4. Famílies gèniques principals impicades en la regulació. Gens eina (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia del desenvolupament
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 15/03/2016
Descargas 37

Vista previa del texto

4. FAMÍLIES GÈNIQUES PRINCIPALS IMPLICADES EN LA REGULACIÓ. GENS EINA A la imatge de dalt observem un mutant ultrabitòrax (el segment toràcic 2 està repetit). El primer cop que va aparèixer va ser als descendents d’unes mosques a les que se’ls havia subministrat èter durant uns minuts. Van pensar que era un agent ambiental i no li van donar gaire importància, però després es va veure que es devia a la mutació de gens.
A la imatge inferior veiem dos caps de mosca, el segon dels quals en comptes de tenir antenes té potes. Això es deu al fet que, alguns gens, si són expressats a un altre segment que no és el que li pertoca, el transformen i li donen una altra identitat. A la imatge, per exemple, s’ha posat el gen de les potes i el segment, en comptes de desenvolupar unes antenes, ha desenvolupat unes potes.
A tots els invertebrats, la polaritat anterior-posterior ve especificada per l’expressió dels gens Hox. Els gens Hox són els homòlegs als gens homeotics de Drosophila. Com anàvem dient, aquests gens s’expressen a Drosophila mantenint la linearitat del DNA, a mesura que anem en direcció 5’, trobem els gens que s’expressen a les parts cada cop més posteriors, i els gens de la zona 3’ són els anteriors. Així doncs, hi ha dos clústers.
Els gens anteriors inhibeixen els posteriors a nivell transcripcional. També està conservada la seva disposició dins del cromosoma, a insectes al menys, i això és degut al fet que a les seqüències entre els gens tenim enhancers que regulen diversos gens dins del clúster. Tota la regulació està molt concentrada a nivell transcripcional cosa que fa molt fàcil explicar perquè estan tan conservats els clústers. És a dir, la col·linealitat del genoma és deguda al compartiment de enhancers entre gens.
La col·linealitat espacial es dóna a insectes i a vertebrats, però a la majoria de metazous no. És una casualitat que passi només a aquests dos grups i, de fet, no està clar que es doni a tots els vertebrats.
A vertebrats no passa a nivell de tot el cos sinó al sistema nerviós i a parts del mesoderm (mesoderm axial: columna vertebral i musculatura del tronc, sobretot).
A mamífers tenim 4 clústers, a peixos 5 o així, i a Drosophila 2.
La col·linealitat no funciona a organismes com els equinoderms que, al no tenir simetria bilateral, no tenen eix anterior-posterior.
1 Mètodes a Biologia del desenvolupament Els mètodes de biologia del desenvolupament no són tant diferents als de biologia cel·lular i molecular, tot i que són una mica més específics.
Hi ha mètodes per a modificar o alterar el desenvolupament i mètodes per a visualitzar el desenvolupament. Aquests dos mètodes es combinen per a testar les hipòtesis proposades.
Es tracta de mètodes especials per a veure què passa a nivell de teixits, de cèl·lules, i a nivell de molècules concretes (histologia, biologia cel·lular i genètica molecular).
Mètodes per a modificar o alterar el desenvolupament  Transgens (organismes transgènics) o Knock-out (KO): Agafar un ratolí i fer un knock-out d’un gen concret.
o Knock-out condicionals: Quan poses alguna cosa en el medi o al menjar s’expressen els gens. Això és bastant important en l’estudi del desenvolupament perquè hi ha molts gens que s’expressen en diferents moments del desenvolupament. Per exemple, el gen FGF participa en la formació dels braços, però si no s’expressa a l’estadi de 64 cèl·lules, la seva absència és letal, tot i que a aquest estadi encara no hi ha braços. Així, es veuria frustrat l’estudi de la participació del gen en el desenvolupament dels braços. Si és condicional, en canvi, podem fer que deixi d’expressar-se a l’estadi en què es formen els braços.
2 o o    Posar a un gen determinat sota promotors d’altres gens.
Si ens interessa saber quina part de la proteïna és la que li dona la funcionalitat, podem substituir cert dominis de la proteïna per els d’una altra. Ens permet inferir interaccions concretes entre productes gènics.
Transplantaments i ablacions via agulles làsers o És un mètode específic de la biologia del desenvolupament.
o En algunes espècies podem agafar parts de l’embrió, treure-les i posar-les a un altre embrió. Això es fa amb espècies que no són vivípares i que tenen ous grans, perquè són mes fàcils de manipular.
o S’ha fet amb granotes i pollastres, perquè són fàcils d’obtenir i els ous són grans.
o També hi ha maneres de carregar-se cèl·lules individuals. A Drosophila, com al principi del desenvolupament tot es dóna a nivell de la superfície de l’ou, es pot eliminar amb làser cèl·lules concretes, de manera que ajuda a entendre la força que fan certes cèl·lules ne moviments, com per exemple, el dorsal clausure.
o Bona part de la biologia del desenvolupament del sXX es basa en aquests experiments.
