DGM- Tema 8 .Ús d'oligosondes en la PCR (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 8
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 8 mfiguls 8/4/15 TEMA 8. Ús d’oligosondes en la PCR: Tant amb la rtPCR com en la dPCR podem emprar oligosondes conjugades amb fluorocroms per tal d’eliminar les inespecificitats, que redueixen la precisió de l’anàlisi.
Aquestes són sondes específiques de l’amplicó que ens interessa, marcades amb fluorocroms.
• Si hi ha l’amplificació de seqüències estranyes, aquestes no presentaran complementarietat amb l’oligosonda, de manera que no n’observarem fluorescència.
Mitjançant aquestes reduïm el grau d’inespecificitat, però alhora menor serà l’eficàcia d’amplificació del producte específic.
Però necessitem un sistema per diferenciar si la sonda ha hibridat específicament amb l’amplicó o està lliure, per això utilitzem sondes basades en l’efecte FRET.
1. Efecte FRET (Foster or Fluorescense Resonance Energy Transfer): És la interacció que es produeix entre estats excitats de dues molècules i que depèn de la distància.
Tenim oligosondes amb fluorocroms que emeten fluorescència en determinades situacions.
Utilitzarem dos fluorocroms en els quals els seus espectres d’emissió i absorció es solapen, si es troben junts, el primer fluorocrom excita al segon, que emet fluorescència.
Imaginem un fluorocrom verd que s’excita, si esta prop d’un altre fluorocrom (vermell), li pot transferir l’energia a aquest i aquest alliberarà fluorescència vermella. La distància està entre 10-100 Å A part de fluorocroms es poden utilitzar: - Quencher’s: són bloquejadors de la fluorescència. Quan el fluorocrom està al costat del quencher, no s’emet llum.
- Podem analitzar fluorescència, llum visible, calor...
Perquè es doni la transferència, els fluorocroms han d’estar relativament a prop (10 – 100 Å) i, a més, hi ha d’haver un solapament entre l’espectre d’emissió del donador i el d’absorció del receptor.
Sondes fluorogèniques: - - Sondes d’hidròlisi: Sondes TaqMan: analitzem la hidròlisi de les sondes Sondes d’hibridació: Molecular beacon (balisa): analitzem la hibridació de les sondes 1 DGM- Tema 8 mfiguls Sondes TaqMan: Es detecta la hidròlisi/digestió de la sonda.
Quan fem l’anàlisi amb aquestes, a part dels dos primers per amplificar la seqüencia específica, utilitzem un oligo amb un fluorocrom, que utilitzarem com a sonda, i que hibridarà a una regió mitja de la seqüencia.
Per això, s’han de complir dos requisits: - L’oligosonda ha de tenir una Tm major que els dos encebadors, de manera que després de desnaturalitzar ens interessa que el primer que hibridi sigui la sonda, i, quan hibridin els primers, la sonda ja s’hi haurà unit.
o Això es perquè ens interessa digerir la sonda, això ho fem amb la Taq (que també té activitat exonucleàsica).
o Si la Taq està amplificant i arriba la sonda, la digereix si està hibridada d’una manera estable.
- A més, hem de bloquejar el 3’ de l’oligosonda amb un quencher: o el quencher l’utilitzem perquè quan la oligosonda s’hagi desprès del DNA, el quencher ja no li farà efecte i alliberarà fluorescència (la seva). La quantitat de fluorescència que s’alliberi serà proporcional a la quantitat de cebadors units al DNA motlle.
Molecular beacons: Es detecta la hibridació de la sonda.
Les oligosondes formen una mena d’enllaç en el que s’uneixen quencher-fluorocrom degut a que els extrems de la sonda són complementàries, formant una estructura de hairpin. De manera que aquesta unió es mantindrà a una temperatura no molt elevada.
La part interna de la sonda conté la seqüencia complementària a l’amplicó a analitzar.
Desnaturalitzem, quan baixem la temperatura, el primer que hibridarà amb el motlle serà la sonda, amb la qual cosa el fluorocrom i el quencher queden separats. Així, si excitem el fluorocrom, emetrà fluorescència.
