Resum 1r Parcial (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 15
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

mfiguls Tema 1: Introducció a les malalties (aspectes generals) VARIABILITAT V F= V G + V E P=G+ E + Interacció = (A+D+I) + E - A: variació que és aditiva, depèn dels al·lels que s’hereten - D: variació que depèn de com els al·lels estan combinats - I: interaccions entre gens Ex/ Fenilcetonuria: Component gènic: enzim PAH (A) + combinació d’al·lels (D) + interacció amb múltiples loci (enzims metabolisme i excreció Phe, I) + component ambiental(dieta, E).
Tipus de malalties: Monogèniques, poques / Oligogèniques / Poligèniques, la majoria En malalties poligèniques, la suºsceptibilitat a la malaltia depèn de: Genètica + Ambient.
Interacció genotip – ambient (GxE): exemples: - XP i llum UV - PKU i fenilalanina - Efisema pulmonar i fumar CAUSES DE LA VARIACIÓ FENOTÍPICA: Malaltia per proteïna: Absència, menys/més quantitat, proteïna alterada o diferent Tipus de mutacions que afecten al fenotip: - Mutacions que afecten proteïnaà Nuls o amòrfics // Hipomorfics // Hipermòrfics // Neomòrfics - Mutacions que afecten a codonsàno tots els canvis que afecten a un gen, alteraran la proteïna, perquè hi ha diferents tipus de mutacions o Mutació sinònima/silenciosa: no s’altera el sentit del codó i en principi no afecta a la funció/estructura de la proteina § Però: si afecten al punt de splicing sí que poden tenir efectes (Ex/ Gen LGMD2A).
També poden afectar a llocs d’unió de miRNA, factors de transcripció. Poden alterar la estabilitat del mRNA. També efectes en la transcripció. Per tant, poden tenir efectes en tots els nivells.
o Mutació neutra: es canvia el sentit del codó però per un aminoàcid de característiques FQ similars, pel que la funció/estructura de la proteïna no varia o Mutació de canvi de sentit: el sentit del codó canvia, per tant també pot alterar la funció/estructura de la proteïna.
o Mutació sense sentit: comporta un codó stop ⇒ Poden produir: canvis en l’splicing (no proteïna o proteïna alterada), alterar l’estructura o funció de la proteïna, més o menys quantitat de proteïna normal...
- Mutacions que afecten a ncRNA: és RNA no transcrit amb funcions estructurals, catalítiques o reguladores. La malaltia pot estar causada perquè aquests RNA afecten indirectament al gen causant de la malaltia.
o Més de 50% del genoma es transcriu o 97-98% del RNA transcrit no es tradueix (és ncRNA) Mutacions que afecten al epigenoma, EPIMUTACIÓ (modificacions que no afecten a seqüencia nucleotídica) afecten a: o Metilació citosines: al C5 de C de illes CpG (prop del promotor) § Hipermetilació illes CpG à silenciament § Hipometilació regions repetitives à INESTABILITAT GENÒMICA - mfiguls En el càncer per exemple, hi ha una hipometilació general (el que causa inestabilitat genòmica) i, a més, hipermetilació de GST, el que fa que s’inactivin, permetent que el tumor creixi més.
Més exemples de GST inactius en càncer: MGMT (repara alquilacions, pot servir com a diana terapèutica utilitzant un agent alquilant, si hi ha MGMT hipermetilat vol dir que la resposta al tractament serà bona), GSTP1 (està present en càncer de pròstata i un biomarcador de risc).
o Complexes remodelació cromatina o RNAs no codificants o Modificacions químiques histones POLIMORFISMES GENÈTICS Variacions en la seqüencia del DNA (mutacions q no tenen perquè afectar fenotip) presents en almenys un 1% de la població. Ajuden a determinar: - Propensió a malaltia (genètica mèdica) i pronòstic o Ex/ En el càncer de pulmó hi intervenen: genètica (mutacions en gens directament o indirectament relacionats: metabolisme dels PAH, reparació adductes PAH, cicle cel·lular ), ambient (fumar...) - Resposta a fàrmacs (farmacogenètica) i per tant dosi i dianes optimes o Ex/ Quimioteràpia: § Dosi optima: a través de saber com entra i es transforma el fàrmac a les cèl·lules § Eficàcia: Sabent quins gens estan mutats a les cèl·lules tumorals.
§ Ex/ 5’ FU passa a forma activa mitjançant TP (timidina fosforilasa) i es detoxifica per DPD. La forma activa del fàrmac inhibeix la TS (síntesi de timina), tot i que hi ha una ruta secundaria per MTHFR. Els polimorfismes, segons on es trobin, tindran un efecte o altre en la resposta a 5’FU.
• A TP: si tenen molta activitat menys dosi, al reves si en tenen poca.
• A DPD: si tenen molta activitat, més dosi, al reves si en tenen poca.
• A TS: si tenen molt activitat, insensibles a 5’FU i per tant mes dosi. Al revés també.
• A MTHFR: si tenen molta activitat, insensibles a 5’FU i per tant, més dosi. Al revés també.
• a ruta de síntesi de MALALTIES MITOCONDRIALS: mutació al genoma nuclear o be al genoma mitocondrial.
