Tema 8 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2014
Páginas 9
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 45
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 Tema 8. Cinètica dels estats efímers o fugaços ESTAT ESTACIONARI I PRE – ESTACIONARI En aquest tema veurem l’anàlisi de reaccions enzimàtiques a temps molt curts, és a dir, a temps de reacció previs a l’estat estacionari.
Fins ara hem estat assumint l’estat estacionari que fa referència al moment en el qual la variació de la concentració del complex ES en el temps es manté constant.
Per tal d’arribar a l’estat estacionari, la reacció passa per un període molt curt on la formació de producte és molt baixa i que es coneix amb el nom de estat pre – estacionari. Aquest estat ens pot interessar per elaborar estudis de mecanismes de reacció i de càlcul de constants que fan referència a processos molt ràpids.
MÈTODES DE MESURA DE REACCIONS RÀPIDES A la imatge veiem les escales de temps en les quals nosaltres podem treballar. Escollirem una o altre en funció de la Kcat de la reacció. El mètode manual està situat en l’ordre de segons.
-1 Si tenim un enzim amb una Kcat = 1000 s i aconseguim treballar amb una tècnica on l’anàlisi de la reacció sigui de 1 ms, estaríem per sota de la constant de la reacció i en conseqüència estaríem mesurant els equilibris de formació de l’enzim lliure i el substrat.
Normalment es treballa en l’ordre de microsegons ja que cal tenir present que els aparells per fer aquestes mesures són molt cars i moltes vegades no es disposa d’ells.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 Esquema general dels sistemes Trobem diferents tipus de tècniques en funció de l’escala amb la qual volem treballar. Tots els sistemes estan constituïts per diferents mòduls que separem en: inici de la reacció ràpida, detecció del canvi en la reacció, registre del senyal.
Pel que fa al mòdul d’inici de la reacció ràpida en trobem de diferents tipus en funció del mètode que emprem ja que la cubeta de reacció tindrà unes característiques determinades. En trobem:  Mètodes de flux  Mètodes de relaxació  Mètodes de irradiació El mòdul de detecció s’encarrega d’enregistrar un canvi en les propietats de la nostra barreja de reacció i també tenim diferents possibilitats per fer-ho:  Fotometria ja sigui d’absorció, fluorescència, CD o RMN.
 Dispersió de la llum  Conductivitat elèctrica Seguidament trobem un mòdul que registra la senyal i ens permet obtenir uns resultats.
MÈTODES DE FLUX Els mètodes de flux es basen en mesurar la reacció con s’està produint la formació del complex ES. Aquesta mesura es produeix pel desplaçament de la barreja de reacció a la càmera de mescla.
Mètode de flux continu El mètode de flux continu no s’utilitza molt en l’actualitat però és un dels més fàcils d’entendre. En aquest cas disposem de dues càmeres, en una tenim l’enzim i en l’altre el substrat. Mitjançant un sistema d’èmbols molt precís, s’elabora un impuls sobre les dues càmeres de manera que totes dues queden barrejades a la càmera de mescla. Com a conseqüència de la pressió que s’exerceix, el líquid va avançant sobre el conducte.
Amb aquest sistema el que volem mesurar és la transformació al cap d’un temps de reacció i això ho podem fer jugant amb la distància a la qual es troba el receptor del tub de sortida.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 Hem de tenir present dues coses a l’hora de mesurar transformacions a temps molt petits:  Com que volem treballar a etapes inicials, la concentració d’enzim i de substrat ha de ser semblant.
 En funció si volem veure temps més grans o més curts de reacció, la quantitat d’enzim varia molt. De manera que si aquest és molt car, fer la mesura serà cara.
Per utilitzar aquest mètode hem d’aconseguir que el flux no tingui turbulències ja que sinó la lectura no serà nítida i les lectures seran errònies.
El temps de reacció es pot definir com: Si treballem amb un flux d’una velocitat de 10 m/s i a una distància de 1 cm, obtenim que el temps de reacció és de 1 ms.
