en operones catabólicos. El complejo camp-crp activaba la transcripción en e coli, pero ahora el regulador ccpa no activa la transcripción, inhibe la transcripción. Cuando haya fructosa 1,6 bifsf inhibiremos.
¿Por qué en E. Coli prefieren la glucosa y B subtilis la fructosa? La fuente de carbono está relacionada con el entorno, E. Coli se encuentra en el tracto digestivo de mamíferos, donde hay azúcar. B. Subtilis se encuentra en la tierra, y no suele haber muchas moléculas de glucosa en la tierra.
DEPENDE DEL ENTORNO LAS PREFERENCIAS.
Pseudomonas putida: gram -, son respiradores, no fermentan, pero pueden hacer respiraciones anaeróbica, LA FERMENTACION NO ES RESPIRACION ANAERBOICA EN BACTERIAS. Entonces no pueden hacer igual que e.coli, primero fermentar y luego respirar.
¿Fuente preferida de pseudomonas? Succinatos y acetatos. Es respirador de succinato y acetatos, tendrán represión por catabolito, pero el azúcar reguladora no va a ser la glucosa, también viven a la tierra y además no fermentan, estos serán la fuente de carbono que habrá que pseudomonas se come un azúcar según haya succinato y acetato, primero succinato y acetato y luego lo que haya, mismo papel que la glucosa en e coli o fructosa. ¿Cómo funciona? Tenemos de nuevo otra proteína. El modulador CRC se encarga del control de la traducción de genes de transporte de otros azúcares si existen en el medio succinato o acetato.
CRC (C de catabolism, R de regulator y C de compond). Interviene en el proceso de regulación.
Crc será activada según haya succinato o acetato. Una de las aplicaciones de pseudomonas es su capacidad de degradar de productos recalcitrantes, se los puede comer, pero siempre y cuando en el medio no haya succinato, otro ejemplo de represión por catabolito pero con otra fuente de carbono y otro sistema de control.
También depende de las características metabólicas del grupo filogenético.
Quorum sensing: lactonas. (quorum significa que hay “suficiente peña” xd : Microorganismo que funciona a base de mucha cantidad de células e interviene en la regulación de diferentes funciones bacterianas, esto lo modulan las lactonas. Hay unas células que las fabrican y las hechan fuera. Estas lactonas interaccionan con protes que la misma célula puede fabricar. Normalmente más que con protes, interaccionan con un sistema de 2 componenetes (un receptor de algo + un regulador) a nivel de pared tienen un receptor e de lactona, se activa el receptor, que activa a un regulador y como consecuencia se expresa en un conjunto de genes. Sistema de dos componentes mediatizado por las lactonas. Cuantas más células sean, más lactona habrá y más fácil será que se lleve a cabo la expresión (respuesta) en toda la población .
Vibro fischeri. Los genes luz, que están en Vibrio, están codificados por un sistema de lactona, cuando más tenga, más probable es aumentar la transcripción del gen luz y habrá luz. Típico ejemplo de simbiosis.
Tumefasens es un patógeno vegetal, todo el sistema de infección de la planta viene modulado por las lactonas.
Además del ampciclico la lactonas tb participan en la expresión.
¿Cómo? De una forma similar: La prote reguladora interacciona con la lactona, reconoce una secuencia del gen que controla y se produce la expresión.
Tabla con diferentes microorganismos blablá, siguiente tabla: resumen de apéndices.
Represión por catabolito: esta en muchos PpGPP hacía control anabólico.
Importancia del aceptor final de electrones en la regulación de la expresión génica.
Cuando hay glucosa las células bacterianas primero fermentan, eliminan la glucosa y luego respiran (salvo algunos tipos que hemos hablado). Pueden ser: 1. Respiración aerobia.
2. Respiración anaerobia.
Control de la respiración aeróbica o anaeróbica en bacterias.
(RESPIRACIÓN, NO DE FERMENTACIÓN, A DIFERENCIA DE NUESTROS MÚSCULOS LA FERMENTACION EN BACTERIAS SE DA EN PRESENCIA DE O2).
Izquierda aerobia, derecha vía anaeróbica.
Lo que le interesa de la transferencia son los aceptores finales de e: 1. Fumarato: en respiración anaeróbica podemos darle electrones y obtener succinato.