Herència materna no regulada (heteroplàsmia o homoplàsmia) MOSAICISME: diferents poblacions cel·lulars en un individu. Molt típica en moltes malalties. Complica el diagnòstic.
- Quimeres: línies cel·lulars provinents de zigots diferents (fusió de zigots).
- Mosaics: línies cel·lulars provinents d’un mateix zigot, que ha patit canvis en el desenvolupament.
o Mosaic en línia germinal: poden transmetre la mutació als fills i ells no patir res.
o Mosaic en línia somàtica Complica diagnòstic perquè hem de agafar les cèl·lules amb la mutació, a més, dependent del % de cèl·lules afectades, el fenotip serà més o menys greu.
- Origen mosaics: mutació de novo o En el desenvolupament: en funció del moment que afecti, serà mes o menys greu o Reversió de la mutació en afectats o també d’origen mitocondrial DIAGNÒSTIC GENÈTIC MOLECULAR Útil per evitar naixements d’afectats o bé per teràpia en individus afectats Es pot fer analitzant: DNA / Cromatina / Cromosomes / RNA / Proteïnes mfiguls n Si tenen causa genètica: mes anticipació, però, hem de conèixer tots els factors que hi intervenen Tipus de tests: Screening neonatal, test diagnòstic, test portador, test predictiu (a través de variants genètiques), test pre-simptomàtic, tests farmacocinètica.
Tests genètics en: oòcits, embrions, fetus, nadons, nens/joves/adults (pre-simptomàtic, portadors, afectat...) Diagnòstic pot ser: DIRECTE (coneixem mutació) // INDIRECTE (no sabem mutació, per polimorf.) Tema 2: Hibridació molecular Dos maneres de Genotipar: - Amplificació específica: per cèl·lules o PCR - Detecció de seqüències concretes: hibridació molecular amb sondes La hibridació molecular es basa en a formació de dobles cadenes entre el que hem d’analitzar i una sonda , amb els passos següents: 1. Desnaturalització en condicions d’alta astringència (severitat) 2. Hibridació baixant l’astringència. Es formen les estructures híbrides si hi ha complementarietat a. En solució: cal bastanta sonda b. En suport sòlid à MÉS HIBRIDACIÓ(cal menys sonda) Es fixa la molècula a analitzar.
Normalment amb sondes de RNA, que són més estables 3. Detecció de la formació dels híbrids DESNATURALITZACIÓ aspectes generals - en ALTA ASTRINGÈNCIA - Absorbància DNA: incrementa quan està en cadena senzilla (260 nm) - Es dona per blocs: primer desnaturalitzen els de més AT i per últim els de més GC - Tm (temperatura de fusió) característica de cada cadena de nucleòtids o Moment en que 50% de la molècula esta desnaturalitzada o Li afecten diversos factors: § Composició de bases § Longitud fragment (de la regió que hibrida) § Força iònica (concentració salina): Tm incrementa si la [Na+] ho fa (estabilitza) § Complementarietat § Agents desnaturalitzants: Tm baixa si hi són § NO AFECTA [DNA] però IMPORTANT per aconseguir més híbrids.
HIBRIDACIÓ aspectes generals - en BAIXA ASTRINGÈNCIA - Factors que afecten a hibridació mostra-DNA (igualment a la desnaturalització) Característiques molècules o Longitud fragment: més llarg, més estable o Complementarietat amb sonda: com més complementaris, més hibridació i mes estable o Composició GC: l’híbrid és més estable com més GC Característiques ambient o Temperatura: a major temperatura, més desnaturalització.
o pH; també hi ha un pHm. Igual que Tª o Agents desnaturalitzants (formamida, formaldehid, urea). Igual que Tª i pH.
o Concentració salina: agent estabilitzador dels híbrids. Es fa amb ions monovalents SONDES D’ÀCIDS NUCLEICS: identificar – quantificar – localitzar seqüències específiques Generalitats: - Ha d’estar marcada i l’hem de poder detectar mfiguls - S’ha d’incubar desnaturalitzada amb la seqüencia problema - S’han d’eliminar les sondes restants que no hagin hibridat o autohibridat amb RENTATS Tipus de sondes - DNA: obtinguda per amplificació. 100 pb -20kb - RNA(ribosonda): transcripció. Aprox 100 pb - Oligosondes: per síntesi química. 15-50 nt Marcatge - Radioactiu: perillós. Però més sensible i precís.
- No radioactiu: més segur, econòmic, marcatge més eficaç i necessita menys temps. Separador o Fluorocroms o Dioxigenina, biotina Sondes de RNA: es marquen durant el procés de transcripció in vitro d’un insert de DNA dins d’un vector. Durant la transcripció d’aquest a partir d’un promotor, un dNTP està marcat - Sondes de DNA o PCR: clonar el DNA sonda (en vector) + amplificar (PCR) en presència d’un dels dNTPs marcat. S’amplifica el nº de sondes/ Sondes max 3-5kb o Nick translation: s’agafa el DNA sonda i es fan “nicks” aleatòriament amb la DNasaI pancreàtica + magnesi. Llavors amb PolI (E.Coli), que gràcies a l’activitat exonucleasa 5’3’ substituirà la cadena per cadena marcada (un dels dNTPs està marcat).
