Tema 2: Centrifugació (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecniques de bioquímica i biologia molecular
Año del apunte 2016
Páginas 4
Fecha de subida 20/04/2016
Descargas 14
Subido por

Vista previa del texto

Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili Centrifugació  Principis bàsics: La força centrífuga és la que s’exerceix sobre un cos quan aquest gira al voltant d’un eix Les estructures biològiques mostren un increment dràstic en la sedimentació quan estan sotmeses a una força centrífuga. La força centrífuga relativa usualment és expressada com un múltiple de l’acceleració deguda a la gravetat.
Quan es dissenya un protocol de centrifugació és important tenir els següents punts en ment:       Com més densa sigui l’estructura biològica, més aviat sedimentarà en un camp centrífug Com més gran sigui una estructura biològica, més ràpid es mourà en un camp centrífug Com més dens sigui el tampó de centrifugació, més lenta es mourà la partícula en el camp centrífug Com major sigui el coeficient de fricció, més lenta es mourà la partícula Com més alta sigui la força centrífuga, més ràpid sedimentarà la partícula El coeficient de sedimentació d’una partícula serà zero quan la densitat de dita partícula i el medi circumdant siguin iguals.
Les partícules biològiques que es mouen a través d’un medi viscós experimenten un arrossegament per fricció, de forma que la força de fricció actua en la direcció oposada a la sedimentació i és igual a la velocitat de la partícula multiplicada pel coeficient de fricció. El coeficient de fricció depèn de la mida i la forma de la partícula biològica.
Com la mostra es mou cap a la part inferior d’un tub de centrífuga, la seva velocitat augmentarà si el radi del rotor és major. Alhora, les partícules també es troben amb una resistència de fricció que és proporcional a la velocitat: la forca de fricció en una partícula que es mou a través d’un fluid viscós és el producte de la seva velocitat i el seu coeficient de fricció, i actua en la direcció oposada a la sedimentació.
A partir de l’equació pel càlcul del camp de centrífuga relatiu es fa evident que quan es descriuen les condicions per a la separació centrífuga d’una partícula biològica, s’ha de subministrar una llista detallada de la velocitat del rotor, les dimensions radials i la durada de la centrifugació.
Essencialment, la velocitat de sedimentació és depenent de la força centrífuga aplicada (G) que es determina a partir de la distància radial (r) de la partícula (en cm) des de l’eix de rotació i el quadrat de la velocitat angular (ω) del rotor (en radians per segon): G = ω2·r Si expressem la velocitat angular en º, hem de tenir en compte que 360º són 2π rad, també es passarà de segons a minuts, de forma que la velocitat angular quedarà expressada en revolucions per minut: ω = (2π /60) RPM Si substituïm aquesta nova velocitat angular en la fórmula de la força centrífuga aplicada obtenim el següent: G = 4π2RPM2· r / 3600 On RPM correspon a les unitats de la velocitat angular.
La força centrífuga aplicada s’acostuma a expressar en múltiples de gravetat, la força centrífuga aplicada relativa (g), RCF, és el rati d’una acceleració centrífuga en un radi específic i la velocitat de l’acceleració estàndard de gravetat, es pot calcular amb la següent equació: RCF = G / g = (4π2RPM2· r) / (3600·981) On g és la força de la gravetat (981). Es tracta d’un rati, de forma que no té unitats.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili En una suspensió amb partícules biològiques, la velocitat de sedimentació no és únicament dependent de la força centrífuga aplicada, sinó que també depèn de la naturalesa de la partícula (la seva densitat i radi) i de la viscositat del medi de centrifugació. En la següent fórmula trobem la velocitat que presenta una partícula esfèrica durant la sedimentació: V = (2rp(ρp- ρm)·ω2r) / 9η On tots els valors que presenten el subíndex p corresponen a la partícula i els que presenten el subíndex m corresponen al medi. η correspon a la viscositat del medi. La velocitat de sedimentació pot expressar-se també com a coeficient de sedimentació (S): S = V / ω2r El coeficient de sedimentació és constant en una mateixa partícula (les subunitats dels ribosomes, per exemple, estan anomenades segons el seu coeficient de sedimentació: 18S, 20S i 25S). Les unitats d’aquest coeficient són els Svedbergs  1 S = 10-13 s Per saber el temps de sedimentació, ens hem de basar en la forma física en que la velocitat és igual a l’espai dividit pel temps. El temps s’expressa com el diferencial de rb (distància del centre de rotació fins al fons del tub) i rt (distància del centre de rotació fins al líquid), que al integrar-lo dóna un ln: t= 9η 2ω2 rp2 (ρm-ρp) · ln rb rt Segons on es situa cada paràmetre en les fórmules descrites, es pot veure com influeix. Tots aquests càlculs s’han fet suposant una situació ideal, a continuació es mostren les discrepàncies entre la teoria i la pràctica:  Estem suposant que totes les partícules són esferes perfectes, i dins d’una cèl·lula hi ha partícules amb moltes formes. A més, aquestes partícules acostumen a estar hidratades  Concentració de la suspensió  Natura del medi  Disseny i tipus de centrífuga  Tipus de centrifugacions:  Preparatives: són les d’ús més comú, el seu objectiu és aïllar molècules (àcids nucleics, lipoproteïnes, virus) d’una mescla per al seu anàlisi o ús posterior. No hi ha molta preocupació pels detalls fisicoquímics, i s’usa una major quantitat de mostra ja que el que és vol és obtenir prou quantitat de mostra per poder fer mesures posteriors.