2. Nitrato y obtener nitrito.
Etc.
Es diferente si usamos nitrato, sulfato, carbonato… hay muchas más variables en la respiración anaeróbica que aerobia. Lo controla un sistema llamada FNR (frente internacional de revolución xddddd). Este gen, a pesar de su nombre, no codifica la fumarat nitrato reductasa!!! Codifica a un regulador que entre otras cosas, este regulador, controla la síntesis de la fumarat reductasa y la síntesis de la nitrato reductasa.
Tiene dos posibles conformaciones: 1. Activa 2. Inactiva.
¿De qué depende de que esté activa o no? Tenemos la estructura con radicales cisteínas (típica bolsa redox) con un Fe3+ o un Fe2+, cualquiera puede entrar, el 3 está más oxidado xd.
Cuando hay hierro Fe3+ significa que hay O2, cuando hay fe 2 no hay O2. Cuando hay O2 se inserta el 3, provoca un cambio en la conformación de la proteína y la prote está en su forma oxidada que quiere decir forma inactiva. Si no hay O2, lo que tenemos es hierro 2, se coloca en la bolsa y la conformación de la prote FNR es activa.
No O2 -> activa.
O2 -> inactiva.
La activa reconoce una secuencia y favorece la transcripción de una serie de genes, ¿de quién? Estimulamos la transciripción de moléculas: 1. Fumarato reductasa: aceptor finald e e+ cuando no hay O2 2. Nitrato reductasa, lo mismo 3. Nitrito reductasa lo mismo Entonces si no hay O2 estimulamos todo un seguido de genes implicados en la respiración anaeróbica, pero también inhibimos cosas, ¿cuál es el nombre del último citocromo que le da electrones al oxígeno? Citocromo O, en este contexto tenemos condiciones anaeróbicas, protes FNR activas, inhibimos transcripción del citocromo O porque va destinado a pasar electrones al O2, PERO ncomo no hay no queremos citocromo.
Este sistema es universal en las bacterias que tienen transportadores de respiración anaeróbicos. Bacteria que no lo tenga: Bacilus Subtilis. Es un aerobio estricto, no puede hacer respiración anaeróbica, por tanto no le hace falta el sistema FNR.
Donde “sensor” tenemos una membrana, una proteína, un ATP… ¿qué es eso? Hay 2 elipses (dibujadas) es un sistema de dos componentes, se detecta en el medio la presencia de nitrato (circulo azul) cuando hay nitrato la prote se activa, a continuación activa a un regulador NarL , y este regulador activa la síntesis de nitrato reductasa, porque obviamente si hay nitrato tiene sentido que utilicemos la enzima como aceptor final de e-.
06/03/17 La parte de abajo habla de condiciones de ausencia de oxígeno, por tanto, activamos el sistema FNR, si no hay oxígeno, hemos de activar las enzimas que participan en la respiración anaeróbica, pero como ya hay o2 no tiene sentido que fabriquemos los enzimas de la respiración aerobia (parte de arriba). Por tanto, tenemos el sistema ArcB (de donde viene A? de aerobic control) hay un conjunto de genes que el producto de los cuales participan en las respiración aeróbica, estos genes se han de desconectar cuando ttenmeos condiciones de anaerobiosis).
Anaerobiosis: conecto y desconectamos los de aerobiosis.
Siguiente diapo: coexistecias de caja, volvemos, sabemos que FNR reconoce una secuencia especifica que se conecta cuando hay ausencia de O2, y que el aceptor final de e- cuando no hay O2 puede ser muy variado. Aquí está planteado en caso de que en el medio haya nitrato.
En estas condiciones debemos conectar todo el proceso anaerobio y además los genes que codifican protes que específicamente dentro del metabolismo anaeróbico participan en la respiración del nitrato, esto dice la siguiente transparencia Cajas Fnr responden a la ausencia de oxigeno porque detectan Fnr, interaccionan con la prote narl y responden a la presencia de nitrato. Genes implicados en el metabolismo anaeróbico, por tanto tenemos como mínimo dos reacciones: gnrl y narl. Si hablamos de sultfito o sulfato habría otras protes además de estas, protes para respirar sulfato, porque son específicas.
Siguiente.
Lo que hemos comentado, pero quiere centrarse en la parte verde de la derecha, modulones.