No s’amplifica nº de sondes /Sondes fragmentades o Random primed: es desnaturalitza el DNA i s’incuba en presència d’exonucleòtids (6nt) que s’uneixen aleatòriament. Llavors amb una polimerasa Klenow (sense activitat exonucleasa) i dNTPs, un marcat. Llavors es sintetitzarà a partir dels exonucleòtids. No s’augmentaa el nº de sondes /Sondes fragmentades.
- Sondes d’oligonucleòtids: els mètodes utilitzats també ho son per sondes de DNA o RNA o End labelling: marco els extrems de les sondes. Que es podran fer servir com a sondes o com a encebadors per la PCR ( i llavors el producte obtingut estaria marcat) § 5’ end labelling: el més típic. Mitjançant una quinasa i un ATP amb 32 P a la posició gamma, s’intercanvia aquest fosfat del ATP pel del extrem 5’ gracies a la quinasa. Si es volgués utilitzar una polimerasa, hauria de tenir el fosfat marcat la posició alfa.
§ 3’ end labelling: • DNA: transferases terminals TdT que afegeixen nt en 3’ • RNA: lligases d’RNA terminal, afegeixen nt en 3’ § 3’ fill-in end labelling: es basa en jugar amb extrems rom i cohesius. Tallem el DNA diana amb un enzim de restricció per tenir extrems cohesius, afegim la polimerasa klenow i dNTPs, un d’ells marcats, així, ens marcarà els extrems 3’.
Detecció - Directa: més sensibles /però pèrdua d’activitat, més car i preparació personal o Radioactivitat: més sensible / perillosa o Fluorescència - Indirecta: no tan sensible / però dura més, més barata i menys preparació personal o Anticossos o Molècules afins (biotina...) o Sempre hi unim un intermediari amb activitat.
o Passos a seguir un cop tenim la sonda hibridada al DNA a analitzar § Incubar amb l’intermediari § Rentats: que eliminen l’excés d’intermediari o La detecció pot ser - § § § mfiguls Cromogènica (precipitat amb color). Molt barata però després no podem analitzar res mes (perquè el precipitat s’ha acumulat) Quimioluminiscència, el compost emet fotons. Bastant sensible, no altera material utilitzat Fluorimètrica: s’allibera un fotó fluorescent.
Tema 3: tècniques de blotting Mètode que va aparèixer per analitzar genomes sencers buscant-hi una seqüencia concreta. Per això cal transferir el DNA a analitzar cap a una membrana rígida a la que hi afegirem una sonda.
EDWIN SOUTHERN.
- SOUTHERN—DNA - NORTHERN – RNA - WESTERN – PROTEINA SOUTHERN BLOT(DNA) PASSOS gran inconvenient, procés LLARG i es necessita DNA en bones condicions !!!! 1. AILLAR: es molt important partir de MOLT DNA i NO DEGRADAT!!!!! 2. FRAGMENTAR: la mostra amb enzims 3. SEPARAR: en una electroforesi per GRANDÀRIA.
4. DESNATURALITZAR: perquè pugui hibridar una sola cadena, sinó estaria en dúplex a. Amb pH per la mostra (gel es dèbil i es fondria) i amb Tº per la sonda.
5. TRANSFERIR (+ desnaturalitzar / despurinitzar) 6. FIXAR 7. HIBRIDAR: Amb la sonda específica.
8. RENTAR: per eliminar sonda no unida.
9. DETECTAR: no detectem directament, sinó la marca de la sonda!!!! 3.ELECTROFORESI (Separació mostra) - Material o AGAROSA: separa molècules grans, 0,1- 30 Kb. La més utilitzada en blotting.
§ Podem jugar amb la seva concentració per tal de separar molècules més grans o més petites § La més utilitzada.
o Acrilamida: molt més resolutiva. Separa molècules petites, 6-1.500 pb - Marcadors de pes molecular (Leadders), que són un punt de referència. (1kb a 100 pb) 5. TRANSFERÈNCIA Hem de transferir la mostra del gel a un suport adequat respectant la posició relativa.
- Material necessitem un material sòlid , una membrana rígida Nitrocelulosa Niló Poc utilitzat El més utilitzat.
Niló carregat + (hybond) Poliflorur de vinidlè mfiguls (-)Més fràgil, no es poden posar solucions bàsiques ni rhibridar (+) Poc soroll de fons (no compensa) - (-) Bastant soroll de fons (+) Més durable, la unió es mes estable, es pot rehibridar, posar en solucions bàsiques Mètodes de transferència Capil·laritat Poc utilitzat ara (el clàssic) (-)Engorrós, menys ràpida i fiable Electroforesi en sentit transversal Buit S’utilitza. (Sobretot Western) S’utilitza.
(+)Més ràpida i fiable (+)Més ràpida i fiable (vaccum) ****** Per fragments >3Kb à DESPURINITZACIÓ Abans de la transferència - Gel d’agarosa en una solució HCl 0.5 M, 10 min à Llocs apurínics aleatoris - Gel en una solució de desnaturalització 0.5M NaOH à Trencaments en llocs apurinics - Així assegurem que la transferència es doni correctament 6. FIXACIÓ Niló Nitrocelulosa TRANSILUMINADOR: llum UV, 3 min S’activen les bases T/U i es formen enllaços covalents amb els grups amino del niló 80ºC al buit (2h) o 120ºC (30 min) Enllaços hidrofòbics a la membrana S’ha de pretractar abans per eliminar soroll de fons.