Manipulació de processos cel·lulars per fàrmacs o Cal triar concentració adient. El fàrmac el pots posar a diferents concertacions de manera que pots inhibir molt poc o bastant el gen d’interès. Així, permet una observació quantitativa.
o La colxicina inhibeix la polimerització de microtúbuls, de manera que subministrant-la s’aconsegueix interrompre processos de proliferació i de migració cel·lular.
o La ciclopamina inhibeix específicament un factor de creixement. Té com efecte el mateix que el de fer un knockout d’aquest gen.
o Els fàrmacs són molt més fàcils i precisos, però hi ha fàrmacs de totes les coses.
Injecció directa de productes gènics o És un mètode força específic de la biologia del desenvolupament.
o El més típic són els Beads (boletes).
o Els Beads es basen en l’ús de boletes de cotó flux com a via de subministrament del tractament en suspensió aquosa.
o Per exemple, s’agafa un ou de pollastre i es fa un tall, de manera que es pot veure l’embrió. Es col·loca el bead amb el factor de creixement al costa del cap perquè, per exemple, volem saber que passarà si el posem allà.
o Per tant, pots decidir què posar i on col·locar-ho.
o És un mètode molt potent.
o Un altre exemple: Volem estudiar quina funció tindria un determinat producte gènic a una regió on aquell gen no s’expressa.
o Com són cultius d’embrions, s’acaben morint.
o També pot ser d’òrgans. Per exemple, les dents les pots posar en cultius i es desenvolupen durant un cert temps. Fins i tot les pots posar al ronyó d’una rata viva i es desenvolupen igual.
o Un altre tipus d’injecció directa és la microinjecció de virus, on injectem els virus, que expressen una proteïna determinada d’interès, a una part concreta de l’embrió. S’usa en pollastres i generalment funciona bastant bé. No obstant, 3 o com es fa via virus, és una mica sorollós i es pot escampar pels voltants de la regió desitjada.
L’avantatge principal d’aquestes tècniques és el control casi absolut del espai o el temps, o ambdós (beads i virus). El desavantatge és que utilitzem rangs de territoris que no apareixen naturalment a l’embrió.
Mètodes per a visualitzar el desenvolupament  In situ hybridization (RNA) o És la tècnica més usada, més potent i més efectiva.
o S’agafa el DNA complementari, es marca amb fluorescència o radioactivitat i es subministra a l’embrió.
o Es pot fer de dues maneres:  Whole mount:  "A saco”, li poses a tot l’embrió.
 És útil en embrions plans o que tenen la major part de la moguda a la superfície.
 Sections:  Per a evitar que el problema que el RNA no penetri, es fan seccions i d’aquetes es fan hibridacions in situ.
 Normalment es fa primer un whole mount i, si s’observa un patró interessant, es fa un Sections.
 Immunoquímica: anticossos o Es realitza juntament amb una hibridació in situ de RNA.
o Com no tota la regulació és transcripcional, és molt rellevant veure que proteïna i RNA no estan necessàriament al mateix lloc.
o Aquesta diferència es deu al fet que les dues tècniques són sorolloses i tenim regulació transcripcional.
o És interessant perquè, al cap i a la fi, les proteïnes són les que fan coses, de manera que la seva presència o absència determinarà una cosa o una altra.
 Transgènics per a visualització o S’usen els gens reporter gfp, rfp i altres (lacZ).
o gfp codifica per a la Green Fluorescent Protein,i rfp per a la Red Fluorescent Protein.
4 o  Un mètode és fer que gfp estigui regulat pel promotor del gen que volem estudiar, de manera que el resultat serà com el d’una hibridació in situ.
o També es poden fer “protein fussions”, que consisteixen en empalmar la seqüència de la proteïna amb la seqüència de gfp. Moltes vegades aquest procediment interfereix amb el funcionament de la proteïna, però en altres casos es pot observar el comportament salvatge d’aquesta.
o A la imatge podem veure l’expressió de engrailed.
o Aquest mètode, per tant, ens permet observa l’expressió gènica. Aquests estudis es poden realitzar in vivo, ja que amb una mica de raigs UVA es pot seguir l’expressió del gen en un individu sense alterar-lo.
o També s’usa com a indicador de processos cel·lulars:  Si fem la fussion protein amb la histona H2A, podrem observar el comportament de la cromatina a diferents estadis cel·lulars.
 En interfase, veurem que es disposa tota al nucli.
 Durant la mitosi podrem observar els cromosomes.
 Si entra en apoptosi, es podrà apreciar que el nucli s’està trencant.
 Fucci, usat en cultius de dents, marca amb RFP les cèl·lules que estan en G1 i GFP les que estan en G2.
 Molts processos importants estan relacionats amb la forma de la cèl·lula, ja que en funció de les forces que rep, adquireix una morfologia o una altra. Així, es pot estudiar la seva forma fusionant gfp amb una altra proteïna de la membrana cel·lular. És molt útil en epitelis  El mateix es pot fer per al citoesquelet, i observar la seva distribució i permet veure on s’està contraient la cèl·lula.