Es un sistema de conjuntos, conjunto de genes que intervienen a nivel del catabolismo y todo un conjunto de genes regulados por CRP (modulaba expresión por catabolito) y otro conj de genes regulados por FNR (respiración anaeróbico) y un conjunto de genes regulados por la presencia de nitrato (Narl). Esto se deduce que habrá genes de respiración de aneareobiosois que estarán controlados por represión de catabolito, y las del nistrato por FNR y hay genes de respiración aerobica que están regulados por CRP. Todo este conjunto de regulones catabólicos tienen, en algunos casos, genes comunes.
Operones bacterianos: 1. Catabólicos.
2. Anabólicos.
¿Qué control tienen toooooodos los operones catabólicos? Represión por catabolito, en caso de E. Coli, esta represión es el complejo CRP-Camp.
¿Qué control tienen toooooodos los operones anabólicos? El ppGpp, la respuesta astringente.
• Operón lactosa: ¿anabólico o catabólico? Catabólico. Tiene un control propio, negativo por inducción. Lo que le interesa: Esa es la estructura, tiene delante el gen lac I que codifica al represor. Los operadores son regiones, dentro de estas regiones pueden haber diversas secuencias operadores. Ejemplo maravilloso de esto. Tenemos 3 secuencias operadoras, el gen lac Z comienza a transcribir después de la primera flechita, el operador dos está en la región codificante. Pueden estar en las regiones codificantes!!! Puede haber bucles. Una región operadora puede tener más de una secuencia operadora e incluso pueden estar dentro de la región codificante.
Mutaciones en el operón lac.
Diferentes posibilidades: 1.
LacOC: mutación en la región operadora y convierte al operador en un operador constitutivo, ¿qué quiere decir? Una mutación en alguna de estas secuencias operadoras que impide la unión del represor, esto quiere decir que este operón lac mutante tendrá una transcripción continuada o constitutiva del operador.
2.
LacIq: mutación promoter up en el gen lac I, que codificaba el represor, ¿qué le pasará a la célula? Fabricará grandes cantidades de represor y costará mucho más desregular el sistema.
3.
LacIs: mutación insensible al inductor en el gen I que codifica al represor, ¿qué quiere decir? Fabrica un represor que es capaz de unirse al operador y, por lo tanto, puede reprimir el sistema pero si es insensible al inductor no puede interaccionar con el inductor que sea. Es un sistema que está reprimido de forma continuada, se engancha al operador pero al no reconocer al inductor no se desengancha.
Importantes.
• Operón triptófano.
Anabólico, regulado por tetrafosfato de guanosina, tiene además atenuación, y está controlado por el propio triptófano. La atenuación estaría al ppio del péptido líder.
Además del atenuador y el tetrafosfato, hay un represor, el triptófano interacciona en el represor y los dos se enganchan al operador, si hay triptófano en el medio no hace falta que se fabriquen más. Es un control negativo por represor. Todos los operones anabólicos de los que hablaremos serán de este estilo y todos los catabólicos serán como el de lactosa.
Mutaciones: 1.
TrpOc: el represor no se podrá enganchar y tendremos una síntesis constitutiva de los genes para el triptófano haya o no haya triptófano en el medio.
2.
TrpRq: fabricaremos toneladas industriales de represor, con poco triptófano que haya ya reprimiremos el sistema, promoter up.
3.
TrpRs: insensible al triptófano, nunca se formará el complejo y por tanto tendremos una situación continuada del operón.
Son útiles estas mutaciones para expresar genes.
¿Cuantos cistrones tiene el operón lactosa? 5. Puede haber efecto polar. Si miramos el operón histidina, tiene 9 cistrones, hay operones bacterianos que aún tienen más cistrones, desde el punto de vista evolutivo se han encontrado mecanismos para paliar el efecto polar.
Muchas unidades bacterianas que tienen muchos cistrones pueden tener dentro de la región codificante promotores secundarios. En e coli el ppal es el p1, es el principal porue es por el cual tiene más afinidad la RNA polimerasa pero para paliar el efecto polar de que la RNA polimerasa se canse y se desenganche hay un promotor secundario y terciario, por tanto, pueden detectar 3 RNA mensajeros, el que viene de P1 el de P2 y el P3. El más eficaz y eficiente es el P1 porque tiene más afinidad la rna polimerasa, los otros ayudan a que no se desengancha pero a partir de ellos tb podemos hacer dna mas pequeños. Podemos hacer unidades transcripcionales muy largas, de muchos cistrones!!! Para evitar la fatiga de tradución utilizábamos los ribosom binding sice, aquí lo hacemos con promotores internos en la transcripción.