7. DESNATURALITZACIÓ SONDA I HIBRIDACIÓ La desnaturalització de la sonda es sol fer amb temperatura. La hibridació es fa baixant l’astringència.
8. RENTATS Es basa en passos progressius a través dels quals es va incrementant la severitat. Es molt fàcil jugar amb rentats per aconseguir bons resultats. El fitre de niló es pot reutilitzar posant una astringència molt alta, llavors tot se’n va.
9. DETECCIÓ Directa Radioactivitat Molt sensible 10 fg Fluorescència Indirecta Cromogènica 60-500 fg Filtre no reutilitzable Més barat 60-500 fg Quimioluminiscència Filtre reutilizable 60-500 fg - Directa: Radioactivitat o fluorescència Indirecta: Cromogènia o quimioluminiscència TÈCNIQUES DE BLOTTING I EL QUE ENS PERMETEN DETECTAR - Southern DNA (tallat) variacions en les dianes de restricció, identificació - Northern RNA (no tallat) variacions en grandària i quantitat relativa RNA...
- mfiguls grandària i quantitat proteïnes Western Proteïnes (no tallades) Canvis epigenètics! = IDENTIFICAR i QUANTIFICAR, MAI LOCALITZAR! Western blot (proteïnes) Passos i aspectes generals a considerar Te els mateixos passos que Southern però: - NO DIGERIM LES PROTEINES - Electroforesi en SDS –PAGE: desnaturalitzant + poliacrilamida. És a dir, en el gel ja es desnaturalitzen les proteïnes - Filtre: Nitrocel·lulosa o PVDF - Transferència: per electroforesi transversal.
- Detecció Anticossos: colorimètrica (indirecta) Northern blot (RNA) Passos i aspectes generals a considerar Te els mateixos passos que Southern però: - NO DIGERIM L’RNA - Electroforesi en Agarosa desnaturalitzant + Agents inactivant RNases(DEPC,GITC) - Controls electroforesi o Control qualitat (RNA no degradat): Bandes RNAs 18S i 28S i cap sota de tot el gel o Control contaminació: banda molt ample dalt el gel o Gens constitutius (GADPH, B-actina, B2-mioglobilina, RPLP0) Corregir increment!! Increment corregit= In.Gen estudiat /In.gen control - Ens permet detectar: o Nivells d’expressió (per intensitat banda) o Canvis en grandària RNA (per posició banda) SOUTHERN BLOT(DNA) - - Ens permet detectar: o Identificar o Quantificar o Mutacions de seqüencia o Canvis epigenètics (METILACIONS) RFLPs (polimorfismes en els fragments de restricció): Canvi HA D’AFECTAR A LA DIANA o Detecció: quimioluminiscència / fluorescència o Metilacions: enzims que discriminen si la diana està metilada o no § C de mC; CCGG: HpaII (sensible met) MspI (no sensible) § mC de hmC: glicosilació 5hmC: HpaII (sensible met) MspI (sensible ghmC) o Mutacions (substitucions, guanys/pèrdues de DNA). En tots els casos es compleix.
§ Homoz (diana+): 1 banda curta /Homoz (diana-): 1 banda gran / Hetero: 2 bandes § útil per verificar (No caracteritzar) la mutació Exemples: - Anèmia falciforme (MspII i DdelI), si hi ha l’al·lel salvatge, banda de 1150 pb, si hi ha el mutat, banda de 1350 pb (pèrdua diana) - Deficiència 21 hidroxilasa: TaqI . Gen + pseudogen. Si dues bandes d’igual intensitat, homozigots pel gen i pseudogen. Si no banda a 3,7, deleció del gen. Si menys intensitat banda 3,7, portadors deleció gen.
- Distròfia miotònica s’observa una expansió (banda més gran) de mares a filles.
mfiguls o LOH (pèrdua d’heterozigosi) una banda quan en el teixit normal n’hi ha dues (ex/ càncer). Originada per diferents mecanismes (recom, no disjunció, disomia uni, conversió geneica, deleció, mut puntual). No té perquè haer-hi pèrdua física del gen salvatge.
Indicador pronòstic Tema 4: tècniques citogenètiques moleculars Ens permeten: - Identificar - Quantificar - LOCALITZAR FISH FISH(fluorocroms)Ràpida, segura, versàtil (moltes sondes !), sensible i permet analitzar interfases.
