tema 2 (5) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura Bioquímica clínica i Patologia molecular
Año del apunte 2017
Páginas 13
Fecha de subida 05/10/2017
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Cuanto mayor sea el aumento de transaminasas (> 10 veces el rengo normal) mayor especificidad hepática:      10-40 veces: hepatitis aguda vírica o hepatitis aguda autoinmune >100 veces: hepatitis aguda tóxica e isquémica ALT se eleva más que AST y durante más tiempo (> vida media en plasma) ALT elevada >6 meses: proceso agudo -> proceso crónico.
En cirrosis hepática y hepatocarcinoma la elevación de AST es > ALT <10 veces el valor normal no permite conocer la etiología.
 Puede ser una hepatitis aguda alcohólica, pero también una enfermedad no hepática.
Isquemia: estrechamiento de los vasos sanguíneos Cocientes       ALT >10 veces y cociente AST/ALP elevado -> hepatitis.
ALT >10 veces y cociente AST/ALP bajo -> proceso obstructivo/colestático; aumentan algo las transaminasas, pero sobre todo la fosfatasa alcalina.
Cociente AST/ALT (cociente de DeRitis).
o Normal = 1 o Hepatitis agudas (víricas, tóxicas, autoimunes): cociente <1 o Hepatitis aguda alcohólica: 80% casos el cociente es >2 (aumenta mucho la AST y moderadamente la ALT), con ligero aumento de la fosfatasa alcalina.
o Hepatitis aguda masiva (isquémica): cociente >1.
Cociente mAST/AST total.
Se eleva cuando hay consumo de alcohol crónico.
Permite distinguir una enfermedad hepática alcohólica crónica de una con etiología no alcohólica.
Α- AMILASA       Hidroliza enlaces a1-4 en almidón y glucógeno, generando oligosacáridos, glucosa, maltotriosa, maltosa, etc.
Actúa en intestino (pH óptimo 6.9-7).
Dos genes diferentes (ambos en cromosoma 1). Isoenzimas con diferente pI (IEF): o Isoenzima S (gen AMY1A): Glándulas salivales. Múltiples repeticiones en tándem del gen (alelos con diferente número de copias) o Isoenzima P (gen AMY1B): Acinos del páncreas Actividad amilasa en otros tejidos (intestino, testículos, ovarios, pulmón, músculo, tejido adiposo), pero en menor cantidad.
50-60% actividad sérica es salival y 40-50% es pancreática.
Numerosas isoformas (PTMs) TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 41 S: SALIVAR, P: PANCREÁTICA La primera que detectaríamos aumentada es la amilasa y después la lipasa (gráfica) Amilasa tiene un pequeño peso molecular (54-62 kDa): - Se filtra glomerularmente y no se reabsorbe en túbulos renales, por lo que aparece en orina (utilidad clínica).
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 42 Macroamilasemia (5% de las elevaciones de a-amilasa): - Isoenzima S (salival) puede formar complejos con IgA o IgG Esto aumenta su tamaño y reduce su aclaramiento renal Se incrementa en plasma pero no aparece en orina aumentada.
LIPASA     Hidroliza los triglicéridos en posición 1 y 3 Se generan ácidos grasos libres y un monoglicérido.
Actúa en la interfase grasa-agua de la emulsión que forman los ácidos y sales biliares.
Glucoproteína pequeña (48 kDa). Se filtra por el glomérulo, pero se reabsorbe en los túbulos renales totalmente. Insuficiencia renal puede elevar sus niveles hasta dos veces.
Fuente principal en suero: páncreas. Menos importantes: mucosa intestinal y tejido adiposo Lipasa en el diagnóstico de pancreatitis (sensibilidad 94%, especificidad 96%).
- >5 veces a las 24-48 horas de iniciada la inflamación Permanece elevada 5-7 días 5´-NUCLEOTIDASA (5´-NT) - Glucoproteína de la membrana plasmática de células epiteliales del tracto biliar.
También ambiente microsomal.
Actividad fosfatasa: Hidroliza el fosfato de los 5´-nucleótidos como IMP o GMP, generando fosfato inorgánico + nucleósido. pH óptimo = 7.5.
Fuente: Numerosos tejidos, sobre todo hígado.
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 43 - - - Aplicación: Marcador de enfermedad hepatobiliar/colestasis. La actividad sérica de 5´-NT aumenta en colestasis, obstrucciones biliares, cirrosis biliar y enfermedad obstructiva por crecimiento neoplásico.
Bastante específico: Confirma el origen hepático de ALP, y lo diferencia de un posible origen óseo, ya que 5´-NT no se incrementa en aquellas enfermedades óseas que cursan con incrementos de ALP (osteomalacia, raquitismo o enfermedad de Paget) o en situaciones fisiológicas (embarazo, crecimiento en niños).
