Tema 10. ADN recombinant (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2014
Páginas 12
Fecha de subida 20/12/2014
Descargas 43
Subido por

Descripción

Apuntes realizados con las anotaciones del docente, el soporte visto en clase y bibliografía.

Vista previa del texto

EFG (Bioquímica) Tania Mesa González 1º CURS BIOLOGIA UAB TEMA 10: ADN RECOMBINANT.
 DNA recombinant: Aquell ADN que està format per seqüències que no s’han creat naturalment. Es creen molècules de DNA artificials (per síntesi química). S´ utilitzen éssers vius, com els bacteris, i els seus components moleculars per a poder fer aquestes noves molècules.
-   Es una biologia molecular molt moderna.
Clonatge: - Clonació Organisme: creació de còpies idèntiques d'un organisme - Clonació d'ADN: creació de còpies idèntiques d'un tros d'ADN (gen) Clonació d’ADN; Eines bàsiques: - Els passos bàsics: 1. Tallar la font d'ADN en els límits del gen 2. Seleccioneu un ADN portador adequat (vector) 3. Inseriu el gen en el vector 4. Inseriu el vector recombinant en la cèl·lula hoste 5. Identificar el clon amb l'ADN d'interès 6. Deixeu que l'amfitrió produir múltiples còpies d'ADN recombinant - Enzims de restricció: són les endonucleases. Tallen seqüències internes específiques. Tallen pels àcids nuclèics i pels enllaços fosfodiéster.
- Vectors de clonatge molecular: Poden incorporar altres molècules i després transportar-les cap a un altre organisme per a que la incorpori i la posi en funcionament en ell. D’aquests vectors hi ha de diferents tipus: cromosomes artificials, plàsmids, bacteriòfags  que porten a amplificar o expressar.
- Enzims  com la DNA polimerasa, transcripasa inversa, DNA ligasa...
- Esquema general: Volem aïllar un tros de DNA d’un organisme, separar-lo i estudiar-lo.
a) Tenim un vector de clonatge = plasmidi (molècula de DNA separada que es replica autònomament, prové dels bacteris i al laboratori es modifica químicament per a convertir-lo en vector) aquest vector seria el transportador.
b) Els enzims de restricció tallen el DNA en llocs concrets i talla la porció esperada. I també tallen el vector.
 Es crea un vector recombinant  vector + tros de DNA esperat.
c) S’introdueix el vector recombinant en una paret bacteriana (bacteri), es fa que la paret obri els seus porus mitjançant tampons (sals) i d’aquesta manera es pot introduir.
d) Quan el bacteri creixi replicarà aquest DNA ja que la cèl·lula va creixent.
- Enzims de restricció: Endonucleases  són universals Talla seqüències específiques de DNA pels enllaços fosfodiester.
Són comuns en les bactèries.
Tallen DNA de doble cadena, ho fa de dues maneres: a) Talls esglaonat  generen extrems complementaris b) Talls plans  generen extrems roms Són molt coneguts i es comercialitzen  ex: REBASE Ha de reconèixer seqüències de DNA concretes en els dos sentits (cas de palíndrom), és a dir, que llegeix en cap i cua.
Els talls de restricció no són exactament en el principi i final de la porció que es vol, sinó que agafen una part més al principi i al final. El vector té els extrems complementaris o roms d’aquesta zona de tall, s’uneix mitjançant la DNA ligasa.
2 Vectors de clonació: -  Plasmidis  Molècules de DNA circular que han estat separades del DNA genòmic bacterià. Es poden replicar autònomament. Tenen resistència a antibiòtics, ja que els seus gens li han donat aquesta capacitat. Són molècules grans capaces d’incorporar seqüències molt llargues, fins 15.000 pb.
Són plasmidis manipulats, fent que hi hagi diferents portes d’entrada  policonnector d’entrada amb moltes dianes de restricció que s’han col·locat en un plasmidi per a que sigui operatiu en el laboratori. Per tant, són versàtils.