Passos Mostra: Sonda 1. Pretractament (proteïnasa K /RNasa) 1. Marcat (fluorocrom) 2. Desnaturalització (si DNA) amb agents desnaturalitzants 2. Fragmentació 3. Fixació (carnoy) 3. Desnaturalització amb pH 4. Hibridació 5. Marcats 6. Contratinció clorur de propidi 7. Antifade 8. Detecció Sondes centromèriques - Cromosomes sexuals: per al X i Y - Aneuploïdies en prenatal (screening) Tradicionalment per cariotip però la FISH permet un anàlisi mes ràpid perquè no cal cultiu (és interfàsica), tot i que només mirem el 13,18,21 i X/Y Sondes pantelomèriques (subtelomèriques) - Escurçament telòmers present en moltes malalties (síndromes d’envelliment prematur) o Q-FISH: serveix per quantificar. En una metafase es marquen els 4 telòmers i un software llegeix la intensitat i ens dona una idea quantitativa. Així tenim una mesura d’una cèl·lula. També es podria fer per Southern però no ens donaria una idea d’una cèl·lula sinó en global (tallaríem nomes els telòmers i veuríem si hi ha dispersió de bandes) Sondes de regió específica: FISH MOLT RESOLUTIVA PER AQUESTES (no amb bandes G) - Microdelecions i microduplicacions: Williams (microdel 7q11.23, elastina), Digeorge (microdel 22q). Sempre control .
- Pèrdua de p53 (càncer), posant una sonda pel gen i un control del centròmer del 17.
- Cromosoma Filadèlfia: sondes per al cromosoma 9 i el 22. Si estan juntes: translocació i gen fusió ABL-BCR - Translocació 8-14 gen de fusió IGH-MYC - TANDEM LABELLING: Marcar amb sondes de diferent color els punts fràgils d’un cromosoma, així que normalment els colors haurien d’estar junts, si es veuen els colors de les sondes per separat à S’ha donat un trencament.
Resolució FISH vs cariotip normal - Cariotip (metafase) >5Mb - FISH en metafase >1Mb - FISH en interfase 20kb-1Mb - FISH amb cromosomes estirats 5Kb-700Kb à FISH LA MÉS RESOLUTIVA mfiguls Sondes cromosòmiques: - Reordenacions cromosòmiques FISH Multicolor: pintat de tot el complement cromosòmic amb 5 fluorocroms diferents combinats - M-FISH: 5 imatges diferents que solapa - SKY: una sola imatge, amb un lector que analitza la longitud d’ona i assigna un color Array CGH: mostra en verd i control el vermell, es soniquen a l’atzar i es posen a hibridar en una metafase control, s’analitzen els colors resultants.
- guany i pèrdues de material - NO GUANYS I PÈRDUES EQUILIBRIDADES ni REORDENACIONS CROMSÒMIQUES - S’ha d’eliminar el soroll de fons afegint Human Cot-1 DNA (seqüències rep no marcades) - Contratinció amb DAPI, que ens pintarà les seqüències repetitives amb blau FISH vs Anàlisi in situ Mirem més coses La mostra s’analitza mitjanánt sondes Es necessita metafase Array CGH L’anàlisi no és in situ (trenquem mostra) Només Guanys/Pèrdues material La mostra és la sonda Més ràpid i econòmic No es necessita metafase PRINS (PRimed In Situ labelling): Síntesi de la seqüencia de DNA a analitzar a partir d’encebadors i dNTPs marcats. No hi ha amplificació sinó nomes una síntesi a partir de l’encebador - Útil en seqüències de DNA repetitiu (hi haurà més DNA amplificat, la senyal serà més clara, que no pas de seqüencia única) - PRINS Multicolor: en cada cicle afegim un encebador per un nou cromosoma i dNTPs marcats diferents que en la reacció anterior. Així, cada cromosoma presentarà una combinació de colors única.
- Més fàcil, ràpida i econòmica que FISH, però amb limitacions Tema 5: PCR convencional Tècnica d’amplificació selectiva in vitro a partir de QUANTITATS PETITES de mostra, que HAN D’ESTAR EN BON ESTAT. Obtenim un elevat nombre de còpies.
1. Polimerases de DNA: Klenow (E.Coli) Polimerasa que se li ha tret l’activitat exonucleasa. Té òptim a 37, a temperatura mes elevada es densaturalitza Poc eficaç perquè s’ha d’anar renovant (es degrada) Taq polimerasa (Thermus aquaticus) Polimerasa termostable amb l’òptim a 95ºC, permet treballar en condicions d’elevada astringència i especificitat.
Eficaç, permet molta especificitat Max cadenes de 3-5 KB Sense correcció error (no serveix per amplificar seqüències grans) Long Range PCR: aconseguim cadenes de 12-13 Kb.
Es posa la Taq + polimerasa amb correcció d’error.
Quan hi ha error, el DNA es dissocia (-processivitat), es repara l’error per les altres polimerases i es torna a associar el DNA i la Taq i continua la síntesi.
2. Buffer: - Tris –HCl + KCL - pH 8,3 (a 25ºC) baixa fins a 6,8 mfiguls - Mg cofactor polimerasa. És un determinant de l’especificiat, de manera que l’afegim nosaltres.
S’ha d’aconseguir que estigui en concentracions de 1,2-1,3 M que és l’òptim. La quantitat optima es determina per un banc de dilucions - dNTPs en quantitat equimolar 50-200 mM - Altres compostos estabilitzadors de la Polimerasa /PCR (Ex/DMSO) - Diluir la mostra si conté inhibidors de la PCR.
3. Encebadors: 2 en total (forward + reverse) així delimiten la seqüencia a amplificar i, per tant, la grandària de l’amplicó.
- Llargada: 15-25 nt - Composició de bases: similar, contingut GC 25-75%. Evitar repeticions i formació d’estructures internes.