Aquest mètode té unes limitacions en quant al temps més curt de reacció al qual podem treballar i això és el que ens ha portat ha classificar els mètodes en funció del temps que som capaços de detectar. En el mètode de flux continu, el temps mort, és a dir, el temps mínim de reacció que podem mesurar està en 0,1 – 0,2 ms. Així doncs, aquells processos que es produeixen per sota d’aquest temps no es pot detectar. S’estima que el temps màxim al qual podem treballar amb aquest detector és de 100ms.
Mètode de flux detingut El mètode de flux detingut té una base similar al mètode de flux continu. En aquest cas tenim dues xeringues que contenen l’enzim i el substrat i es diferencia pel fet que hi ha una tercera xeringa que és l’encarregada d’aturar el flux del líquid de reacció.
Així doncs, aquest mètode és bàsicament igual a l’anterior però varia la forma de mesurar el temps de reacció. El temps de mort és una mica més elevat, de 0,5 ms.
Mètode d’extinció (quenched flow) El mètode d’extinció és diferent als anteriors ja que en aquest cas no mesurem directament la reacció, és a dir, en els casos anteriors teníem la mescla de reacció en una càmera i allà fèiem la mesura però, en aquest cas tenim la barreja de reacció i en el temps establert en el qual volem aturar la reacció el que fem és afegir un reactiu al medi que aturi la reacció. La reacció es pot veure aturada per diversos factors, com ara la inhibició de l’enzim i es poden fer servir àcids com ara el tricloracètic, sempre i quan no ens afecti l’enzim i puguem disposar del que volem.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 L’aturada de la reacció es produeix de manera molt ràpida i aquesta barreja la podem recollir i analitzar tranquil·lament la formació de productes. El quenched flow té l’avantatge que podem tenir posteriorment la mostra en les condicions que vulguem, però cal tenir present que el temps mort és molt més elevat que en els altres casos, d’uns 4 – 5 ms.
MÈTODES DE RELAXACIÓ Els mètodes de relaxació es basen en dues premisses: 1.
Són aplicables només a les reaccions reversibles 2.
La mesura la començarem partint del complex ES en equilibri a unes certes condicions. Fins ara partíem d’enzim i de substrat lliure.
Recordem que l’equilibri d’una reacció depèn de la temperatura, de manera que si la temperatura varia, l’equilibri també ho farà. Els mètodes de relaxació es basen en això de manera que necessitem aparells que ens permetin fer canvis de temperatura a temps molt curts que al qual mirem el que passa a la reacció.
A la imatge veiem que al canviar la temperatura, la reacció arriba a un nou equilibri i que aquest canvi és del tipus exponencial. Aquesta zona exponencial es pot linealitzar i coneixent la constant macroscòpica d’equilibri i el pendent d’aquesta recta linealitzada, podem determinar els constants d’equilibri K 1 i K-1.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 APLICACIONS DELS MÈTODES A continuació veurem de forma senzilla quines aplicacions donen els mètodes que hem vist anteriorment. Per exemple, a partir d’un comportament cinètic anòmal podem explicar quin és el mecanisme d’una reacció.
Reaccions enzimàtiques: fases de “burst” o “lag” Recordem que a vegades, quan comencem a mesurar la velocitat incial d’una recció a temps molt curts, aquesta no es comporta com esperem. Pot ser que trobem una etapa amb més pendent (fenomen de burst) o bé amb menys pendent (fenomen de lag).
El comportament pot ser simplement per un problema de disseny de l’aparell que estem utilitzant o també pot ser degut a un mecanisme seqüencial ordenat. Suposem que el mecanisme de la reacció és del tipus seqüencial però volem determinar si és ordenat o bé estadístic; podem determinar quin dels dos és a partir dels resultats que obtenim.
Mecanisme seqüencial ordenat Si elaborem un assaig mitjançant un mètode de flux on tenim en una de les cambres tenim l’enzim i un dels substrat i en l’altre cambra l’altre substrat, si el mecanisme és seqüencial ordenat no veurem reacció fins que no es produeixi la barreja de les dues cambres.