• Per tant només hi ha emissió fluorescent quan la sonda hibrida amb el motlle (no quan està en solució).
En aquest cas, la Tm de la sonda ha de ser major a la dels encebadors.
2 DGM- Tema 8 mfiguls Normalment, aquesta hibridació no es tant estable com les sondes Taqman, de manera que quan la Taq arriba no la digereix, sinó que aquestes se separen del motlle.
Mesura de la fluorescència: Quan s’utilitzen sondes: - SYBR Green I es fa servir cap al final de la fase d’extensió - TaqMan també es fa servir cap al final de l’extensió - Beacon es fa servir al principi de la hibridació o annealing, perquè la Taq haurà desplaçat les sondes de la cadena motlle • • El punt d’hibridació dependrà del sistema que utilitzem per detectar la fluorescència.
També hi ha sondes dobles (Casa Roche): són dues sondes, cadascuna amb un fluorocrom (a l’extrem 3’ una, i al 5’ l’altra). És més car.
Múltiplex Podem emprar diferents fluorocroms per tal de realitzar una PCR múltiple, així podem distingir sondes diferents amb un sol anàlisi En l’exemple es mostren sondes per diferents retrovirus (marcades amb diferent fluorocroms). Si analitzem el DNA de diferents pacients, segons la senyal fluorescent, podem determinar quina infecció pateixen.
El SYBR Green no es pot utilitzar per quantificar en una Múltiplex, però sí per identificar. Ja que cadascun dels amplicons tindrà una Tm diferent, després de l’amplificació, es farà un anàlisi de les corbes de fusió i en funció del pic, podrem determinar si es un retrovirus o altre (i podrem haver utilitzat el SYBR Green).
3 DGM- Tema 8 mfiguls 2. Detecció de MUTACIONS També podem emprar els oligonucleòtids per DETECTAR MUTACIONS.
Amb les oligosondes poden identificar la presència de mutacions puntuals (detecció de SNPs).
Els oligonucleòtids de la PCR es poden fer servir com a: - Oligonucleòtid com a encebador o l’especificitat ha d’estar a l’extrem 3’, perquè si no hi és específic, no pot hibridar establement. És a dir, l’oligo coincideix amb l’extrem 3’ - Oligonucleòtid com a sonda o Haurà d’estar marcat o Haurà de tenir, a més, l’extrem 3’ bloquejat o L’especificitat de l’oligo es troba en què dissenyat perquè hibridi amb la possible mutació o Segons si la sonda ha hibridat específicament o no, la Taq digerirà o no la sonda.
§ Emissió fluorescent – hi ha l’al·lel mutat (digestió de la sonda) § No- emissió fluorescent – no hi ha l’al·lel mutat (no digestió de la sonda perquè no ha hibridat completament) Per DETECTAR SNPs dissenyarem: - Dos encebadors: que delimiten l’amplicó - Sonda específica per la mutació, que, en el cas de l’assaig TaqMan tindrà un fluorocrom i un quencher (un a cada extrem). El fluorocrom, quan s’alliberi del quencher desprendrà fluorescència Si l’individu és heterozigot, hi haurà la digestió de dos oligonucleòtids, de manera que hi haurà senyal fluorescent corresponent als dos al·lels. La quantitat de fluorescència dels dos al·lels serà mes o menys igual i no arribarà als nivells que tindríem si l’individu fos homozigot.
4 DGM- Tema 8 mfiguls 3. Detecció de mutacions per PCR digital (ddPCR) En una PCR digital es solen utilitzar oligosondes per tal de detectar una seqüencia concreta. Per cada al·lel s’utilitza una sonda taqMan marcada amb un fluorocrom diferent.
6. Detecció de metilació del DNA per PCR Les oligosondes també es poden utilitzar per DETECTAR METILACIÓ.
1. En aquest cas, dissenyarem dues sondes: per presència i per absència de metilació 2. Tractarem el gDNA amb bisulfit: tenint en compte que després d’aquest, les citosines metilades canvien 3. Analitzarem el senyal: La diferència de senyal entre metilades i no metilades, ens permetrà determinar el percentatge de metilació 5 ...