- Temperatura de fusió (Tm): el més similar possible. Càlcul a partir de l’extrem 3’.
Tm (ºC)=2(nºA,T)+4(nºG.C) Depèn de: nº nucleòtids, tipus nucleòtids, distribució nt - Extrem 3’: mirar que sigui prou complementari amb la seqüencia a amplificar i que no ho sigui amb el de l’altre encebador.
2+ Fases PCR: 1. Desnaturalització (95ºC) 2. Hibridació (55ºC) 3. Polimerització (72ºC) *** Al TERCER CICLE els amplicons ja tenen una llargada fixa, determinada pels encebadors.
Q= m(1+E)n (Q: nº molec totals, m: nº de molec inicials, E: eficiència 80-90%, n: nº de cicles) Tenim un MÀXIM perquè s’esgoten dNTPs, Taq, encebdors i cadenes senzilles renaturalitzen Inespecificitats - Al principi de la PCR - Tipus: o Off target site primer o Amplificació inespecífica Taq (fora de la fase de polimerització) - Mètodes per evitar-ho o Touch down PCR: reduir progressivament (al llarg dels cicles) la Tº d’hibridació. Les seqüències que es sintetitzen als primers cicles són més específiques.
o Hot start: començar la PCR en calent. Introduir la Taq en la fase de desnaturalització.
§ Manual: afegir un component quan la Tº ja és 72. Però, evaporació? § Separació física: amb ceres que es fonen a 72. Però, tenim la cera junta § Hot-Start Taq Taq inactivades amb elements termosensibles (Ac o grup químic) • El més utilitzat o Nested PCR: primer PCR normal + segona PCR amb encebadors interns a la seqüencia a amplificar à 4 encebadors. Millora especificitat i evita inespecificiats.
§ Hemi-nested PCR: només amb 3 encebadors RT_PCR (RNA) Molt eficaç per analitzar petites mostres de RNA. Ràpida i sensible.
1. Aïllem RNA DNases 2. Retrotranscripció: amb la pol Tth 3. PCR a partir de cDNA Encebadors: Específics / OligodT / Hexàmers aleatoris Tema 6: Anàlisi dels productes de PCR COM ANALITZEM ELS PRODUCTES PCR: - Electroforesi en gel d’agarosa - Presència /absència d’una seqüencia: PCR, RT-PCR o múltiplex - Reordenacions cromosòmiques RET/PTC inversió cromosòmica en càncer de tiroides pal·liar, només amplificació quan hi ha el gen de fusió. Per RT_PCR.
mfiguls Colorants amb afinitat per DNA EtBR Carcinògen Taronja d’acridina Carcinògen Blau de metilè No tòxic SYBR green I Casi = sensible que EtBr - 1-5 ng 50 ng 50-200 ng 20 pg Electroforesi en poliacrilamida Electroforesi capil·lar Blotting: més precís, fins a 10 fg (amb radioactivitat).
o Dot o slot: menys mostra, més sensible, anàlisi de múltiples mostres Altres Variació en la grandària del producte de PCR: - DMD à PCR múltiple on s’amplifica cada exó - Microsatèl·lits: es poden analitzar per o Southern - RFLPs: els fragments tindran diferent llargada o PCR: fragments més llargs si el microsatèl·lit s’ha expandit. gels de poliacrilamida o Electroforesi capil·lar: molt sensible, poca mostra, rapida, resolutiva, automatitzable, permet quantificar i reproduir-la. Els amplicons de la PCR es mouen en funció de grandària i un lector llegeix la fluorescència. L’ALÇADA dels pics diu la QUANTTAT DE PRODUCTE. Els productes més grans tindran pics mes baixos (costen més d’amplificar) § PCR amb encebadors marcats amb fluorocrom.
§ Tartamudeig Resultats: • desaparició d’un picà LOH, • canvi de posició pic à Inestabilitat genòmica (ex/ amplificació de microsatèl·lits) § Opció de PCR (primers en verd i vermell) +electroforesi capil·lar Mutacions en el fragment amplificat - PCR-RFLP fem dues PCR, a la primera amplifiquem el fragment amb la mutació i a la segona el fragment amb la mutació però amb nucleòtids marcats. Digerim i observem el numero de bandesà Senzilla i rapida. Però: mutació ha d’afectar a la diana restricció, sinó no ho veiem.
- PCR específica d’al·lel (ASA). Un total de 3 encebadors: un comú i dos específics (al·lel 1 i 2) amb una posició missmatch per a l’al·lel que és específic (per evitar FP). Es fan 2 PCR, una amb cada parella d’encebadors. Presència / absència de amplificació ens diu com és l’individu.
La mutació pot estar fora la diana. Util en sistemes DIALELICS. Però: els amplicons per l’al·el 1 i 2 han de tenir diferent grandària.
- • • ASO: Dot blot+ hibridació amb la sonda específica d’al·lel. Amplifiquem per PCR la seqüencia a analitzar i la transferim a un filtre i desnaturalitzem (dot blot). La Sonda a utilitzar (19-21 nt) ha de poder discriminar perfectament un canvi en un sol nucleòtid, per tant està dissenyada de tal manera que el punt central de la sonda és on hi ha la mutació (perquè el punt crític per desestabilitzar un híbrid és el central), així doncs, hi ha un rang de severitat en els que els heterodúplex amb un missmatch es separen.