Tot i això, la velocitat de reacció dependrà de quin substrat tinguem amb l’enzim a la cambra, és a dir, tenim dues possibilitats:  Si a la cambra on tenim l’enzim també hi trobem el primer substrat, ja estarà format el primer complex ES quan es produeixi la barreja amb l’altre substrat que permetrà formar el complex ternari i així obtenir producte. En aquest cas el temps de formació de producte serà més petit ja que una part de la reacció ja s’havia avançat en la cambra.
 Si a la cambra on tenim l’enzim tenim el segon substrat, aquests no podran interaccionar entre ells fins que no interaccioni primer el primer substrat que es troba a l’altre cambra. Per tant, el temps de reacció a partir del qual es comença a formar producte és més gran.
Així doncs, si tenim una reacció amb un mecanisme seqüencial ordenat tindrem temps de reaccions diferents depenent de com elaborem l’assaig i això ens permetrà diferenciar quin dels dos substrats és el primer.
Mecanisme seqüencial estadístic Si el mecanisme de la reacció és seqüencial estadístic, obtindrem el mateix temps de reacció tant si partim de la barreja de l’enzim amb un substrat o amb l’altre substrat.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 “Burst”: determinació de la concentració d’enzim A partir dels estudis de l’estat pre – estacionari podem estudiar quins són els mecanismes de la reacció tenint en compte aquells exemples d’enzims on trobem el fenomen de burst. Aquest fa referència quan mesurem la quantitat de producte front el temps de reacció i observem dues pendents, on la primera mostra una connectivitat del sistema molt més gran que a temps posteriors.
Hi ha diverses raons que poden provocar aquest fenomen de burst: 1.
Es tracta d’una reacció on el producte interacciona molt fortament amb l’enzim, és a dir, és un inhibidor molt potent. En aquestes circumstàncies observarem que la velocitat baixa molt i per tant, la concentració de substrat també ho fa.
2.
El mecanisme de la reacció per l’alliberació de producte és molt lent però, a temps curts de reacció, com que l’enzim es troba lliure, la velocitat és més elevada.
3.
L’enzim reacciona amb el substrat mitjançant un mecanisme de doble desplaçament on la formació del primer producte és molt més ràpida que la del segon. En conseqüència, la descomposició de l’intermediari (Segona etapa) és la que limita la velocitat de la reacció.
Anàlisi de la reacció per mètodes de flux. Exemple: quimotripsina A la imatge següent veiem diferents tipus de corbes en funció del moment de la reacció en el qual ens trobem.
 Gràfic 1. Observem quin és el comportament per la quimotripsina, on hi ha un primer pendent que fa referència a un temps molt ràpid de la reacció i després una estabilització d’aquest pendent, és a dir, l’estadi estacionari. A la gràfica 2 veiem una extrapolació de la fase estacionària d’aquest cas.
 Gràfic 2. En aquest cas veiem com comença la reacció i a continuació no hi ha pendent, és a dir, que la formació de producte es manté constant. Un cop el pendent de la reacció és nul, no ens trobem en estat estacionari.
.
Gràcies a aquests anàlisis podem determinar si una reacció es troba en estat estacionari o no i si hi ha diferents velocitats de reacció.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 Reacció catalitzada per la quimotripsina La quimotripsina és una proteasa i en seu substrat natural són les proteïnes, concretament, reconeix específicament enllaços peptídics quan trobem aminoàcids hidrofòbics. Per tal d’estudiar la quimotripsina i les seves propietats, s’utilitzen substrats sintètics que ens permeten analitzar la cinètica i el seu mecanisme.
Se solen utilitzar substrats petits on la quimotripsina elabora el mateix mecanisme que amb un substrat natural. Per fer aquests estudis s’utilitzen compostos com ara el p – nitrofenolacetat.