Control del aparato de síntesis de proteínas.
Cuando hablamos de esto, ¿de qué estamos hablando? De rna ribosomal, protes ribosomales.
¿Por qué está regulado? PpGpp, en cualquier sistema anabólico.
Control protes ribosomales. En bacterianas se llaman S cuando forman parte de la subunidad peque o L si es de la grande.
Mapa de E. Coli: acostumbran a formar unidades transcripcionales muy grandes. 11 cistrones donde codifica por ejemplo (la de la izda).
Arriba en rojo. La unidad transcripcional de arriba cofifica 3 protes ribosomales: l10, l7 y l1 y después beta y beta prima que eran subunidades de la rna polimerasa. Abajo, 3 subunidades peques y la subunidad alfa de la rna polimerasa, por tanto desde el punto de vista evolutivo tenemos protes que solo transcriben unidades transcripcionales, pero hay unidades transcripcionales que tienen la suficiente info para codificar componentes de la rna polimerasa y que tb codifican en la síntesis de proteínas.
Las proteínas ribosomales, ¿por quien tienen mucha afinidad? 1. Por el rna ribosomal, porque como forman parte del ribosoma interaccionan con él.
2. pero, además, tienen infinidad por su propio mrna mensajero vamos a ver cómo se controla la traducción o producción de síntesis de protes.
Siguiente diapo. Unidad transcripcional que codifica la formación de protes ribosomales, formamos L11 teneos mucha cantidad de rRNa si fabricamos la prote L1 o L2 y hay mucho Rrna, se juntarán, porque tienen mucha afinidad. Por tanto ensamblarem el ribosoma.
Abajo, ¿qué sucede si fabricamos protes ribosomales y prácticamente hay poco Rrna? ¿con quien se irán las protes ribosomales? interaccionan con el extremo 5’ de su propio mRNa, ¿qué tenemos al extremo 5’ del mrna? Tenemos un ribosom binding site, lugar de unión a ribosoma, si la prote se engancha, el ribosoma no se podrá enganchar a RBS y por tanto no podermos traducir este Mrna Y NO FABRICAREMOS PROTE RIBOSOMALES. Entonces este mecanismo garantiza el control de la síntesis de prote ribosomales.
¿Qué sucede si aumenta la cantidad de rna ribosomal? La prote que están enganchada al Mrna se engancha al Rrna, el RBS queda libre y el ribosoma se podrá enganchar y fabricar más prote ribosomal que es lo que hace falta que hagamos porque tenemos mucho rna ribosomal. En bacterias gracias a esto controlamos la síntesis de prote ribosomal.
Fijarnos, ¿todas las protes ribosomales se enganchan al RBS? De entrada sí, pero sabemos que un rnaM puede tener más de un RBS de por medio. Pueden hacer un control discriminatorio permitiendo y bloqueando la transcripción de unos y otros, permiten que los componentes de la rna polimerasa lo hagan (beta y beta prima que vimos antes).
• • ¿Cómo se controla la síntesis de Rnra? Está controlado por ppGpp.
¿Cómo se llaman las unidades transcripcionales que codifican los RNAr? Unidad transcirpcional rrn (quiere decir que codifica rna ribosomal) Mapa de e coli: hay en rojo 7 , por tanto e coli, como muchos bacterias, tienen bastantes copias de rrn. ¿Por qué tantas copias que codifican rna ribosomal? Porque necesitamos muchos ribosomas y por si por mala suerte perdemos una unidad transcripcional, tendremos muchas. Desde el punto de vista de la célula, consigue tener muchos ribosomas y que la perdida de una no impide la viabilidad del cultivo.
Esquema genético de la organización de unidades transcripcionales que codifican Rrna.
Estructura de cada una de estas unidades transcripcionales. Demostrar que en bacterias hay procesamientos de transcritos primarios (buscar qué son). Caso paradigmático: Esta es la estructura tipo de una unidad transcripcional que codifica rna r de e coli o cualquier bacteria.