Problema: Pequeña sensibilidad diagnóstica; muchos FN!!! 50% pacientes con ALP elevada con origen hepático no muestran alteraciones en la 5´-NT.
CREATINA QUINASA (CK)    Localización: Asociada a estructuras miofibrilares Función: o Mantenimiento de reserva de grupos fosfato de alta energía en forma de creatina fosfato, lo que favorece un cociente [ATP]/[ADP] elevado.
o Cataliza la reacción: creatina fosfato +ADP creatina+ ATP. Requiere Mg2+ Estructura: o Enzima citoplasmático dimérico: Homodímeros y heterodímeros.
o Subunidades:  M (músculo/muscle, cromosoma 19)  B (cerebro/brain, cromosoma 14).
o CK-BB (CK-1), CK-MB (CK-2), CK-MM (CK-3).
o CK-Mt en el espacio intermembrana de mitocondrias. 15% actividad CK en el corazón. <1% en suero normalmente.
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 44 Cerebro Si teneos un traumatismo craneoencefálico, por ejemplo en un accidente de tráfico En cerebro tenemos CK-BB/CK1 CK normalmente no atraviesa la barrera hematoencefálica por su MW, por lo que incrementos de CK total en suero acompañados de aumento de CK-BB indican enfermedad en cerebro o trauma cerebral.
Músculo: Origen en músculo esquelético o cardiaco. El patrón isoenzimático diferencia los orígenes: En músculo esquelético adulto y cardiaco predomina CK-MM/CK-3, la forma mayoritaria en suero normal (95%).
Ejemplo: Músculo esquelético 97% CK-MM y 3% CK-MB ….pero CK-MB/CK-2 está presente en músculo cardiaco (adulto y del feto).
Ejemplo: Músculo cardiaco 78% CK-MM y 22% CK-MB Infarto de miocardio TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 45 Sin embargo, esto no siempre es aplicable:    En músculo esquelético de feto, las formas CK-BB y CK-MB son las predominantes.
En distrofia muscular de Duchenne la isoenzima del músculo esquelético presente es la CK-MB, debido a la regeneración de las fibras musculares. Fallo para alcanzar y mantener un grado normal de diferenciación.
Por eso, aunque la elevación de CK-MB se puede dar como consecuencia de un daño cardiaco hace falta confirmar el diagnóstico mediante el uso de otros marcadores (troponina I y troponina T), que nos aseguran que no es una distrofia muscular de Duchenne.
LACTATO DESHIDROGENASA (LD O LDH)      Es quizás la menos utilizada Proteína de elevado peso molecular (134 kDa) Cataliza la reducción reversible del piruvato a lactato: Piruvato+NADH +H+ Llactato+NAD+ Enzima tetramérico. Las subunidades más comunes son la H y M, codificadas por loci distintos.
Cinco isoenzimas (LD1-LD5) en electroforesis alcalina: o LD1 (H4) o LD2 (H3M) o LD3 (H2M2) o LD4 (HM3) o LD5 (M4) TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 46   Un isoenzima diferente, LD-X o LD-C, con cuatro subunidades X o C, está presente en testículos humanos después de la pubertad.
Se encuentra en el citoplasma de las células y es liberada cuando las células han sido dañadas o han sufrido necrosis.
Distribuida en muchos tejidos, pero.................
  LD1 y LD2 predominan en músculo cardiaco, riñón y eritrocitos, y LD3 en tejido aórtico adulto normal.
o LD1 (H4) tiene una afinidad 10 veces menor por piruvato que LD5 (M4). LD1 probablemente catalizará la conversión de lactato en piruvato y por eso predomina en tejidos que reciben un suministro rico de oxígeno, por lo que no acumulan lactato (ni piruvato) y lo emplean como combustible.
o Más termoestables.
o No se inhiben por altas dosis de piruvato.
LD4 y LD5 predominan en músculo esquelético e hígado.
o LD5 está en músculo esquelético porque se acumula piruvato en condiciones anaeróbicas y se necesita transformarlo en lactato para regenerar el NAD+ y que no se pare la glucolisis.
o Tejidos anaeróbicos.
o Más termolábiles.
o Se inhiben por altas dosis de piruvato.
H: corazón M: musculo y hígado TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 47 Aplicaciones clínicas limitadas.
         En suero predomina la LD2, seguida de LD1, LD3, LD5 y LD4.
Infarto aumenta LD1.
Como la actividad LD en aorta se debe fundamentalmente a LD3 en enfermedad isquémica cardiaca aumenta LD3.