 També es pot veure l’adhesió i la polaritat de la cèl·lula.
Comparació de la transducció de senyal amb el senyal o Es pot estudiar quina és la distribució espacial extracel·lular de l’inductor i, al mateix temps, quina cèl·lula està transduint el senyal del factor de creixement, si es fusiona gfp amb una proteïna implicada en la via de senyalització d’aquell factor de creixement.
Tincions i mapes de territoris presumptius: “fate maps” Tècnica de manipulació que en el fons ens serveix per a visualitzar coses. S’ha fet des del segle XIX.
A la imatge B veiem tres embrions de zebra fish, un wild type i dos mutants. Un dels mutants té cèl·lules amb gfp i l’altre amb rfp. Aleshores, s’agafen unes quantes cèl·lules gfp i rfp i col·loquen a l’embrió wild type les unes al costat de les altres. Aleshores, a mesura que prossegueix el desenvolupament, les cèl·lules canvien de lloc i es separen. Finalment, podem veure on acaben i de quina part del cos acaben formant part gràcies a la fluorescència.
Si es repeteix l’experiment però col·locant les cèl·lules a diferents regions de l’embrió, es poden construir correspondències de mapes, els fate maps o mapes de destí.
5 Els fate maps sempre són entre un estadi i l’estadi posterior.
El fate map que veiem a la imatge ens diu que les cèl·lules de la part superior esquerra acabaran formant part de l’epidermis, mentre que les de la part inferior de l’endoderm, les de la part superior dreta del sistema nerviós...
El nom en sí és enganyós perquè és com si aquetes cèl·lules ja estiguessin determinades a ser epidermis, per exemple.
Les cèl·lules no tenen ni idea del que seran. De fet, si les agafes i les poses a un altre lloc, acabaran formant un altre tipus de teixit, de manera que no venen ja programades ni dirigides cap a un tipus cel·lular concret. Allò important és el territori de destí, i no la cèl·lula individual en sí (al menys en aquests estadi del desenvolupament).
Micro-CT scanners (X-ray) Els micro-CT scanners són escàners de rajos X.
Els rajos X traspassen la mostra i l’escàner la va rotant, de manera que obtenim imatges en diferents angles i podem reconstruir la morfologia interna i externa en tres dimensions de la mostra.
A la imatge de l’esquerra veiem el cap d’un embrió tardà d’un peix (cervell, vesícula òptica, retina, branquis en formació, cartílag, musculatura del tronc, aletes...).
6 A la imatge del mig tenim un embrió de xenopus, i a la dreta un embrió de ratolí tardà.
Moltes vegades s’ha de tenyir l’embrió perquè la penetrància dels raigs X als teixits vius és molt elevada, de manera que cal tenyir amb metalls pesats que s’adhereixen als teixits vius per tal de poder visualitzar les estructures. Algunes de les molècules emprades per a la tinció són l’òxid d’osmi (una molècula molt pesada que s’uneix a la matèria viva gràcies als àtoms d’oxigen) i el iode (té càrrega negativa i s’uneix a la matriu, compostos amb càrrega positiva).
També es poden lligar metalls pesats a anticossos específics per al producte gènic del gen que volem estudiar, de manera que amb l’escàner podrem veure a quines regions s’expressa.
L’avantatge d’aquest mètode respecte a les hibridacions in situ és que amb aquestes últimes existia el problema de la penetrància, de forma que si volem saber què passa a regions internes de l’embrió, cal fer moltes seccions perquè les hibridacions in situ només ens permeten veure les cèl·lules de la perifèria. En canvi, amb els anticossos, els metalls pesats i l’escàner es pot veure tot de cop.
La majoria de gens es mouen així d’una forma més psicodèlica de manera que està bé tenir formes precises de visualitzar aquests canvis.
Mesurament de forces Es tracta del mètode de manipulació més novedós.
L’objectiu és manipular i mesurar al mateix temps forces físiques i propietats mecàniques de l’embrió. Les cèl·lules al moure’s provoquen forces i a vegades es mouen com a conseqüència de les forces d’altres cèl·lules, i aquestes forces són les que determinen en gran mesura la forma del cos.
Com es mouen les cèl·lules determinen quines senyals reben, i les forces en sí també poden afectar l’expressió gènica.
 Micro-aspiració: S’agafa un embrió ovípar i s’aspira per la superfície. Es pot controlar la força d’aspiració, és a dir, d’estirament, i es pot visualitzar com es deforma l’embrió en funció de la força aplicada. A partir d’això, es pot calcular les propietats mecàniques d’aquest teixit a través de gràfics.
 Compressió uni-axial: Es col·loca l’embrió entre dues plaques paral·leles i es va aixafant poc a poc.
 Tensió: S’enganxa l’embrió pels dos cost plaques i es van separant. Aleshores, es calcula quant separació hi ha en funció de la força d’estirament aplicada.
7 8 ...