Tema 3: Mètodes d'estudi d'ecologia microbiana (II) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 2º curso
Asignatura Ecologia Microbiana
Año del apunte 2016
Páginas 15
Fecha de subida 09/04/2016
Descargas 9
Subido por

Vista previa del texto

Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll TEMA 3: MÈTODES D'ESTUDI DE L'ECOLOGIA MICROBIANA (II) Aquest tema és un tema on es veuràn els principals mètodes per conèixer la abundància, la diversitat i la seva activitat, les quals són aquelles preguntes que ens formulavèm en l'anterior tema.
Mètodes per determinar la abundància: quantificació de microorganismes – – – Dilucions /sembra placa (colònies): mètode de recompte dependent de cultiu (necessites cultivar els microorganismes) Cambres de recompte (microscopi): mètode independent de cultiu.
Citometria de flux Quan s'estan realitzant estudis de ecologia microbiana no són cultius axènics d'un únic microorganisme, sinò que són cultius o mostres naturals i per tant, determinar l'abundància no és tan sencill. Un cop això, hem de dir que no hi ha un procediment universal, ja que el procés de recompte dependrà del tipus de microorganisme que s'ha de quantificar. Tal com hem pogut veure, trobem dos tipus de tècniques: – Tècniques independents de cultiu → aquelles on s'utilitza el microscopi; recompte directe, qrtPCR, tècniques on es permet quantificar els microorganismes sense haver de cultivar-los.
– Tècniques dependents de cultiu: tècniques on el que es compten són colònies.
 Tècniques independents de cultiu 1) Tècniques de recompte directe: Trobem diferents mètodes de recompte microscòpic, com per exemple: – Diferents cambres de recompte (microorganismes grans com protozous, algues o fongs). Les cambres de recompte són aquells dispositius on s'hi troba marcada una reixeta. A la cambra en si, es col·loca un volum conegut de la mostra, i desde aquesta reixeta es compten. En aquest cas, ja tens la concentració dels microorganismes i el volum que presenta. Aquest tipus de cambres són molt útils per comptar microorganismes més grans, ja que per bacteris és molt més difícil. En aquest cas, nomès són útils per microorganismes que es trobin en una mostra líquida, per tal de poder saber la concentració.
– Si volem comptar fongs, podem utilitzar la pel·lícula d'agar; quan aquest medi està fos (barrejat amb agar) es forma una pel·lícula sobre d'un portaobjectes (barrejat amb els microorganismes que volem comptar, els quals es trobaran en suspensió líquida i tindrem un volum conegut).
Això es tenyeix amb alinina blava (per exemple). Amb aquesta mostra es poden fer recomptes i mesures de la llargada de les hifes amb reixetes que marquen la distància. Permet visualitzar fongs en el microcosopi. Una altre manera de comptar fongs vius/actius és mitjançant el mètode de la pel·lícula d'agar amb diacetat fluoresceína, el qual permet veure fluorescència nomès en aquells fongs actius, degut a la activitat enzimàtica (nomès reaccionarà amb ells). D'aquesta manera podem tenir un percentatge de fongs vius en la mostra que ens poden interesar.
– Un altre tipus són les tincions inespecífiques amb DAPI o taronja d'acridina, les quals serveixen per quantificar el nombre de bacteris totals (tant vives com mostres). Amb el DAPI, les cèl·lues es veuen de color blau, i s'han d'observar amb un microscopi de epifluorescència incidint llum ultraviolada. Ens podem trobar situacions amb agregats (molt comú en mostres naturals).
Aquestes tincions s'uneixen als àcids nucleics, per tant, nomès al material biològic, però donen Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll fluorescència inespecíficament ja que ho tenyeix tot, per tant, aquest material biològic pot provenir tant d'una cèl·lula viva o morta (no et permet diferenciar). Un altre tipus de tinció inespecifíca (que ho tenyeix tot) és el taronja d'acridina, la qual és de color taronja. En aquest cas, s'irrada amb microscopi epifluorescent amb llum verda i s'observen totes les cèl·lules de color taronja o lleugerament verdes. Aquests tipus de fluorescencia s'utilitzen per mostres ambientals, i no donen molt de background (no s'uneix a moltes coses que no siguin les cèl·lules, ja que s'uneixen als àcids nucleics). Una altre tinció inespecífica és el tiocianat de fluoresceína (FITC) i Hoescht 33258 (bisbenzimida). Aquest últim normalment s'utilitza quan el taronja d'acridina no serveix.
– Hi ha un tipus de tinció que ens pot interessar fer que és una tinció de viables, anomenada LIVE/DEAD BacLight. Tenyeix de diferent manera a les cèl·lules vives i a les cèl·lules mortes, per tant, es tracta d'una tinció específica per microorganismes vius i morts. S'utilitzen dos colorants: el primer colorant és verd, el qual entra a totes les cèl·lules, i desprès es tenyeix amb un segon colorant vermell que s'insereix nomès a les cèl·lules mortes (la cèl·lula sempre es queda tenyida per l'últim colorant, per tant les cèl·lules mortes seran de color vermell). Aquest colorant vermell porta iodur de propidi, i entra nomès a les mortes ja que tenen lesionada a la seva paret cel·lular i per això permet l'entrada. Entra per difusió a travès de la membrana, i segons la composició del colorant pot entrar o no. En algun cas, algunes cèl·lules queden tenyides de color taronja i no se sap ben bé que vol dir. Aquesta tinció ofereix molt de background.
Altres tincions que no són inespecífiques i permeten distingir microorganismes actius d'inactius (en aquest cas, molt important pel recompte de microorganismes respiradors), que combinen el DAPI o taronja d'acridina i INT o CTC. Aquests compostos reaccionen amb els transportadors d'electrons de les vies respiratories. Per tant, els respiradors reaccionen amb ells reduint-se, i es forma un compost que s'anomena formalzan i és de color vermell. Per tant, podem comptar aquells microorganismes que siguin respiradors.
Una altre tinció és la incubació amb àcid nalidíxic (DVC, direct viable count), la qual permet veure si les cèl·lules estan actives o no, ja que aquest àcid (agent antimicrobià) quan entra en una cèl·lula impedeix la divisió cel·lular inhibint la síntesi de DNA, i llavors la cèl·lula comença a allargar-se, ja que creixen però no es poden dividir i s'acaben morint. (això ho podem observar al microscopi). Les que s'han allargat són les que estaven vives, per tant, pots diferenciar aquelles que estaven vives i les que ja estaven mortes des d'un principi abans de la tinció. Inhibeix la formació del tabic i, per tant, no es pot separar. Aquesta tinció presenta diferents problemes com per exemple que hi hagi microorganismes que són resistents a aquest àcid i aquest àcid no els afectarà (es comptaran com a morts mentre que realment si que estan vius)i tambè que hi ha cèl·lules que tenen cicles de moltes hores i el temps d'incubació no és suficient com per veure l'allargament que es produeix, per tant, s'ha de tenir en compte el temps de generació de cada microorganisme.