 λ Bacteriòfags  Virus que infecten als bacteris. Prestació de DNA molt eficient. Permet la clonació de DNA de fins 23.000 pb  Els plasmidis que porten un polienlazador, un fragment d'ADN sintètic amb les seqüències de reconeixement per endonucleases de restricció.
 Vectors de clonació: 3 - Reconeixement de la seqüència esperada: Els plasmidi conté seqüències de DNA amb resistència a antibiòtics. Quan entra en un bacteri li dona la resistència als antibiòtics.
 El plasmidi és resistent a dos antibiòtics. Per exemple la tetraciclina i l’ampicilina.
 Tallem el DNA i el vector. All tallat el vector, també es talla una de les seqüències de la resistència (ampicilina). El tall es fa mitjançant endonucleases ha creat diversos talls de DNA i dels vectors. Llavors després es poden combinar o no de la manera esperada. S’ha de veure quina d’aquestes unions és l’esperada.
 S’introdueix tot en bacteris, que es cultiven en plaques de petri. Si hi ha creixement en aquestes plaques vol dir que hi ha seqüències complertes que permeten el creixement de la cèl·lula.
D’aquestes s’ha de veure quina colònia presenta els vectors recombinant.
 Llavors s’agafen aquestes colònies que han crescut i es sembren en dues plaques de petri: una està amb el primer antibiòtic (tetraciclina) i l’altre presenta els dos antibiòtics (tetraciclina i ampicilina). S’agafa una mostra de la colònia que ha crescut i es sembra en el mateix lloc en les dues plaques. S’incuba i després es veu que a la primera ha crescut tot ja que la seqüència per a la tetraciclina no estava tallada, però en la segona es veuen que en alguns llocs ha crescut colònia i en l’altre no. Per tant, en el lloc o no ha crescut colònia és on hi ha els vectors recombinants ja que té la seqüència tallada. Per tant, aquesta zona ha sigut ocupada per la seqüència que es vol al laboratori. Finalment, es mira en quina zona està i es busca la colònia en la primera placa (tetraciclina) i s´ agafen les colònies esperades.
4 - Una altra manera de reconeixement de seqüència és pel mètode de la transferència de Southern.
Per poder detectar d’una col·lecció de seqüències de DNA la seqüència que volem.
Fem un extracte de proteïnes d’un bacteri i es fa una electroforesi. Finalment es transfereix a un plàstic o a un paper. Aquesta placa té seqüències diferents i es posen en contacte amb DNA marcat (fluorescent o radiació), si es posa a una temperatura elevada s´ obriran i formaran heterodúplex (cadena + altre cadena estrangera). Després es veu mitjançant microscopi de fluorescència quina és (la que presenta fluorescència o marca la radiació).
- Southern en el tipatge: S’utilitza per veure relacions de parentesc o saber si l’ADN pertany a una persona. Polimorfisme de la llargada de fragments de restricció.
 Un sospitós 1 que té una mostra 1 (25nm DNA com a mínim). Aquesta mostra la tallem amb enzims de restricció i separem els segments per electroforesi.
En la electroforesi es posa dife- rents coses en cada carril (pes molecular, persona 1, prova, víctima, persona 2). Posem DNA marcats i s´ incuba dona DNA marcats per la sonda externa.
 Técnica moderna STR  repeticions de fragments molts curts. Repeticions diferents de cada individu a causa de la determinada herència biològica. Usa PCR per amplificar i poder treballar amb fragments de DNA. Les llargades son diferents per a cada individu. És una electroforesis capil·lar per visualitzar les bandes, Són fiables amb un possible error de 10 18 5  Aplicacions del clonatge de DNA:  Poder tenir proteïnes recombinant per a poder estudiar-les. Ja que de la font natural és molt complicat. Hem de tenir la proteïna amb el gen natural i l’altre amb el gen modificat i amplificat.