Dot blot directe vs revers: DNA fixat, sonda marcada à mutació en diferents pacients Sonda fixada, DNA marcat à un pacient, diverses mutacions Metilacions es perden al amplificar el DNA per PCR, cal tractament amb BISULFIT SÒDIC - bisulfit sòdic + Seqüenciació m mfiguls o Bisulfit: Cà T / C à C diferencia C de C metilada § Pics de T: citosines no metilades + timines § Pic de C: citosines metilades § % citosines metilades: diferència pic de T i C. El % de C no met no es pot saber o Desoxidant + bisulfit: Desox: 5hmC à 5fmC à T, Cà T / Cmà C diferencia 5hmC de 5mC § Pics de T: citosines no metilades + timines § Pic de C: citosines metilades o Sempre SEQUENCIACIÓ - PCR específica de metilació (MSP) PCR amb dos encebadors (metilació /no metilació) + tractament amb bisulfit o Amb l’encebador per no-metilació: Si s’amplifica, el DNA no estava metilat i al revés o Amb l’encebador per metilació: si s’amplifica, estava metilat - COBRA: bisulfit + PCR + enzims de restricció • Si el DNA estava metilatà es manté la diana i dues bandes • Si el DNA no estava metilatà no es manté la diana i una banda Cribratge de mutacions per PCR Moltes tècniques per a fer-ho, parlarem de les basades en el recorregut electroforètic diferencial. !! Gels de poliacrilamida, més resolutius - Anàlisi d’heterodúplex: es basa en la formació d’homodúplex o bé heterodúplex. Per PCR amplifiquem una seqüencia d’un individu (50 pb max), desnaturalitzem els productes i deixem que hibridin i fem el gel de poliacrilamida no desnaturalitzant o En els homozigots es formaran homodúplex -> 1 Banda o En els heterozigots es faran homo i heterodúplex à 3 bandes o Seqüenciem - Polimorfismes en la conformació de cadena senzilla, SSCP: s’amplifica per PCR, es desnaturalitza i refreda ràpidament i es fa un gel de poliacrilamida no desnaturalitzant o Si és homozigot: dues bandes (una per cada cadena de l'al·lel) o Si hi ha canvis: més de dues bandes o Seqüenciem - Electroforesi en gel de gradient desnaturalitzant, DGGE: fragments 1 -1,5 Kb, més resolutiva.
PCR – Desnaturalització – Renaturalització – Gel d’acrilamida amb gradient desnaturalitzant (en posició vertical) Si la mutació condueix un canvi de A à G, llavors, en l’homozigot pel mutant, la banda de G apareixerà més avall respecte la banda de A del homozigot normal. Al revés si el canvi es de GàT.
Es pot fer DGGE+CDGE: tindrem un front que avança.
o Mutació Aà G: corba es desplaça a la dreta o Mutació Gà A: corba es desplaça a l’esquerra Tema 7: Quantificació per PCR La quantificació de la mostra per PCR es pot fer per tres estratègies diferents: PCR convencional: Només en la fase EXPONENCIAL Q=m(1+E)n on encara es manté la relació lineal entre el nº de molècules inicials (m) i el nmbre de molècules en la fase exponencial.
Fora d’aquesta fase exponencial, no es pot quantificar perquè el nº de molècules inicial, no és proporcional al nº de molècules final.
mfiguls PCR a temps real (rtPCR) Fem la PCR, on hi introduïm un colorant fluorescent (SYBR green I) que s’incorpora al solc menor del DNA i emet fluorescència. Gràcies a un sistema d’il·luminació i un de lectura de fluorescència, es llegeix la fluorescència del DNA en la fase final de l’extensió de cada cicle (restant la fluorescència del SYBR lliure, que és poca). Així ens dona una corba. Per tal de quantificar es calibra mitjançant un patró de calibració del DNA, per el qual s’escollirà un treshold (llindar, dintell) a partir del qual quantificarem. A més, els valors de les PCR analitzades han d’estar sobre la recta del patró per ser fiables. Aquest llindar està per sobre el nivell de resolució del sistema. El cicle on hi ha el dintell sí que està relacionat amb el nº de DNA inicial si que està relacionat • Quantificació (en el cicle del dintell): a partir de la gràfica Q – n i l’equaio Q= m(1+E)n o L’eficàcia és el pendent de la recta a escala logarítmica E= 10-1/pendent -1 i es considera bona si té valors de 0.9-1,0 o Absoluta (amb patrons, per detectar DNA forani) / Relativa (gens constitutius, per detectar nivells d’expressió)à GADPH, B-actina, subunitat r18S • Inespecificitats o Dímers d’encebadors. Quan a la gràfica del control sense DNA incrementa el nombre de copies, indica que s’amplifiquen els dímers d’encebadors.
o Per detectar-ho, podem mirar les corbes de fusió: representacions Tº- fluor/temps , si hi veiem dos pics i un coincideix entre el control i la mostra, és que hi ha un dímer d’encebadors. Per eliminar-lo, a la fase d’extensió pugem la temperatura més amunt de la Tm dels encebadors i llegim. Per tant, només llegirem el que és DNA amplificat.