– Una altre manera de poder comptar microorganismes en concret, a nivell d'espècie, és utilitzar anticossos fluorescents (molt utilitzat en l'industria alimentària), els quals et permet donar fluorescència, quantificar i visualitzar en microscopis. Els anticossos són molècules que tenen com a diana molècules de la superfície cel·lular molt específiques, per aquest mateix motiu es tracta d'una tècnica de nivell específic. Hi ha cops que només funcionen amb soques específiques de cada espècie. Es tracta d'una tècnica que és molt més útil en mostres clíniques i d'aliments.
– Una altre manera de recompte és és la proteina fluorescent verda per etiquetar cèl·lules (GFP), la qual serveix per etiquetar una cèl·lula, introduir-la i poder observar el que realitza en quan a Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll interaccions (inclus a una mostra natural). Et permet veure com interacciona aquest i inclús, com es mou. Nomès funciona en condicions aeròbiques, és a dir, quan trobem grans quantitats d'oxigen. Té unes aplicacions bastant limitades, però existeix.
Tots aquests mètodes que hem tractat presenten un seguit de limitacions: – Molts procariotes són molt petits →has de tenir molta experiència per tal de poder distingir una coloració o una altre, ja que pots infraestimar comptatges.
– És díficil diferenciar les cèl·lules vives de les mortes, ja que ens proporcionen coloracions intermitges.
– L'inconvenient més gran és que no saps qui són, és a dir, no es revela la diversitat filogenètica (nomès la tècnica dels anticossos i a nivell d'espècie). Per tant, saps quina abundància hi ha però no saps realment de quin microorganisme es tracta.
Per aquest motiu, ha d'haver algun mètode que permeti revelar aquesta diversitat. Aquesta tècnica ha passat a ser la tècnica estrella en ecologia microbiana en els últims 30 anys de la ciència. Aquesta tècnica és FISH, fluorescent in situ hybriation, una tècnica basada bàsicament en SONDES, les quals presenten a l'extrem un colorant fluorescent.. Aquestes sondes van dirigides al RNA, contra el ribosoma, exactament contra el 16S. Aquesta sonda, per tant, s'unirà per complementarietat de bases a aquest rRNA i, per tant, es troben dirigides a un microorganisme en concret (si el microorganisme a la que està dirigida hi és, hidridarà, però si aquest no hi és, no s'unirà específicament i per tant, no hibridarà i no veurem res). Per què les sondes van dirigides als ribosomes? – El rRNA 16s és una seqüència molt conservada, que presenta difèrencies a nivell de cada espècie, per tant, et permeten distingir-les.
– Tè una raó evolutiva que tambè et permet distingir a un nivell molt gran.
– Els ribosomes es troben en totes les cèl·lules, i a més, en grans quantitats. Això suposa una gran diana per a que la cèl·lula es pugui veure fluorescent.
S'uneix al rRNA, tot i que es podria unir al gen rRNA, pero com de gen nomès hi ha un, no és suficient fluorescencia per poder detectarla. És necessari que hagin moltes molècules d'aquest. Un cop tens les cèl·lules hibridades, el que fas és realitzar la detecció mitjançant el microscopi d'eplifluorescència. Una sonda és una seqüencia d'oligonucleòtids de 20-30 units a un fluorocrom. Les bases de dades estan plenes de seqüencies del rRNA 16S, llavors es més facil dissenyar-les a partir de programes d'ordinador.
Un protocol de FISH consta de diversos pasos: 1) Fixació amb formaldehid → matar i fixar tota la comunitat in situ, ja que vols veure el que hi ha realment en aquell moment, no el que ha crescut posteriorment. Aquesta mostra fixada es pot mantenir fins a 6 hores, conservant a uns -20ºC.
2) Permeabilització de la mostra → lesionar la paret i la membrana mitjançant diferents productes, per a que la sonda pugui penetrar millor, com amb lisozim o la proteïnasa K (opcional, però millor fer-la).
3) Hibridació → introducció de la sonda, s'uneix si hi ha complementarietat (si hi és el microorganisme amb el qual és complementari).
Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll 4) Rentat →eliminació del excès de la sonda amb un tampò de rentat i altres passos.
5) Detecció de la fluorescencia →mitjançant un microscopi de epifluorescència o citometria de flux.
A més d'hibridar, la mateixa mostra la pots tenyir amb DAPI per tal de tenir en compte el nombre de cèl·lules totals. Desprès, en el mateix camp, incidiras llum ultraviolada per revelar el fluorocrom que presenta la sonda, i per tant, respecte el total de cèl·lules que has pogut observar gràcies a la tinció de DAPI, podràs observar totes aquelles cèl·lules on ha hibridat la sonda específica, per tant podem saber el percentatge de cèl·lules hibridades respecte el total (percentatge d'aquest microorganisme en la mostra sencera). Depenent de la part del rRNA 16S on vagi dirigida podem elegir els tipus. Com a conclusió, FISH serveix per quantificar i detectar la presència d'un microorganisme concret, inclús poder observar els consorcis d'agregats, ja que pots agregar diferents sondes de diferents colors i observar la distribució de tots aquests.
Tenim sondes ja dissenyades a nivell de fílum, a nivell de domini o inclús per classe, per tant, a tots nivells. Si no està dissenyada, la pots dissenyar tu gràcies a que trobem moltes bases de dades on pots trobar el disseny d'aquestes. Trobem que la majoria ja es troben dissenyades per programes informàtics. Com més bona sigui la base de dades, més bona serà la sonda i per tant, més específica.
A vegades ens trobem en situacions on les mostres naturals obtingudes presenta un seguit de cèl·lules que són poc actives, i per tant, que presenten pocs ribosomes. En aquest cas, seràn dificils de detectar a travès de FISH o analitzar ja que la seva fluorescència no serà molt forta o directament no hi haurà fluorescència. Això és molt típic en ambients oligotròfics, degut a la poca matèria orgànica que trobem.
Per solucionar aquest especte, el que podem fer és donar més brillantor al microscopi o podem utilitzar més d'una sonda utilitzada per al mateix microorganisme, però el que realment és ideal seria la variant de CARD-FISH, la qual és una variant de FISH per aquelles mostres on les cèl·lules no es troben gaire actives; s'encarrega de amplificar de manera enzimàtica aquesta poca senyal que presenten (nombre petit de ribosomes, degut a que presenta una sensibilitat molt més gran).