 Analítiques: l’objectiu és la mesura de les propietats físiques/hidrodinàmiques de les partícules que sedimenten, tals com el seu coeficient de sedimentació o la seva massa molecular, per a això, es necessiten les macromolècules pures. Es treballa amb volums molt petits i s’usa un equipament específic que ens permet definir millor els paràmetres fisicoquímics  les molècules s’observen mitjançant un sistema òptic durant la centrifugació, de forma que els tubs de centrífuga han de ser de quars per deixar passar la llum visible i UV i el rotor ha de ser basculant per a la seva observació vertical.
Mètodes de separació: en els dos casos es tracta de centrifugacions preparatives  Centrifugació diferencial: una centrifugació o una tanda de centrifugacions encadenades en les que partim d’un tub on hi ha una solució homogènia a la qual apliquem diferents gravetats a diferents temps i com a resultat obtenim un sobrenedant i un precipitat, a partir dels quals es poden seguir fent més centrifugacions.
El fonament d’aquest tipus de centrifugació consisteix en l’aplicació de velocitats de sedimentació diferents per aconseguir separar partícules de diferent mida i densitat. S’obtenen fraccions de precipitat que no són 100 % pures, de forma que es fan posteriors rentats i es pot re-purificar aquest pellet fent més centrifugacions.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili El desavantatge és el temps, és una tècnica molt lenta que pot durar fins a 2 dies per a que sigui total i en el cas que vulguem re-purificar el que ens interessa encara es fa més llarga, de forma que un altre desavantatge és el baix grau de puresa.
Es mostra una centrifugació diferencial, on s’obté un sobrenedant i un pellet. El sobrenedant està format per les partícules més grans de l’homogenat. Molts cops el sobrenedant es torna a homogeneïtzar i centrifugar de nou diversos cops, fins que obtenim el que realment ens interessa.
Inicialment totes les partícules de l’homogenat es troben distribuïdes en el tub de centrífuga i al aplicar una força centrífuga es mouen a través del tub a la seva respectiva velocitat de sedimentació. Al final d’aquesta centrifugació, el pellet i el sobrenedant són separats acuradament - Centrifugació per gradient de densitat: és un procediment més complex que el de la centrifugació diferencial, però ofereix avantatges. Consisteix en un tub on hi ha una solució fluida que té un gradient de densitats al llarg del tub:  Manualment anem posat solucions de densitat ascendent i després afegim la mostra  Podem posar una solució barrejada amb la mostra, després apliquem força centrífuga per tal de generar el gradient dins del tub, tant de la mostra com del solvent.
El resultat és la distribució de les partícules en fraccions de diferents densitats d’un fluid líquid, de forma que es poden separar partícules de mida similar però amb diferents densitats (centrifugació isopícnica), a diferència del mètode anterior.
En la imatge, el gradient s’ha construït de la primera forma explicada, ja que la mostra s’aplica posteriorment en aquest. A la part de dalt del tub trobem les partícules amb una menor densitat, al mig les de densitat intermèdia i sota les de densitat gran.
Un dels avantatges és que, al generar un gradient, en una sola tanda podem separar els components complexes d’una mostra i ens permet fer mesures analítiques. El desavantatge és que és encara més lenta que l’anterior.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili Hi ha dues variants d’aquest mètode: s’usen les dos, tot depèn del medi que es posi 1- Centrifugació zonal: en aquesta, la mostra a analitzar es deposita en la part superior d’un gradient de densitats prèviament format, a causa de la força centrífuga, les partícules es mouen a velocitats que depenen de la mida i sedimenten en diferents zones del gradient. La densitat màxima del gradient no ha d’excedir a la de les partícules a separar  la densitat de les partícules que s’han de separar és superior que la densitat del solvent.
S’ha d’ajustar el temps de centrifugació, ja que si s’excedeix, pot arribar a precipitar tot. No es un bandeig que equilibra la mostra amb la seva densitat, ja que la densitat de les partícules sempre és superior a la del solvent.
2- Centrifugació isopícnica o isodensitat: en aquest cas, la densitat de les partícules que s’han de separar és similar a la densitat del solvent formador del gradient.
La mostra es troba dissolta en una solució isocràtica i s’aplica una força centrífuga, el solut que forma el gradient es distribueix pel tub de la centrífuga i simultàniament també ho fan les diferents partícules de la mostra en funció de la seva densitat  les mostres es van depositant en la posició on s’igualen les densitats, de forma que el resultat és un bandeig de mostres ordenades per la seva densitat. A diferència de la centrifugació zonal, aquí es pot allargar el temps de centrifugació perquè les partícules s’aturen.
http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/centrifugacio_tipus.html http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm .
...