• Avantatges rtPCR vs PCR convencional: sobretot la sensibilitat, temps i contaminació PCR digital (dPCR): Utilitza MICROGOTES, on, en cadascun s’hi duu a terme una PCR per separat. S’avalua la presència/absència de amplificació a través de SYBR green I. Normalment analitza àcids nucleics en POCA QUANTITAT. Un cop feta la PCR, passa totes les microgotes per un lector de fluorescència que ens diu el total de: microgotes positives i microgotes negatives.
• • Quantificació (ABSOLUTA): sense corbes de calibració: el nombre de còpies de cada pouet segueix una distribució de Poisson.
o M, mitjana de còpies per microgota serà: § M= -ln [1- microgotes positives / microgotes totals] Molt més precisa i sensible que rtPCR, però, MÉS CARA! Tema 8: ús d’oligosondes en la PCR Podem disminuir les inespecificitats de la rtPCR i dPCR si fem servir OLIGOSONES ESPECÍFIQUES DE LA SEQÜENCIA, conjugades amb FLUOROCROMS, QUENCHERS...Per assegurar-nos que tota la fluorescència que veiem, prové de la seqüencia amplificada.
mfiguls Les sondes estan basades en l’efecte FRET: interacció que es produeix entre estats excitats i que depèn de la distància. Les molècules tenen els espectres d’emissió i absorció solapats = FLUROCROMS, QUENCHER’S (bloquegen fluorescència quan estan a prop) Tipus de sondes: - Taqman (HIDRÒLISI) sonda que hibrida a la regió mitja de la seqüencia: en 5’ té un fluorocrom i en 3’ un quencher i a més té una Tm major que els dos encebadors. Quan s’iniciï la síntesi, la Taq trencarà la sonda i s’alliberarà fluorescència.
Mesurem la fluorescència a la extensió - Molecular beacon (HIBRIDACIÖ): sonda amb forma de hairpin que és complementària amb la seqüencia amplificada pel centre i als extrems conté un Fluorocrom i un quencher. Quan hibrida amb la seqüencia, es separen i s’emet fluorescència.
Mesurem la fluorescència a la hibridació - Amb tot això fins i tot podem fer MULTIPLEX, fent servir moltes sondes marcades diferent Detecció de mutacions: (SNPs) - Sondes Taqman: específiques per la mutació. Si hi ha fluorescència, hi ha la mutació. (perquè s’ha donat la hibridació i la hidròlisi de la sonda). Es poden fer dues sondes, una per cada al·lel. Primer amplifiquem la seqüencia de la mutació i llavors posem les sondes. Tant per rtPCR com per dPCR Detecció de metilacions: - Bisulfit sòdic + PCR amb sondes per presència i absència de metilació Tema 9: Sistemes de genotipat Moltes tècniques diferents, cap millor ni ptijor.
Passos generals: 1- Amplificació segment a estudiar: PCR 2- Discriminació dels dos al·lels, diferents estratègies: a. Tècniques enzimàtiques: i. Extensió específica d’al·lel d’encebador (ASA) à Miniseq i Piroseq ii. Lligació d’oligonucleòtids à MLPA iii. Talls enzimàtics específics d’al·lel b. Ús d’oligos com a sondes i. Hibridacions específiques d’al·lel (ASOH)à Taqman i beacons 3- Detecció: Espectrometria de masses / Fluorescència / FRET / Luminiscència Format: sòlid, homogeni, semi-homogeni ESTRATÈGIA DE DISCRIMINACIÓ à Extensió específica d’al·lel d’encebador (ASA) - MINISEQUENCIACIÓ encebadors adjacents al punt de mutació. S’incorporen ddNTPs just després del 3’ de l’encebador, paren la síntesi.
o SNApshot: ddNTPs marcats amb fluorocroms i llavors electroforesi capil·lar per veure el color del pic (cada ddNTP està marcat amb un color diferent) o Mass extend només un ddNTP, els altres són nucleòtids normals. Tots sense marcar. Es fa una espectrometria de masses, que diferencia la mida dels dos al·lels (un al·lel té un nt més que l’altre) - PIROSEQUENCIACIÓ partim de la seqüencia amplificada i posem, polimerasa,sulfurilasa d’ATP, luciferasa, apirasa, APS i luciferina. Posem primer nomes un nt, per exemple A, si el nt s’uneix, es forma un pirofosfat, passa a ATP i es genera 1 foto (= 1 nt). Que es detecta en un PIROGRAMA. Lavors apirasa degrada els nt sobrants i afegim un segon nt. Al final observem els pics, si veiem que hi ha dos pics més baixos del que correspondria a un foto, és perquè l’individu és heterozigot.
ESTRATÈGIA DE DISCRIMINACIÓ à lligació d’oligonucleòtids - MLPA esdissenyen 3 encebadors: un comú per als dos al·lels i dos mes, un per cada al·lel. Els encebadors específics per l’al·lel cauen al costat del encebador comú i tenen un sistema de discriminació (longitud o bé marcatge). Tots tenen seqüències específiques per una posterior PCR. Afegim tots els encebadors i lligasa, si lliguen hi ha amplificació i es distingeixen els productes per electroforesi capil·lar.
4- mfiguls ...