La sonda en aquest cas no està unida a un colorant fluorescemt, sinò que es troba unit a un enzim HRP (enzim que reacciona amb compostos fenòlics) unit a una peroxidasa. La HRP és molt gran i entra amb la sonda, per tant, és important permeabilitzar bé la mostra. Desprès afegim la tiramida, que reacciona amb la HRP (la hidrolitza, reaccio enzimàtica), i forma uns compostos que s'uneixen a les proteïnes del voltant, concretament a residus de tirosina de cada ribosoma (amplificació del senyal). Per tant, a partir d'una única molècula es formen molts compostos secundaris i moltes senyals secundàries, de forma que aquí amb unes 60 unions ja tenim senyal per veure en el microscopi (en el FISH normal es necessiten unes 1400 unions per a que es vegi fluorescència). És important el rentat per a que no sobri tiramida i es tingui en compte tiramida no hidrolitzada. Això és una amplificació de senyal, ja que la taxa de senyal és molt més gran, tal com podem veure als diferents gràfics → els recomptes incrementen notablement amb la tècnica de CARDFISH (en ambient marins és molt millor fer aquest).
El recompte de microorganismes al microscopi es pot fer en programes d'ordinador que fan fotografies i et conten les cèl·lules fluorescents o marcades (anàlisis d'imatges). Aquest anàlisis és molt més ràpid, ja que està automitzat. El problema està en que l'anàlisis serà bona si la imatge és bona, per tant, és important tenir un sistema o màquina bona. En la fotografia les cèl·lules tenyides han d'estar diferenciades del fons, ja que si tenim molt de background (colorant unit a no cèl·lules) el recompte no és fiable. Els recomptes manuals i els fets automatitzats, són similars, però un programa compta moltes més cèl·lules.
En comptes de microscopi òptic de fluorescència, tambè podem fer servir un microscopi electrònic (en la qual tenim de transmissió o la d'escombratge) en aquest cas d'escombratge, on es veu la superfície i permet obtenir el recompte d'aquestes cèl·lules. Un problema d'aquest tipus de microscopia és que Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll podem trobar artefactes que no siguin cèl·lules i les mostres han d'estar no molt diluïdes.
Hi han aparells que tambè compten cèl·lules, com per exemple, el comptader de Coulter, el qual és un aparell que compte cèl·lules per franges de tamany. Presenta diferents marges de tamanys per tal de comptar tots els microorganismes, i per tant, poder distingir entre protozous, bacteris o bacteris una mica més grans. Presenta l'inconvenient de que pot comptar coses que no siguin cèl·lules, i tambè els agregats de diferents cèl·lules, els quals els comptarà com una cèl·lula molt gran.
El citòmetre de flux tambè s'utilitza; és un aparell que s'utilitza bastant en ecologia microbiana que et permet separar les cèl·lules tant per tamanys com per intensitat de fluorescència (aquelles que han hibridat). Les cèl·lules es fan passar per un fluid i aquest fluid es passa per un orifici; variant el tamany del orifici, les pots classificar ja que van passant d'una en una i quantificar-les alhora. Desprès trobem un detector que detecta la mesura de la fluorescència d'aquella cèl·lula, classificant alhora la grandària.
Finalment, dintre del aspecte de mesurar l'abundància, tambè tenim algun mètode molecular per determinar la quantitat de cèl·lules, com la PCR quantitativa en temps real. No es tracta de un microscopi, però ens permet mesurar quantes cópies d'un gen en concret hi ha, i aixì saber el nombre de microorganismes en aquella mostra ambiental, ja que ho pots relacionar. Es tracta de l'única tècnica indepent de cultiu que no és de recompte directe. Per exemple, s'han realitzar diferents estudis amb Legionella, el qual és un bacteri que interessa detectar; es detectaven la presencia d'un gen que es troba en ella, i per tant, com hi havia una copia per bacteri, ho relacionaven amb el nombre de microorganismes.
 Tècniques dependents de cultiu Dintre de les tècniques per tal de determinar l'abundància, tambè trobem les tècniques dependents de cultiu, com per exemple el recompte en placa i el mètode del nombre més probable. Es tracta de tècniques molt importants les quals són complementàries, ja que no es poden substituir.
1) Recompte directe en placa En placa utilitzem podem utilitzar molts tipus de medis de cultiu (medis més rics, medis més selectius, medis diferencials → permet el creixement de microorganismes diferents, els quals permet diferenciar uns d'altres com per exemple per coloració). Aquests medis presenten concentracions de medis molt altes, les quals poden ser tòxiques per alguns d'ells. Per tant, consisteixen en tècniques les quals són selectives, degut a aquests medis de cultiu selectius. Per tal d'obtenir colònies en placa, sembrem a la superfície amb la nansa de Digralski, però tambè trobem un mètode on la mostra es barrejada amb l'agar fos amb la mostra de microorganismes, i quan es solidifica, els microorganismes poden creixer per tot l'agar.
Quan volem quantificar microorganismes en placa, hem de tenir en compte un seguit de aspectes, com la composició del medi, les condicions d'incubació i el temps d'incubació (a vegades hem de deixar temps molts més grans si son mostres naturals, perque els temps de replicació són molt més grans, entre 2 – 3 dies).
Si per exemple volem obtenir un cultiu d'heteròtrofs no fixadors de nitrogen, el medi ha de tenir font de carboni, fosfor, nitrogen, cations/anions i factors de creixement. Aquest són els més habituals. En canvi, per tal d'obtenir un cultiu d'anaerobis, s'han de fer en condicions específiques com per exemple en tubs de dilució en agar, on no entri cap mena d'oxigen. En aquest agar, no es pot solidificar. En aquest cas, el que és fa és un banc de dilucions, on l'agar fos (on afegim els microorganismes) es deixa solificar i s'afegeix un tap de parafina, la qual és líquida a una temperatura molt elevada. Aquesta, però, es solidifica a temperatura ambient, fent de tap per a que no entri l'oxigen. Al cap d'uns dies, podrem Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll observar colònies, però presenten un creixement molt lent. Igual que en una placa d'agar, considerem de 15 a 300 colònies per un bon recompte, i es compte igual que en placa.
Per tant podem veure que els bacteris són els que es fan créixer en placa (tambè els llevats), però per exemple, pels fongs i els protozous, la tècnica del creixement en placa no és molt eficient.
Trobem diferents tipus de medi: – Medis selectius: són aquells medis que nomès permet veure el creixement d'un grup de microorganismes en concret degut a unes condicions selectives que serveixen per aquell grup concret.
– Medis diferencials: et permeten diferenciar diferents grups (segons diferents condicions) dintre de tots aquells que creixen.
Com a diferents exemples d'aquests medis, trobem el medi Manitol-Salt, el qual és un medi hipersalí que és selectiu (conté sals en grans concentracions, les quals nomès permeten el creixement a microorganismes halófils) i diferencial (els microorganismes que creixen i usen el manitol es tornen de color groc). Un altre medi seria el medi McConkey, el qual és un medi selectiu (enterobacteris, gràcies a les sals biliars per presenten) i diferencial (degut a la lactosa, que permet veure qui metabolitza la lactosa dintre dels microorganismes que han crescut; aquells microorganismes que l'utilitzen les colònies canvien a color rosa. El EMB és un medi que et permet veure aquesta diferència, però provoca que les colònies que utilitzen la lactosa es veuen de verd metàlic.