En cambio, en aterosclerosis la actividad se debe más bien a LD5.
Altos números de células linfoides como consecuencia de una proliferación maligna hacen que las isoformas predominantes en suero sean LD2, LD3 y LD4.
En ciertos tipos de tumores sólidos (carcinomas del tracto digestivo) se ven niveles aumentados de LD5. En otros tumores, con origen germinal, aumenta LD1.
La actividad LD se incrementa en hepatitis tóxica o viral, obstrucción biliar extrahepática, cirrosis hepática o necrosis aguda del hígado.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la LD es elevada en el riñón y corazón.
Electroforesis para diferenciar el origen hepático (LD5) o renal (LD4) del cardiaco (LD1).
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 48 LAS ENZIMAS COMO DIANAS DE TERAPIAS TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 49 El tipo de inhibición que ejerce una sustancia ha de determinarse mediante análisis cinéticos con o sin inhibidores y calculando Km y Vmax mediante un gráfico lineal como el obtenido en la representación de Lineweaver-Burk Inhibición competitiva, este tipo de inhibidores son muy similares a la molécula sustrato de la enzima Análogo estructural de las bases púricas naturales hipoxantina y xantina Inhibidor de la xantina-oxidasa, la enzima responsable de la conversión de hipoxantina a xantina y de xantina a ácido úrico. Este último es el producto final de catabolismo de las purinas en el hombre.
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 50 LOS ENZIMAS COMO HERRAMIENTAS La concetración en fluidos biológicos de algunas sustancias se mide mediante el uso de enzimas:        Glucosa Urea Etanol Colesterol Ácido úrico Triglicéridos etc ¿Qué condiciones deben darse en estos ensayos?      Enzimas muy puros, específicos y con actividad enzimática específica (U/mg) elevada.
Temperatura recomendada: 30ºC.
pH constante y óptimo: buffer.
Ausencia de proteasas (inhibidores de proteasas) y presencia de estabilizadores (albúmina o glicerol) en el ensayo.
Importante!!!: Las condiciones del ensayo deben desplazar el equilibrio de modo que se consuma la mayor parte del sustrato.
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 51 Ahora vamos a trabajar en primer orden, lo que nos interesa es que la velocidad depende de la concentración de sustrato En este caso nos interesa una reacción de primer orden, es decir, que la actividad enzimática dependa de la concentración de sustrato es decir [S] << km De esta manera… - v=K[S], en donde K= Vmax/Km.
Se suelen emplear enzimas con Km elevada o se incrementa el valor de la Km con un inhibidor competitivo.
La cantidad de enzimas, coenzimas, activadores, cosustratos, etc debe de ser óptima.
Se pueden emplear: - Estándares con el sustrato puro que queremos determinar Rectas patrón.
Dos tipos de métodos  Métodos de punto final, o métodos de equilibrio: o Normalmente una reacción tiene lugar hasta que la relación [P]/[S] es constante (equilibrio).
o Se busca desplazar el equilibrio de la reacción hacia la formación del producto y consumir así lo máximo de sustrato:  Aumentando la concentración del cosustrato/coenzima, si existiese.
 o o o Haciendo reaccionar el producto de la reacción con un agente químico.
 Acoplando una segunda reacción enzimática que use el producto de la primera reacción como sustrato.
La muestra o el estándar se mezclan con el enzima y se incuban un tiempo determinado hasta que se complete la reacción o se alcance el equilibrio.
Se mide la absorbancia del producto a t=0 (blanco) y t=1.
Se calcula la concentración:  c= K(Abs del espécimen-Abs del blanco).
TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 52 o  K se calcula mediante la expresión:  K= (Concentración del estándar)/(Abs estándar-Abs del blanco).
o Se establecería un punto de calibración para cada serie analítica Métodos de tipo cinético.
o Múltiples medidas de la absorbancia a lo largo del curso de la reacción (tiempo), bien de forma contínua o discontínua (intervalos).
o No se necesita blanco porque la absorbancia debida a la matriz es incluida en los diferentes tiempos de lectura.
o Medidas de absorbancia sucesivas (A1, A2, A3, A4…) a tiempos constantes (t1, t2, t3, t4….). Esto se hace para las muestras problema y las de calibrado (la calibración en este tipo de ensayos es indispensable).
o Métodos más rápidos y menos sensibles a las interferencias.
Los enzimas como agentes terapéuticos - Estreptoquinasa y t-PA en la eliminación de coágulos sanguíneos Pronasa ADA: se puede añadir en la circulación añadiéndole una sustancia de gran peso molecular (evita la filtración a través del riñón) Etc TEMA 2 PROTEÍNAS Y ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 53 ...

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