En genética, se llama marco abierto de lectura o marco de lectura abierta (ORF, del inglés open reading frame) a la secuencia de ARN comprendida entre un codón de inicio (AUG) de la traducción y un codón de terminación, descontando las secuencias que corresponden a los intrones, en caso de haberlas. Se encuentra acotado por los UTR (es decir, las secuencias no traducidas). El nombre se debe a que, una vez establecido uno de los tres posibles marcos de lectura por el codón de iniciación, la secuencia se encuentra "abierta" para la traducción porque carece de codón de terminación.
Tenemos el promotor (o el extremo 5’ si fuera DNA) no podemos llamarlo ORF porque es Rrna CODIFICAN AL CISTRON QUE CODIFICA AL RNA RIBOSOMAL 16S, hay un trna en algunas especies puede haber otro, formando parte de la misma molécula tenemos el 23 rrna, luego 53, puede haber el mensaje de un tran o de otro, y puede estar repetido por cistrones evolutivamente 5S y luego el terminador.
NO fabricamos rna mensajero, hay un RNA que, en un único soporte físico, una única molécula, tenemos todas las especies que forman parte del RNA y todas las …. Problema: desde el promotor correspondiente la célula fabrica este RNA, esto no va a ensamblarse en forma de ribosomas, se ha de procesar, hemos de fragmentar este rna, fragmentarlo para conseguir obtener cada una de las especies que forman el ribosoma. ¿Cómo hacemos esto? Tenemos el dna, fabricamos Rrna. Hablamos de endonucleasas de rna que reconocen unas secuencias específicas, es lo que sucede. Segunda línea. En este transcrit primario especie de rna, hay unas spacer (secuencias), las endonucleasas se enganchan y producen un corte generando extremos libres, entonc+es vienen las exos, los degradan y a medida que se degradan cada uno delos rnas que forman parte de los ribosomas adquiere su estructura secundario e interaccionan con las protes necesarias para formar ribosomas. El transcrit secundario dará lugar lal cromosoma maduro.
Hay unidades transcripcionales que tenían dos promotores, uno detrás de otro. ¿Para qué sirve tener 2 promotores uno delante de otro? Para aumentar la afinidad de la rna polimerasa, por tanto aumentar la taxa de transcripción. Una unidad transcripcional que tenga que fabricar mucho rna tendrá muchos promotores.
TRNAS estructura: en bacterias hay muchísisimas especies de trnas. Si tenemos promotor, un trna un promotor, un trna tendríamos un gasto enorme de soporte físico. Las células bacterianas tienen unidades transcripcionales donde se codifican 64523789 especies diferentes de trna, cuando se engancha la rna polimerasa fabrica otra vez un transcrit primario con 789 trna, aparece endonucleasa igual que antes y luego las exos que cortarán los extremos y tendremos individualizados los diversos RNA. Igual que antes, pero como hay muchas más especies de trnas, hay muchas más unidades transcripcionales codificando tRNAS en un único transcrit.
¿Por qué razón hay tantas copias? Ya explicado.
¿Qué triplete stop habrá preferiblemente al final de cada ORF? ¿Ámbar, sepia, ocre? ¿Estos trnas que estamos sintetizando se traducen? No. Entonces, ¿cuál será el codón stop preferido? No habrá. Examen: Si el rna no se traduce no tienen codón de fin de traducción, pero si tienen fin de transcripción.
Small RNAS.
Son capaces de modular la expresión génica y tienen diferentes formas, pueden tener un efecto positivo o negativo. Vemos el ejemplo de E. Coli en la variación de porinas. Una porina es una prote de membrana que forman los poros. Según el entorno osmótico, la concentración, el tipo de porina varía (según haya baja o alta presión osmótica porque la membrana no tiene la misma turgencia). En las células bacterianas el tipo de porina viene influenciada por la presión osmótica, hablaremos de la porina: OmpF y ompC.
Están codificadas en un gen llamado OMP (no se llama así porque sea “otra membrana proteica exameeeeeeeen, se llama así por “outer membrane protein”, quiere decir que es una prote de membrana más externa, como la externa está directamente en contacto con el entorno, hay que modular según la presión. Cuando hay baja presión se fabrica mucho OmpF y no fabricamos omcC, y cuando hay alta al contrario. Hay situaciones intermedias. Vamos a ver cómo mediante un small rna regulamos esto.