Els llevats tambè es poden fer crèixer en placa i promoure el seu creixement exclusiu en presència de bacteris, mitjançant diferents antibiòtics o disminuint el pH, ja que toleren molt millor el pH àcid que els bacteris.
2) Tècnica del nombre més probable (NMP): Es tracta d'una tècnica que tambè et permet fer un recompte, però s'ha de fer un banc de dilucions fins la extinció (en l'últim tub hi ha molt poques, pràcticament res). Es tracta d'un mètode estadístic que per probabilitats pots saber el nombre de viables que tens. Es pot utilizar per qualsevol tipus de medi.
En quan al seu procediment, s'agafen els 3 últims tubs i es sembren diferensts repliques (5 tubs de cada un, pero es pot fer entre 3 i 10). Es posa a incubar el temps que calgui i es mira quins tubs presenten terbolesa (per tant, creixement). Es deixa incubar el temps que calgui, i els que han crescut es veuen en imatge foscos, doncs a partir d'aquests s'obtè un triplet de nombres. Amb aquest triplet, es va a una taula del nombre més probable. Dintre d'aquesta trobes la combinació corresponent, i obtens el nombre de microorganisme del tub més concentrat dels tres últims tubs, en cèl·lules/mL. No és tant precis com el recompte en placa, ja que només obtens un nombre estadístic. Ara hem de multiplicar el nombre que ens dóna, per la dilució que hem utilitzat per saber la mostra real.
No només serveix per bacteris, sino també en protozous. Els protozous s'alimenten de bacteris, així que el nombre és probable es fa en placa, on s'incula un confluent de bacteris i es posen a sobre una sèrie de pouets de propilè, on hi col·loques diferents dilucions dels protozous. Es fa un creixement en gespa (que creixi forman una capa els bacteris). Llavors vas mirant a quin pou hi ha hagut o no lisi (deteriorament de bacteris, ja que els protozous, si hi són, se'ls hauràn menjat en cada tub). Llavors tindrem un punt on ja no sels menjaran i llavors hi ha metodes estadístics per arribar al final. Pels virus entèrics tambè es pot fer el nombre més probable, s'inocula un cert volum en tubs on hi hagi un hoste i també ens fixarem en la lisi per treure conclusions. En aquest cas, hi haurà virus quan el tub no estigui tant tèrbol, la qual cosa indicarà que hi ha presència de virus que hauràn fet lisis dels bacteris.
Determinació de la biomassa microbiana Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll És una manera indirecta de determinar l’abundància. La biomassa és la massa que hi ha de matèria viva, i s’expressa en unitats de massa (g) o d’energia (cal o J). Representa l’energia emmagatzemada per un segment particular de la comunitat ecològica. En mostres ambientals tenim més complexitat, perquè no només hi ha microorganismes, pot haver partícules que no ho són. Contra més biomassa, més microorganismes a partir d'un paràmetre. Els mètodes per cultius purs no valen per mostres ambientals.
Els mètodes per determinar la biomassa en mostres ambientals els dividim en 2 grans grups, els assajos bioquímics i els mètodes fisiològics (on es mesura l'activitat respiratòria).
Assajos bioquímics: Ens els assajos bioquímics mesurem ATP i nucleòtids adenilats totals, components de la paret cel·lular, clorofil·la i altres pigments fotosintètics, DNA, proteïna, lípids... És a dir, diferents components que es podran correlacionar amb el nombre de microorganismes.
1.
Mesura d’ATP Com més ATP hi hagi a la mostra més microorganismes hi haurà. Per mesurar la quantitat d’ATP d’una mostra podem utilitzar: 1.
La prova de la luciferina-luciferasa, que com a reactius utilitza la luciferina, l’oxigen i l’ATP, i s’obté AMP, CO2 i una quantitat de llum proporcional a la quantitat de ATP inicial. Aquesta llum serà la que mesurarem, ja que és equivalent a l'ATP que hi havia inicialment. L'enzim que permet aquesta reacció és la luciferasa, per aquest mateix motiu podem mesurar la llum produïda. Aquesta mesura de l'ATP depèn molt de l'estat fisiològic dels microorganismes, i per això et permet quantificar-los.
Per aquest mateix motiu té un incovenient, el qual cada microorganisme és diferent i depèn de les condicions.
2. La cromatografia líquida d’alta pressió (HPLC), que consisteix en fer una extracció amb solvents orgànics o tampons en calent. S’ha de fer ràpidament per evitar que l’ATP passi a AMP. Les quantitat d’ATP després s’han de convertir en º de microorganismes, s’ha de relacionar la concentració d’ATP amb la de C cel·lular i després amb el nº microorganismes. El problema es que per un mateix microorganisme la concentració d’ATP pot variar en funció de l’estat fisiològic de la cèl·lula. Lo ideal seria que estigués distribuït homogèniament o proporcionalment en tots els organismes de la mostra, i que a més nomes estigues present en l’organisme que ens interessa. Normalment, el compost es troba també en altres organismes que no volem mesurar, ja que s’adsorbeix en la superfície de les partícules. Aquest mètode presenta diversos inconvenients, ja que per una banda, l'ATP es pot absorbir a la superfície de les partícules, fent que dificulta l'extracció sobretot al voler extreure mostres del sòl. Per altre, s'ha de vigilar i tenir en compte l'ambient, on estàs calculant les concentracions d'ATP de bacteris i no d'altres organismes, per tant, que no hi ha d'haver restes d'altres organismes.
Per calcular la biomassa a partir de la mesura d’ATP apliquem un factor de 250 a 286 en mostres aquàtiques i de 120 en sòls per conversió a C cel·lular.
2) Nucleòtids adenilats totals És una forma més correcta que la de mesurar l’ATP, ja que podem evitar aquest inconvenient de diferent estat fisiològic de les cèl·lules. Mesurem la suma d’ATP, ADP i AMP totals, que no varien amb l’activitat metabòlica (avantatge). Permet calcular la càrrega energètica (EC = (ATP + 1/2ADP) / (ATP + ADP + AMP), la qual ens proporciona una idea sobre l'activitat metabòlica d'aquell microorganisme), i el recompte de microorganismes i de la biomassa. La càrrega energètica depèn de la concentració Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll d’aquest compostos, quan més alta, més activa està la població. Un creixement actiu té una càrrega energètica entre 0.8-0.95, un en fase estacionària de 0.6, i un amb cèl·lules en estat latent menor de 0.5.
3) Components de la paret cel·lular Serveix per mesurar la concentració de bacteris, però hi ha bacteris que no tenen paret (els micoplasmes). Consisteix o inclou diferents proves, ja que podem mesurar diferents components de la paret: – Prova del àcid muràmic: a travès d'una reacció química, es basa en mesurar el lactat alliberart, el qual és produït a partir del muràmic, i que, per tant, serà proporcional al que hi havia inicialment.