S’ha pogut determinar que la quimotripsina hidrolitza enllaços peptídics mitjançant un mecanisme de doble desplaçament i per tant, durant el procés de catàlisi hi ha un temps de reacció on l’enzim està unit transitòriament al producte de la reacció.
Concretament, es forma el complex ES, a continuació s’allibera el primer producte i queda unit l’enzim amb l’altre part de la molècula (que serà el segon producte). Quan entra el segon substrat, que en aquest cas és l’aigua, es pot produir l’alliberació del segon producte.
Considerant aquest model sobre el substrat sintètic veiem que a la primera part de la reacció, el paranitrofenilacetat es trenca alliberant paranitrofenol i l’enzim que queda transitòriament acetilat.
Quan entra l’aigua, aquesta modificació es desfà alliberant àcid acètic. Aquesta última etapa és la més lenta de tota la reacció.
Anàlisi de burst en la formació de p – nitrofenolat a partir de p – nitrofenilacetat catalitzada per la quimiotripsina Hi ha un fet molt important i és que la constant catalítica de la primera reacció és molt més ràpida que la de la segona.
Per tant, si nosaltres mesurem el primer producte alliberat, observarem dos pendents diferents. A més, el nivell de formació de primer producte en l’etapa ràpida depèn de la concentració d’enzim, on a major quantitat, major pendent.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 Això només es pot explicar des del punt de vista cinètic s diem que K1 i K2 són molt més ràpides que K3 i per tant, quan totes les molècules d’enzim han arribat a formar E – I, l’alliberació del producte dos i per tant d’enzim lliure per tornar a formar producte 1 és molt més lenta. En conseqüència obtenim que a temps curts, la velocitat de la reacció va molt més ràpida degut que disposem d’enzim lliure però posteriorment hi ha una limitació d’aquest.
.
Aquests anàlisis cinètics els trobem sobretot associats a altres proves on obtenim que un dels dos processos de catàlisi és més ràpid que l’altre. En aquests casos, la constant catalítica fa referència a la segona part del procés ja que la primera, al ser molt ràpida, no l’apreciem.
Una deducció relativament simple ens indica quin és o com podem expressar la prolongació de la segona zona sobre l’eix d’ordenades. A la imatge de la pàgina anterior observem que a major concentració d’enzim, més alt és el punt d’intersecció. Aquest punt també depèn de les constants K 2 i K3, però com que en aquest cas K3<<K2, podem simplificar el punt d’intersecció (π) com: Així doncs, el punt d’intersecció ens donarà quina és la concentració d’enzim actiu que tenim a l’assaig.
Exemple d’anàlisi cinètica per stopped - flow En aquest tipus d’anàlisi cinètica obtenim que la interacció de l’enzim amb el substrat, és a dir, la formació del complex ES provoca un canvi en la conformació de l’enzim que afecta a la fluorescència de les tirosines o triptòfans que conté. La formació del complex ES és molt ràpida i per tant no ho podem estudiar amb mètodes de cinètica de l’estat estacionari però sí amb mètodes de cinètica ràpida com aquest.
Així doncs, en aquest cas partim d’un determinat nivell de fluorescència que augmentarà fins al punt de formació del complex ES.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T8 Mètodes de relaxació. Determinació de constants de la cinètica de l’estat pre – estacionari. Exemple de reacció de primer ordre, reversible Recordem que els mètodes de relaxació s’apliquen a sistemes reversibles on es fa un canvi en la variable de la temperatura per arribar a un nou equilibri.
Així doncs, partim d’un equilibri inicial en la transformació A ↔B. Quan elaborem un canvi en la temperatura, es produeix un canvi en l’equilibri i aquest el podem establir en funció de la formació de producte com ∆[B 0]. Per tant, les transformacions estan associades a un canvi de temperatura.
Si integrem, arribem a una equació que ens relaciona ∆[B0] amb les constants. Si linealitzem l’equació exponencial negativa, obtenim una recta on el pendent es defineix com: m = K 1 + K-1.
9 ...