Tema 6: Catalitzadors biològics. Part 2 (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 25/04/2016
Descargas 1
Subido por

Vista previa del texto

Anna Jiménez Pouget Tema 6.B: Estructura i funció de biomolècules TEMA 6.B: Catalitzadors biològics. CINÈTICA ENZIMÀTICA La cinètica enzimàtica estudia les velocitats de les reaccions catalitzades per enzims i, com aquestes velocitats varien en funció; de la [substrat], de la [enzim], de la presència d’inhibidors, activadors, del pH, de la temperatura, presència de dissolvents orgànics, etc.
Es tracta d’establir el mecanisme d’actuació de l’enzim, esbrinant el nombre d’etapes de la reacció, identificant els intermediaris, determinant els valors de les constants de velocitat, etc.
Si imaginem el mecanisme enzimàtic més senzill per una reacció que només tenim un enzim per un substrat.
El pas del complex E+S a tenir E+P és el pas més lent, perquè és el pas de la catàlisi. Podem determinar la velocitat de reacció mesurant la disminució de la [S] amb el temps o bé, l’augment de [P] amb el temps (dependrà de les propietats del S i P i de les tècniques de les que disposem).
Concepte de la velocitat inicial SP L’enzim es troba en molt baixa concentració (per exemple nM) El substrat es troba en majors concentracions (per exemple mM) En aquestes condicions, [S] = constant V (velocitat) proporcional a la [S] V = k · [S] La tangent a l’origen defineix la velocitat inicial, V0 Treballarem amb el model de Michaelis Menten, per això s’han de fer una sèrie de supòsits: (1) condicions de velocitat inicial (quan miro la reacció al començament no hi ha producte), si no hi ha producte no hi ha la possibilitat que a temps 0 torni enrere la reacció, per això no hi ha k-2. Una altre condició és que tinguis una concentració de substrat molt més gran que la d’enzim, si això passa la quantitat d’enzim serà l’equivalent a la concentració del complex enzim-substrat, perquè tot el enzim està reaccionant amb substrat. Si no vario la quantitat d’enzim, a mesura que poso més substrat augmenta la concentració de producte. Si haguéssim de calcular la velocitat inicial (quantitat de producte que forma o substrat que degrado / unitat de temps), si això està agafat a temps curts, aquesta velocitat és la velocitat inicial, hi ha una part en el gràfic una part que és lineal, hem de veure durant quan temps és cert que la quantitat de producte que es forma és proporcional per la quantitat de temps, el tram de corba que encara és lineal correspon al de la velocitat inicial. Però si avancem podem arribar a moment on la velocitat no és lineal, per tant, pot ser que hi hagi moments en què l’enzim estigui buscant substrat, i així disminueix la velocitat. A més els enzims són proteïnes, i es fan malbé, i puc tenir molècules d’enzim que estiguin patint un procés de degradació, i això també afectaria a la velocitat, ja que no tindríem tant enzim. Puc tenir processos de inhibició per producte, que el producte sigui inhibidor per l’enzim. Hem de mirar durant quan temps la velocitat es compleix que és lineal, si treballem amb la velocitat inicial, estarem treballant amb Michaelis Menten.
Anna Jiménez Pouget Tema 6.B: Estructura i funció de biomolècules Segona condició (2): hem d’estar en estat estacionari, que la variació del complex enzimsubstrat al llarg del temps sigui 0 ([ES]=constant). Si això és cert, la velocitat depèn de k 2 i de la concentració d’enzim-substrat. V = k2 · [ES] Si jo vull saber si un enzim segueix la cinètica de Michaelis – Menten el que primer he de fer és determinar la velocitat inicial de l’enzim a diferents concentracions de substrat. Fem la representació i ens agafem la regió lineal de cada corba, i de la regió lineal podré calcular la velocitat inicial a cada concentració de substrat a una concentració constant d’enzim. Per cada [S] representen la velocitat inicial. Fem un gràfic on tindrem les velocitats inicials i les concentracions de substrat, si això dóna una corba hiperbòlica l’enzim segueix una cinètica de Michaelis-Menten.