Aquest àcid muràmic es relaciona directament amb els components de la paret cel·lular. A partir de les concentracions del lactat, podem arribar a determinar si es tracta de grams + o gram – que tenim, però per calcular-ho, es fa a partir de factors de conversió (Gram positius: 44 μg MA/mgC, mentres que en gramnegatius 12 μg MA/mgC) , ja que són un promig. La mureïna es troba en més abundància en els gram+. És necessari calcular la proporció de bacteris gram negatius i gram positius.
– Mesura de la concenctració de LPS: aquest es troba nomès en la capa externa de la paret dels gram -, per tant, si arribem a saber la concentració sabrem nomès la biomassa d'aquests en concret. S’utilitza l’extracte de Limulus polyphemus, s’extreu sang de l’animal i a partir de la sang es fabrica un extracte que reacciona amb LPS dels gram – i es forma una solució tèrbola.
Com més tèrbola sigui, més LPS hi havi, i per tant més gram -. És un mètode molt sensible., que reacciona específicament amb el LPS i que pot arribar a mesurar fins a 10 cèl·lules/mL.
– Mesura de quitina: per tal de determinar la biomassa dels fongs, es pot mesurar la concentració de quitina. Hi pot haver un problema, que serà la interferència de diferents microartròpodes, que tambè tenen quitina.
4) Clorofil·la i altres pigments fotosintètics Tal com imaginem, es tracta de la mesura de la concentració de pigments, el qual està correlacionada amb la biomassa dels microorganismes fotosintètics. El primer que s’ha de fer és un extracte amb un solvent orgànic (etanol o acetona) per extraure els pigments, i d’aquí es pot realitzar un espectre s'absorbància que mostren diferents pics que corresponen als diferents pigments. Si coneixem els màxims d’absorbància de cada pigment, podrem veure l’absorbància que tenen els extractes en aquests màxims i determinar a partir d’aquí les concentracions de diferents pigments en la mostra.
La clorofil·la, per exemple, té un màxim a 430 i un a 680, la bacterioclorofil·la a té màxims a 360, 805 i 870. Com més pigments trobem a la mostra, més organismes fotosintètics tenim. Els pigments es poden analitzar també per espectrofluorometria, que mesura la fluorescència que emet el pigment. És una mesura més precisa. L'únic problema que presenta és que també depèn d el'estat fisiològic dels microorganismes, ja que quan estan limitats per la llum sintetitzen més pigments. Es tracta d'una mesura molt sensible, que s'utilitza molt en mostres aquàtiques marines.
5) Determinació de DNA Consisteix a determinar la concentració de DNA, i a partir d’aquí, la concentració de biomassa. Ens hem d’assegurar que només tenim el grup d’interés. Normalment el que és fa es veure quina es la seva correspondència amb altres metodologies, com per exemple, el recompte amb microscopi. Cal que el DNA de microorganismes es trobi molt ben purificat.
6) Determinació de proteïnes Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll Es tracta d'una metodologia que no es pot aplicar sempre, ja que és necessari que tota la mostra sigui exclusivament de bacteris, ja que sinó és mlt fàcil mesurar proteïnes d'altres restes orgàniques. També, pot ser que microorganismes diferents continguin diferents concentracions de proteïnes, ja que tambè depèn de l'estat fisiològic i de cada microorganisme. Per tant, és una aplicació limitada en mostres ambientals ja que es pot utilitzar sempre i quan el nivell de proteïnes no microbianes sigui despreciable.
És un mètode que va bé per cultius axènics.
7) Anàlisi de lípids Es pot mesurar la concentració d’ergosterol, que és un biomarcador de fongs i és el més utilitzat pels anàlisis de lípids. També pot fer-se un anàlisi de fosfolípids, que ens dóna una idea de la concentració de microorganismes que hi ha.
Mètodes fisiològics 1.
Activitat respiratòria Com més activitat, més microorganismes, per tant, tambè et permet determinar la biomassa. Un dels mètodes per mesurar l’activitat respiratòria és la fumigació del sòl amb cloroform, que serveix per analitzar l’activitat d’un sòl. Consisteix a fumigar la mostra de sòl amb cloroform i matar així els microorganismes (és molt tòxic). Després es reinocula una mostra de sòl a sobre i els microorganismes nous mineralitzaran els que estaven morts mitjançant un proés de descomposició i mineralització del sòl, llavors, es mesura la quantitat de CO 2 produïda i alliberada, A partir de la quantitat de CO 2 produït, apliquem una fórmula per obtenir la biomassa de C (la quantitat de CO2 alliberat és proporcional al nombre de microorganismes que hi havia en aquell sól). Com més microorganismes hi havia, més CO 2 s’haurà produït. En aquest cas, s'ha de tenir també un control negatiu amb un sól no fumigat.
Normalment, la quantificació de la biomassa de C, se sol comparar amb altres mesures de biomassa, com per exemple la realitzada sobre la quantitat d’ATP.
Biomassa C= ( FC – Ufc) / KC, On tenim que FC és el CO2 produït pel sól fumigat, Ufc és el CO2 produit pel sòl no fumigat i KC, és una constant, la qual es troba entre 0,4-0,5.
 Mesura de l’activitat respiratòria després d’afegir un substrat Com per exemple glucosa marcada. Es mira la concentració de CO 2 marcat que es genera, que anirà relacionat amb la concentració de microorganismes que hi ha.
Anàlisis de la diversitat microbiana(que n'hi ha?) Per analitzar aquesta diversitat trobem dos focus principals, dos grans grups de mètodes per mesurar la diversitat.
– Tècniques depenents de cultiu: mètode clàssic en el qual es sembren plaques que s'enriqueixen i es poden aïllar els microorganismes, fer assajos bioqúimics per determinar els microorganismes.
– Tècniques independents de cultiu: tècniques més actuals, basades en tècniques moleculars, amb les quals no tens el microorganisme en sí, sinó que tens el seu DNA. Han permès avançar molt en l'anàlisis de la diversitat.
Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll Tècniques dependents de cultiu Passen per l’aïllament, són les tècniques clàssiques, les úniques utilitzades fins als 70. Abans d’aïllar, hem d’enriquir la mostra. Beijerinck va ser el primer en aplicar cultius d’enriquiment. Els cultius d’enriquiment tenen condicions selectives que augmenten la concentració dels microorganismes que interessen i condicions contraselectives pels microorganismes que no volem. Per exemple, si volem cianobacteris, incubarem amb aire, a la llum i posarem N i nitrats; mentre que si volem quimiolitòtrofs, posarem la mostra a les fosques.
Amb el cultiu d’enriquiment que va fer Beijerinck, volia enriquir la mostra d’Acetobacter, un fixador de N de l’aire. Al cultiu va posar nutrients, però cap font de N, de manera que ja es descartaven tots aquells no fixadors de N i tots els anaerobis (estava en condicions aeròbies). Va posar en un medi mineral. Els heteròtrofs no podien créixer perquè no tenien font de N. Si aquesta mateixa mostra la fem créixer en un medi amb font de N, creixeran microorganismes que no seran Acetobacter. A part dels nutrients que afegim al cultiu, també són importants les condicions a que el sotmetem; la temperatura, la llum, el pH, l’oxigen, etc. Cal tenir en compte molts altres requeriments del microorganisme, com acceptors d'electrons i la font de poder reductor. Per tant, és important si vols aïllar un grup determinat, ja que has de donar-li tot allò que necessita.