- EX: insulina  abans del porc, i ara mitjançant el cultiu de cèl·lules pancreàtiques a causa de l’extracció del RNA, i mitjançant un bacteri o un vector es modifica el DNA i el seu producte per a que produeixi les proteïnes recombinants que volem. En aquest cas volem insulina millorada.
 Per l’obtenció de proteïnes modificades  vector recombinant. Es substitueix un gen natural per un sintètic amb la mutació que a nosaltres en interessa modificar. Per tant el bacteri amb aquest plasmit, donarà la modificació.
 Un altre procés es separar el DNA en les dues cadenes i hidrolitzar-les. Es posa la mutació en una sola cadena i finalment les dues acaben amb les mutacions.
Es fa per millorar-les, fer-les més eficient o fer-les de vida més llarga per a us terapèutic. Però no sempre tot a be en proporcions elevades.
- Producció de proteïnes modificades: Vector recombinant es construeix un gen sintètic on hi ha els canvis (canvis de bases etc) a traves de l’enzim de restricció canvia aquesta estructura i fa que adopti els gens sintètics. Un exemple és el PCR com a mètode de modificació de proteïnes: a) Plasmidi amb gen que es vol modificar, primer que conté una seqüència amb canvis.
b) Es separa el DNA en dos cadenes separades posar el primers que hibriditzin i posar DNA polimerasa que farà les estructures que s’expressaran com plasmidis.
- Hi ha moltes maneres per introduir mutacions per tenir proteïnes modificades.
6 - Purificació de les proteïnes recombinants: Cromatografia d’afinitat. Es posa una dissolució en la que les proteïnes recombinants tindran molta afinitat per la matriu de la columna. Les proteïnes estan unides a unes etiquetes proteiques. Hi ha una proteïna de fusió  proteïnes etiqueta que són les que s’uneixen a les altres que volem aïllar. Per aïllar algunes proteïnes s’ha d’ajuntar a unes proteïnes quimèriques i es posa en una columna.
 Biblioteques de DNA: DNA genòmic  cDNA (DNA complementari) Per tenir les seqüències contínues que codifiquen per a una futura proteïna. Important per a la seqüenciació, descobriments de gens i estudi de funcions dels gens.
Tots els mRNA eucariòtic té una cua  Tindrem copies gràcies a un primer una còpia de l’mRNA.
Sempre que volem clonar una proteïna ho fem mitjançant el cDNA ja que és el que ens permet duplicar el DNA.
 PCR  tècnica molt nova dels anys 90. Com poder amplificar mostres molt petites de DNA? La idea es una reacció en cadena de la polimerasa. Ja que si hi ha organismes que viuen a 90 graus vol dir que les seves proteïnes són estables a temperatures molt elevades (aigües termals, volcans, etc). Es poder tractar amb calor la reacció de la polimerasa de forma cíclica.
1. Disseny els oligonucleotids complementaries als extrems de les regions.
2. Escalfem per separar les cadenes.
3. Afegim els oligonucleòtids.
4. Es creen hibrids = heteroduplex 7 5. Es refreda la mostra.
6. Afegim una DNA polimerasa termoestable (TAC, extreta dels bacteris que viuen a altes temperatures).
7. Copia el DNA a partir només de l’encenedor. Per tant en la forma llarga només hiha una molécula.
8. Llavors tornem a repetir el cicle. Refredem i escaldem, ja que els oligonucleótids no es gasten i no cal tornar-los a posar  procés de termociclador.
9. Obtenim una amplificació dels segments curts. Desprès de 25 cicles es pot amplificat 106.
- Es pot aplicar en el clonatge  combinat amb el PCR.
- Els encebadors han d'incloure extrems no complementaris amb un lloc de tall de RE.
8  Seqüenciació del DNA: Es basa en copiar el DNA que es vol seqüenciar. Copia sobre del DNA que vols seqüenciar i l’utilitza com a motlle.
Utilitza ADN polimerasa.
L'enzim requereix encebadors i una plantilla.