Efecte de la concentració de substrat en la velocitat inicial d’una reacció catalitzada per un enzim:  Velocitat màxima (Vmàx) és la velocitat màxima que pot assolir un enzim per un substrat determinat. Al principi quant més substrat + velocitat, a partir d’un punt això comença a estabilitzar-se fins que arriba un moment que per més substrat que posis pràcticament no hi ha variació de la velocitat, per tant vol dir que estem arribant a assolir el màxim de l’enzim, això és Vmàx  La concentració de substrat a la que V0 és la meitat de la velocitat màxima és Km, és la constant de Michaelis: constant que defineix l’afinitat que té un enzim per un substrat, un enzim pot reconèixer diversos substrats però l’afinitat que té per cada un d’ells no té perquè ser la mateixa. Com més gran és la constant de Michaelis pitjor és l’afinitat pel substrat. La constant de Michaelis és aquella concentració de substrat que em dóna un valor que és la meitat de la velocitat màxima. Amb aquest gràfic mai podrem arribar a trobar un valor real de la velocitat màxima, per tant no podrem tenir un valor concret de Km (constant de Michaelis).
 La concentració d’enzim ha de ser molt baixa de manera que [S] ≫ [E].
L’estat estacionari i l’equació de Michaelis-Menten El model de mecanisme més senzill: Un reactiu, un producte, no inhibidors.
(a) (b) (c) Anna Jiménez Pouget Tema 6.B: Estructura i funció de biomolècules Dobles recíprocs o representació de Lineweaver-Burk Com puc obtenir els paràmetres cinètics a partir dels gràfics? Reconvertint les dades en els dobles recíprocs. Si jo tinc un gràfic amb velocitat inicial i concentracions de substrat, doncs jo agafo 1/velocitat inicial i a l’altre eix 1/concentració de substrat, aquest gràfic és la representació de Lineweaver-Burk, fent això converteixo el gràfic en una recta, i així és més fàcil obtenir valors concrets. I d’aquesta recta 1/Vmàx és el punt de tall en l’eix Y, i -1/km és el punt de tall en l’eix X, que sempre és en el quadrant negatiu. Per això al fer un gràfic he de tenir en compte que la recta em tallarà en el quadrant negatiu. OJO AIXÒ SURTIRÀ A TEORIA, PROBLEMES I PRÀCTIQUES.
Anna Jiménez Pouget Tema 6.B: Estructura i funció de biomolècules El significat de les constants cinètiques 𝑲𝒄𝒂𝒕 [𝑬]𝑻 · [𝑺] 𝑲𝑴 + [𝑺] La KM (constant de Michaelis): és una constant d’afinitat. Com més petit és el valor de Km millor substrat és. La Km té unitats: mM. Km: Aquella concentració de substrat a la que la velocitat és la meitat de la velocitat màxima – una mesura aproximada de l’afinitat del substrat envers l’enzim. Cada parell enzim-substrat té una Km característica. És concentració, per tant les seves unitats seran les de la concentració que jo estic utilitzant.
𝑽𝟎 = Kcat: és K2, indica quantes molècules de substrat pot una molècula d’enzim convertir en producte per segon.
Eficiència enzimàtica: relació de Kcat/Km.
És el paràmetre més informatiu: especificitat i eficiència enzimàtica  Especificitat enzimàtica: si per un determinat substrat la relació Kcat/Km és superior a la relació per un altre substrat, diem que l’enzim és més específic pel primer substrat que pel segon: vol dir que si l’enzim està en contacte amb els dos substrats simultàniament, transformarà abans a producte aquell pel que sigui més específic, pel que tingui una major eficiència catalítica. Es catalitza primer el que tingui una major Kcat/Km.
 Eficiència enzimàtica: el màxim valor de Kcat/Km està limitat per la velocitat a la que E i S poden trobar-se en dissolució aquosa. Aquesta velocitat controlada per la difusió, el màxim d’eficiència enzimàtica val com a màxim 108 - 109 M-1s-1. El valor que limita l’eficiència de l’enzim és la difusió, com difon el substrat pel medi fins a arribar a l’enzim, el que limita és el solvent. Com més proper sigui Kcat/Km aquest valor, “més perfecte” serà l’enzim.
Unitats de Kcat/Km = M-1·s-1 (Vigilar amb les unitats).
Anna Jiménez Pouget Tema 6.B: Estructura i funció de biomolècules ...