L’enriquiment ens pot sortir positiu o negatiu. Un enriquiment positiu vol dir que teníem inicialment el microorganisme a la mostra i que l’hem fet créixer en l'hàbitat d'estudi. Llavors, podem aïllar-lo sembrant-lo en placa o fent tubs de dilució amb agar, o fen NMP. Un enriquiment negatiu significa que no hem enriquit el microorganisme, i pot ser perquè no hi era inicialment o perquè no hem aplicat les condicions adequades perquè creixés. Per tant, el microorganisme no es troba en l'hàbitat d'estudi.
La columna de Winogradsky és un petit ecosistema que permet enriquir diferents microorganismes. És un tub de vidre, i al fons es posa un sediment del lloc que volem reproduir de forma artificial.
Winograsdky va ser el pare de la microbiologia del sòl, i va ser el que va dur aquesta tècnica al laboratori, un cultiu d'enriquiment que ell va utilitzar per enriquir el creixement de bacteris fotosintètics.
Ens interessa crear un sediment compacte i anaerobi, per tant, el podem barrejar amb compostos inorgànics, com pot ser el sulfat càlcic, no amb compostos fermentables. A sobre del sediment posem aigua, de forma que tenim un gradient de paràmetres fisico-quimics, i deixem incubar uns mesos. Al sediment anaerobi, creixeran bacteris anaerobis, com reductors de sulfat que utilitzaran el càlcic i generaran sulfhídric. Aquest sulfhídric l’utilitzaran els bacteris verds i vermells del S. El gradient de sulfhídric disminueix a mesura que ens apropem a la superfície. A dalt de tot creixeran els aerobis fotosintètics, com cianobacteris i algues. Al llarg de tota la columna tenim heteròtrofs i quimiolitòtrofs que necessiten S i oxigen, però en el lloc on rebin oxigen i sulfhídric alhora. Als vidres es generen biofilms, i altres queden en suspensió a l’aigua. El gradient de diferents poblacions de bacteris en l’aigua, dóna diferents coloracions a la columna. Amb aquesta columna, tenim en miniatura el que succeeix al llac. A partir d’aquí podem aïllar microorganismes. També podem sotmetre la columna a un compost tòxic, per veure si la comunitat és capaç de degradar-lo.
Els desavantatges d’un cultiu d’enriquiment és que es produeix un biaix que pot ser molt greu; que dominin els organismes que creixen més ràpidament i que normalment no són els més abundants.
També passa que surten resultats molt diferents en un cultiu si diluïm o no diluïm, ja que una pràctica usual és la dilució del inòcul, fent que els que estan en més baix nombre són els que creixen, ja que al principi de tots treus els que estan en baixa proporció per a que nomès creixin els altres i no els que creixen més ràpid.
Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll  Aïllament selectiu de cèl·lules individuals Són eines que separen físicament un microoganisme de la resta. Tenim dos mètodes: 1.
Pinces làser: es necessita un microscopi invertit i un focus de rajos làser. Amb aquest mètode s’agafa una sola cèl·lula i es separa de la resta (gràcies als rajos làser). Aquesta cèl·lula es pot separar gràcies a un tub capil·lar que aplica unes forces. Un cop separada, trenquem el capil·lar i la cèl·lula la podem posar en un cultiu de medi adequat.
2. Citometria de flux combinada amb cell sorting: El citòmetre de flux ens permet separar les cèl·lules per grandària i després classificar-les. A més, mesura les propietats de fluorescència dels microorganismes, o si un grup ha estat hibridat per FISH també. El citòmetre pot tenir la funció de cell sorting, que fa passar la barreja de microorganismes per un orifici d’una en una i els hi aplica una vibració. Amb aquesta vibració, les cèl·lules queden separades en gotes, cada gota conté una única cèl·lula. Les gotes es poden dipositar en microplaques, on a cada pou hi ha una sola cèl·lula amb un medi de cultiu. Va molt bé per aquells microorganismes que estan en molt poca concentració i que no els pots enriquir.
Tècniques independents de cultiu Han revolucionat la metodologia microbiana des dels anys 80. Sabem s’han descrit 15974 espècies de procariotes fins ara (aquesta seria una dada del 2014, tot i que cada any es van aïllant nous microorganismes). Aquestes dades venen de cultius purs, els resultats dels quals ens porta al dipòsit de soques, a partir del qual es publica com a nova espècie en cas que sigui acceptada per la comissió encarregada.
La diversitat que no coneixem és la diferència entre la coneguda (10 4) i la total estimada (106-109 taxons).
Per tant, hem aïllat com a molt un 1% del que hi ha de la diversitat total estimada, així que, els mètodes d’aïllament no són suficients. Les tècniques de cultiu s'estan quedant curtes per reconèixer aquelles espècies que encara no es coneixen D’una mostra d’aigua marina, només poden aïllar entre un 0.0010.1%, i en una de fang com a molt el 15% → el que s’obté en placa és molt diferent del que hi ha realment.
A la majoria de les mostres ambientals no sabem que hi ha i no podem cultivar-lo. Epulospicium fishelsoni, té una mida de 600 micres (és un dels microorganismes més grans que es coneix), però no s’ha aconseguit aïllar perquè, a més, és un simbiont. Els endosimbionts de Pelomyca palustres tampoc s’han aconseguit aïllar, i els bacteris del lumen i Achromatium oxaliferum tampoc, ja que no es troba el medi adequat per aïllar-los.
Totes aquestes dades es saben gràcies a les diferents tècniques moleculars, en les quals no aïllem, però podem identificar microorganismes sense necessitat de cultivar-los, podem aconseguir les seqüències de molts més que quan els cultivem. El nombre de filum del domini Bacteria descrits han augmentat des del 1997 (que hi havia 12), fins el 2007 (que hi ha 100), però només una petita part estan cultivats, l’altre part s’ha deduït per la seqüencia. En Archaea inicialment hi havia 2 filum i en 2007 hi havia 5 filum.
La majoria de tècniques independents de cultiu es basen en l’rRNA 16S (marcador filogenètic). Les dividim en mètodes dependents de PCR (les quals serien la seqüenciació de genoteques i les NGS, les quals són les més noves i barates i amb una resolució major, on tambè s'inclouen les tècniques de fingerprinting) i mètodes no dependents de PCR (on trobem la FISH i totes les seves variants, la reassoaciació de DNA i la metagenòmica). El problema més gran quan amplifiquem per PCR, és que se’ns poden generar proporcions diferents de microorganismes que en un principi eren igual d’abundants.