Tenemos la membrana externa, la prote ompf y la prote ompc, vamos a ver cómo fabricamos una u otra según la p osmótica. En la membrana interna tenemos 2 protes Envz (que viene de enveolope), detecta la presión y cuando la detecta se fosforila, después pasa el radical fosfato a otra prote que es ompR, por tanto, esto es un sistema de dos componentes. El regulador una vez activado se engancha a una región concreta del dna, qué hace? Usando el ompR fosforilado se engancha aquí y fabrica prote ompc que va a parar a la membrana externa, y ahora tenemos que disminuir la cantidad de prote ompf, ¿cómo hacemos? Cuando se engancha ompR ahí, hay dos promotores contiguos, fabricamos por un lado ompC y por otro fabricamos un pequeño RNA, su secuencia es la reversa complementaria del extremo 5’ del Mrna ompF, dicho de otra forma, extremo 5’ del rna mensajero ompF tiene la secuencia reversa complementaria del micF (el rna small).
Otra diapo.
El ompF, el micF es el complementario, por tanto se engancha al ppio del ompF. Si este rna peque se engancha en el extremo 5’, ¿qué sucede? Fijarnos donde está el RBS del ompF, circulo azul dentro de lo rojo. ¿Qué le pasa a RBS? Lo hemos tapado, si lo hemos tapado, el ribosoma no se enganchará,, no fabricaremos prote ompF, por tanto con el cambio de presión osmótica fabricamos ompc que es lo que queríamos y dejamos de sintetizar prote omPF, que tb es lo que queríamos. Todo esto porque hay un small rna que interacciona con estas regiones y amaga el RBS.
08/03/17 Vimos el ejemplo concreto del control de las porinas en E. Coli. Acabamos enseñando que hay un RNA peque de e. coli llamado micF que es complementario del extremo 5’ de un rna mensajero de una porina, la ompF cuando fabricamos este DNA fabricábamos un rna de doble cadena e impedia la traducción del rna m de OMPF y por tanto dejábamos de fabricar prote ompF. También los rnas antisentido (los small rnas, que son la reversa complementaria del rna al que se une, por tanto tiene el sentido contrario al RNA que inhibe, impide la traducción) puede tener control positivo también.
Cómo un RNA antisentido puede estimular la síntesis de algo.
En E. Coli hay un RNA antisentido, es decir, un rna peque, que interacciona en una región interna del transcrit de esta unidad polisincrónica, lo que sucede es que esta unión tapa, amaga, la presencia de una secuencia de reconocimiento de las endoribonucleasas (reconocen una secuencia interna de rna y cortan). La endoribonucleasa no reconoce la secuencia, no corta el rna, y aumenta la vida media, tendrá un efecto positivo sobre la síntesis de la prote en cuestión.
Otro ejemplo: extremo 5’ de mRNA con estructura secundaria muy marcada, se forma este tipo de bucle, SD ¿qué era? Shine dalgarno (RBS) necesaria para que el cromosoma se enganche sino se engancha el ribosoma no traduciremos el mrna y no fabricaremos prote.
Como consecuencia del RBS (SD) queda amagado y no fabricamos tanta prote. Tenemos un RNA con la secuencia reversa complementaria del mRNA indicado en azul, interacciona con su región complementaria, entonces la región que contienen SD no interacciona con lo azul, los ribosomas pueden engancharse a shine dalgarmo y por tanto podremos fabricar la prote .
Antes vimos el negativo y ahora el positivo con los small rnas (rna antisentido).
Los RNA antisentido interaccionan con un RNA complementario, es una interacción reversible, cuando tenemos una región de RNA de doble cadena lo que estamos haciendo es favorecer la estabilizar esta región porque las ribonucleasas no podrán entrar. Es una forma rápida de respuesta a las condiciones ambientales, cualquier estímulo que aumente o disminuya la cantidad de RNA sentido que fabriquemos: se separará, podrá traducir y podremos traducir rápidamente sin necesidad de fabricar todo el RNA y toda la respuesta correspondiente.
Por tanto, antisentidos en bacterias es muy importante para la estabilidad y para la respuesta al ambiente. 2 ...

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