El mètode sequenation Sanger utilitza petites quantitats de ddNTP, més enllà del qual no més lluny de nucleòtids es pot afegir.
Va dissenyar els didesoxinucleotids  De cada 10 nucleòtids 1 és d’aquets. Per tant la probabilitat de que es pari la reacció és del 10%.
L'ADN de seqüència és la plantilla. Quatre experiments es realitzen en paral·lel, cadascun amb baixes quantitats d'un ddNTP. Sempre que s'incorporen ddNTP, la reacció acaba. La terminació és a l'atzar, es produeixen molts fragments. Cada banda s'identifica una posició específica ddNTP - La duplicació avança de 5’ a 3’. Per tant el nostre motlle el llegim de 3’ a 5’.
Per tant la idea era utilitzar el ddNTPs per aturar la reacció.
1. S’agafa el motlle i ho dividim en 4 parts.
2. Podem un encelador.
3. Fiquem els desoxirubonucleótids (els 4) 4.
Etc.
9 - Ja no es fa així, per el temps i el cost.
Ara el que es fa es que es barregen les 4 subunitats marcats de forma fosforita, i llavors van passant segons el seu pes molecular i veiem un espectre de florescència. I obteni8em una lectura directa dels 4 en un sol experiment.
Avui dia es diu la seqüenciació de la nova generació que es fa amb microchips. Marques florescents diferents per a cada base. Per tant lectura òptica amb un làser  Molt més ràpid i econòmic.
 Aplicacions de la biotecnologia al DNA recombinant: - Plantes transgèniques: DNA amb resistència a paràsits.
Els agrobacteris contenen un plasmidi amb un gen cDNA que aprofita la ferida de la planta per introduir-se i fer una fusió de genomes i s’integra en els cromosomes, fa que la planta produeixi els productes del gen. Nutrients que son beneficiosos per al bacteri  provoca un tumor a la planta.
El que van fer es que van aprofitar que el DNA era fàcil de manipular i substituir el gen invasor i posar gens que beneficiïn a la planta com per exemple gens resistents a herbicides o resistents a microorganismes.
Un exemple és el blat de moro transgènic que és resistent a herbicides perquè resisteix l’atac al glifosat que es un herbicida.
En el cas d´ animals hi ha microinjecció de DNA adequat que pot fer animals més grans. Ja que tenen més hormona del creixement.
Un altre exemple es que es va fer una mosca transgènica amb un gen verd que te un ritme circadià amb una proteïna que té fluorescència que va fer que la mosca a diferents moments del dia era fluorescent.
10 - Genòmica i proteòmica: Estudi massiu del genoma.
Estudi massiu del genoma  no se sap la majoria de funcions del genoma humà, estan disposat a l’atzar. Hi ha una part d’introns, freqüències ùniques ... i nomes un 1,5% que codifica per proteïnes.
Per tant seria el futur proteoma que podem veure que de les proteïnes 1/3 part no sabem la funció ja que no tenen aparentment estructura. Una part són enzims i la resta de proteïnes de membrana relacionades amb el metabolisme.
 Proteïna fluorescent verd (GFP) es va usar com un gen informador sota el promotor del gen a gen (que codifica una proteïna que controla els ritmes circadians).
  La intensitat de la fluorescència segueix una oscil·lació diària i pot restablir per la llum.
Construcció del DNA .
Cèl·lules en una situació i extraiem els que seran diferents a cada cel i per transcripció inversa unim en unes plaques amb seqüència complementaries conegudes i els fiquem en contacte i els marquem de manera diferenciada i es fa un microrray i es visualitza per fluorescència. Que ens diu que depenent del que veiem s’expressa tan sols el gen en la condició verda i en la vermella i en la groga expressa els dos.
11  Proteoma i proteòmica: - Proteoma és el complement de les proteïnes expressades per un genoma - La proteòmica és la disciplina que estudia la proteòmica  En contrast amb els genomes, proteomes són cèl·lula, teixit i específics de temps 12 ...