Ecologia Microbiana TEMA 3  Ariadna López Coll Mètodes dependents de PCR Es basen en l’extracció de DNA i la posterior amplificació del gen rRNA 16S. El primer que cal es una extracció de DNA. Tots els mètodes tenen en comú que, a partir de la mostra, el que es vol és aconseguir el DNA purificat (sense lípids, proteïnes, ni RNA). Quan extraiem el DNA pretenem: – Una eficiència de recuperació alta, no esbiaxiada i representativa de la comunitat, ja que avegades no s'obtè tota la quantitat de DNA de la mostra, ja que o bé no es tren o altres es trenquen massa.
– Fragments suficientment prou grans per poder aplicar diferents metologies.
– RNA i DNA de suficient puresa per poder-los diferir amb enzims, amplificar per PCR, hibridar...
– El protocol a seguir ha de ser ràpid, simple i barat, i el protocol d'extracció i purificació ha de ser robust i fiable.
Els problemes en l’extracció del DNA poden ser que la lisi cel·lular sigui incompleta, que extraiem inhibidors que inhibeixen la taq de la PCR, per exemple, o que a vegades el DNA es degradi o es danyi i no el podem amplificar.
Utilitzem el rRNA ribosòmic 16S perquè es troba en tots els organismes vius, perquè la seqüència ens ofereix informació per descriure la diversitat, és a dir, es tracta de excelents descriptros de la història evolutiva d'un organisme (si tenim la seqüència podem identificar l’organisme), perquè no hi ha transferència horitzontal de gens, i les bases de dades cada vegada tenen més seqüències d’aquest gen.
El desavantatge principla que presenten els mètodes depenents de PCR és que a les seqüències s'han d'amplificar, és a dir, han de seguir un procès exponencial, de manera que unes seqüències poden replicar-se més que d'altres, de manera que la proporció i la importància d'aquella seqüencia no és la que realment hi havia originalment. Aquest efecte s'anomena biaix, i significa que s'amplifiquin més del compte determinades seqüencies.
Veurem tres metodologia: clonació i obtenció de genoteques, mètodes de fingerprint, i piroseqüènciació i illúmina. El fingerprint cada cop s’utilitza menys a favor de la piroseqüènciació i illúmina.
a.
Clonació i seqüenciació de genoteques.
Partim d’una mostra ambiental amb diferents microorganismes, de manera que les seqüencies de cada microorganisme pot amplificar-se més d'una vegada. Extraiem el DNA dels diferents microorganismes, i amplifiquem per PCR de manera que obtenim moltes copies (amplicons) de cada un (uns s’amplifiquen més que altres tot i estar en la mateixa concentració inicial). La barreja de la PCR no es pot enviar a seqüenciar perquè esta tot barrejar, ja que s'han de separar les diferents seqüències. Per enviar a seqüenciar, cal que només hi hagi un tipus d’amplicó. Per separar els amplicons utilitzem la clonació. Per clonar, el primer és lligar cada amplicó amb un plasmidi (un únic fragment de DNA per cada plasmidi).
Cada plasmidi amb amplicó el transformem en E. coli, i cada E. coli serà transformat amb només un plasmidi amb un únic producte de PCR --> el plasmidi es pot unir per diferents llocs, i els productes de PCR s'insereixen. La probabilitat de que no es transformi un E. coli no és molt alta, i de que es transformi més d’un plasmidi per E coli és molt baixa. Cadascun dels bacteris, quan es divideixin, passaran una còpia del plasmidi a la nova cèl·lula filla. Fem sembra en placa i tindrem colònies d’E. coli que contindran el plasmidi. Cada colònia que tenim es correspon a un clon. Un cop fem créixer la colònia, la podem enviar Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll a seqüenciar.
La seqüenciació la fa un seqüenciador, envies a una empresa el que vols seqüenciar i t’envien un arxiu amb una llista de les teves seqüències. Compares les seqüències amb una base de dades, el BLAST. El BLAST el mostra un llistat de les seqüències que més s’assemblen a la teva. Pot ser que la teva seqüencia s’assembli a un microorganisme no aïllat. Una bibloteca de clons, obtenim aquests resultats,; els percentatges que obtenim no estan en la mateixa proporció que a la mostra original, perquè sempre que fem PCR pot haver una descompensació dels resultats, si que podem estar segurs de que estàn a la mostra inicial, però no tenen perquè estar en aquesta proporció, ja que la PCR haurà variat els percentatges. Per tant, podem dir que un % dels clons eren tal, però no podem dir que un % de la mostra original era aquell microorganisme en sí.
En quan a l'anàlisis de seqüencies, et fabriquen una matriu de distàncies i a partir d'aquí, es generen arbres filogenètics, on els microorganismes s'grupen en clústers, i els que estan en un mateix grup vol dir que s'assemblen més. La distància està relacionada amb la seqüencia del 16S.
b. Mètodes de fingerprint: Fingerprint vol dir d'emprenta digital. Són mètodes a partir dels quals obtenim un patró característic de la comunitat; de bandes, de pics, etc... Hi trobem dos mètodes principals: - DGGE: electroforesis en gel de gradient lineal desnaturalitzant. En aquest tipus d'electroforesis, es fabrica un gel desnaturalitzant, no un gel uniforme, si no que té un gradient amb urea i formamida on a la part inferior, les condicions del cel son més desnaturalitzants. Gel de poliacrilamida.
Primerament, extreiem el DNA i fem una PCR. Carreguem el producte de PCR a cada carril. Aquest gel et permet separar les diferents seqüencies, no per mida sinò per seqüencia de nucleòtids (cosa que amb un gel de agarosa no podries). Es carrega un producte, apliques un corrent i el DNA baixa.
Tens una cadena doble del DNA (varies corresponents a diferents microrganismes) i a mesura qua van baixant pel gel es van trobant un gradient desnaturalitzant, així quan una cadena doble es desplega totalment, deixa de tenir mobilitat electròforetica. Contra més guaninas i citocines tinguin, més costarà que es desnaturalitzin, per tant, més abaix arribaran. Com podem veure, la mobilitat electròforetica depen del % de G i C. Cada microorganisme s'atura en una posició diferent. Cada banda correspondrà a una espècie diferent.
No és un gel regular, les condicions van de menys a més desnaturalització. Quan el DNA s'obre totalment, s'atura. Per evitar que s'obri totalment la doble cadena del DNA, a l'hora de amplificar s'afegeix una cua de guaninas i citocines. Aquesta cua es coamplificada juntament amb el 16S, i evita que la molècula no s'obre totalment, ja que provocaria que la molècula s'escapès del gel. Consisteix en un buffer on es col·loca el gel de manera vertical en mig de dos vidres (1 mm de gruix). Contra més intensa és una banda, més elevada és la seva quantitat, pee tant, tambè et permet analitzar els percentats d'intensitat de cada banda i saber els percentatges d'abundància de cada microorganisme. Gràcies a aquesta tècnica, es poden analitzar mostres en un cicle anual, per tal de poder comparar els mesos entre si i veure la evolució de determinats microorganismes. El que pots fer és retallar cada una d'aquestes bandes i enviar-les a seqüenciar, perquè ens interessa que es separin els diferents microorganismes. Un incovenient d'aquesta tècnica és que els microorganismes que estan per sota d'un 1% en la població no es veuen. Pot ocòrrer que dos microorganismes et caiguin al mateix lloc, o bé que un microorganisme es trobi en dos bandes diferents.
Aquest gel desprès es tenyeix i obtens un patro de bandes, la qual cosa et permetrà comparar la presencia dels microorganismes segons el temps. A mès, tambè pots retallar aquestes bandes, enviar-les a seqüenciar i obtenir la seqüencia de cada un d'aquests.
Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll - TRFLP: el que es fa es extreure el DNA, fem una PCR (amplificació d'aquest) però amb un primer marcat amb fluorescència. Cada gen amplificat (16S) estarà marcat amb fluorescencia. Seguidament es talla amb un enzim de restricció; com tenim fragments de seqüencies diferents, l'enzim tallarà per diferents llocs. Al tallar, generem diferents longituts que estàn marcats. Despres es corre amb un gel de electroforesis normal, on els diferents fragments pararan a diferents llocs del gel. Això, hi ha aparells que el que fan és identificar cada banda en forma de pic, com per exempre diferents seqüenciadors. A partir d'aquí, s'obtenen un seguit d'electroforegramas (diagrames obtinguts d'electroforesis), on cada pic siginifica una banda del gel i per tant, un fragment de restricció terminal que estava marcat amb fluorescència. Les bandes marcades no les identifica, ja que nomès identifica els extrems terminals marcats. Sabent quans pics tens, és a dir, el seu nombre, pots saber de quantes espècies parlem. L'alçada del pic ens indicia l'abundància d'aquell organisme. Consisteix un gel d'agarosa.
c. Tècniques de seqüènciació massiva, com la piroseqüenciació i llumina.
Amb aquests mètodes augmenta la possibilitat de veure les espècies més abundants.
- Piroseqüenciació: segueix sent una tècnica depenent de PCR, però aquesta es realitza sobre una superfície sòlida. El DNA es desnaturalitza i si li afegeixen uns adaptadors. Seguidament, s'apliquen una sèrie de condicions per a que cada una de les cadenes del DNA s'uneixi a una superfície sólida, com una espècie de perla o boleta, dins d'una emulsió, que conté els reactius de la PCR. Es realitza la propia PCR de forma que cada boleta contindrà milers de còpies d'aquella cadena de DNA que tenia (fragments de DNA repetits moltes vegades dintre de la propia boleta). L'avantatge és que en un mateix aparell es fa la PCR i es seqüencia, un mateix aparell ho fa tot. En un únic experiment, el que tenim és totes les seqüencies a l'hora. Seguidament aquestes boletes es dipositen en microplaques (multipouets), cada boleta amplificada va a parar en únic pou. Si afegeixen 4 enzims que ens ajudaran a conèixer la seqüencia. El primer enzim és la polimerasa, la qual afegeix nucleótids quan troba la complmentària i allibera fosfats, de manera que s'allibera llum i es detecta que aquell nucleòtid és el que s'ha afegit.
Tambè trobem una sulfurilasa i una luciferasa, les quals faràn que a partir del pirofosfat que s'allibera desprès de la unió de un nucleótid, obtenir ATP i obtenir llum. Es van afegint els nucleòtids, i mirem quan surt la llum, que serà que haviem afegit un nucleòtid adient. Al final s'afegeix una pirasa, que degrada tot el nucleòtid que no s'ha afegit, trenca els nucleòtids en excés. Aquest desprendiment de llum es detecta, i és registrat per l'aparell (tecnologia adequada). Tot aixó per a cada pou, i pots tenir 10.000 seqüencies a l'hora. Es diu piroseqüenciació perque es genera pirofosfat.
D'aquesta tècnica, obtenim diferents corbes rang-abundancia; en l'eix X tenim els filotips ordenats en ordre de decreixement, tenim molts microorganismes que són molt poc abundants --> biosfera rara.
Amb les tècniques DGGE o genoteques, detectaríem els més abundants, amb una genoteca una mica més i amb les tècniques de seqüencia massiva, podem anar molt més lluny (als microorganismes menys abundants.
● Mètodes no dependents de PCR: FISH i CARD-FISH, i tècniques de metagenòmica (extraure DNA i directament es seqüència).
Gràcies FISH i CARD-FISH, podem analitzar diversitat i abundància amb una mateixa tecnologia. La metagenòmica, junt amb la seqüenciació massiva, és una de les coses més de moda ara. La metagenòmica és l'anàlisi de tots els gens de la comunitat, no només el 16S, amb la metagenòmica podem deduir que tenim en la comunitat Ecologia Microbiana TEMA 3 Ariadna López Coll Per tant, podem trobar dos enfocs diferents; enfoc de l'analisi de la comunitat (Genoteca, DGGE, seq massiva) o anàlisi de genomes de la comunitat, on identifiquem el màxim nombre de gens possibles, les funcions de la comunitat i també identificar els microorganismes que hi ha, no només quins, sino tambè que hi fan. Amb aquestes tècniques de metagenòmica, s'ha pogut descobrir nous gens. Una de les tècniques que més s'utilitza en metagenòmica es el shotgun, on extraiem el DNA, el fragmentem i el clonem en plasmidis o vectors (BACs) que admeten fragments molt llargs de DNA, i els podem seqüenciar. Un cop seqüenciats, tenim molts seqüencies i els gens han estat barrejats i trencats, gràcies a programes informàtics.
Existeixen altres tècniques mol·leculas. Utilizen una sèrie de dispositius més o menys complexos. Hi ha la possibilitat d'utilitzar filochips, les quals són micromatrius filogenetiques (placa amb pous, poden ser milers). A cada pou es pot ficar una sonda, com per exemble la del gen del rRNA 16s de diferents espècies (cal saber l'ordre), i desprès extreiem el DNA de la mostra ambiental, amplificar-lo amb primers del 16S i marcar-los amb fluorescència. Desprès realitzes la hibridació en cada pou. Si hi ha hibridació, hi haurà fluorescencia. Com saps que hi havia a cada pou, pots identificar quins microorganismes hi han a la teva mostra ambiental.
Una altre tècnica bastant nova és la genòmica de cèl·lules individuals no cultivades, per tal d'agar únicament una única cèl·lula. D'aquesta cèl·lula es pot analitzar el seu genoma. No es cultiva res, el que fas es agafar la cèl·lula, llises i extreus el genoma. Apliques una metodologia que es diu MDA, on s'utilitza la polimerasa d'un bacteriofag i s'uneix a l'atzar a diferents llocs del genoma. Aquesta polimerasa té la particularitat de desplaçar la cadena que té al davant, i a mesura que es va allargant la molècula de DNA que s'amplifica, les molècules de DNA que es troben davant es desplaçen i es tornen a amplificar. D'aquesta manera, amplifiquem d'una manera especial per amplificar una sola cèl·lula.
...