Tema 9 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T9 Tema 9. Sincronització cel·lular El cicle cel·lular té una sèrie de punts de control. Els principals punts de control són a l’entrada de la fase S (es formula la pregunta de si la cèl·lula ja és prou gran com per replicar-se, si la cèl·lula té el seu DNA íntegre), a l’entrada de la mitosi (es pregunta si el DNA està íntegre, si el DNA està replicat, és un punt de control molecular molt exigent) i a la sortida de la mitosi (es pregunta si tots els cinetocors estan al centre, al fus mitòtic i unit a microtúbuls).
Imaginem que volem utilitzar cultius cel·lulars d’una determinada línia per veure si hi ha una droga que actua sobre aquestes i que per exemple sigui el que provoca la seva mort. Sabem que aquesta droga interfereix en una molècula concreta, com podria ser la DNA polimerasa i per tant actuaria en la fase S. En aquest cas ens podria interessar tenir la major part de l població cel·lular sobre la que fem l’experiment en la fase S, és a dir, tenir el cultiu sincronitzat.
La majoria de cultius son asincrònics però podem fer un tractament per tal que les cèl·lules quedin blocades en aquesta fase ja que podria ser que la droga amb la qual estem elaborant l’estudi afecti els resultats per altres cèl·lules que no estan en fase S.
SINCRONITZACIÓ PER ALLIBERAMENT DEL “BLOQUEIG A G0 PER PRIVACIÓ DE SÈRUM” Recordem que la fase G0 fa referència a cèl·lules que estan fora del cicle i que per tant, no s’estan dividint. Per tal que puguin dividir-se han d’entrar a G1 i a partir d’aquí continuar el cicle.
Imaginem que volem sincronitzar cèl·lules perquè estiguin a G0, d’aquesta manera aconseguim una població gran de cèl·lules que quan canviem a condicions òptimes entrin a la vegada a G1. Una manera senzilla de fer-ho és privar-les dels elements que les estimulen a dividir-se, com són els factors de creixement. Quan nosaltres estem cultivant cèl·lules, això ho podem controlar eliminant el sèrum ja que conté els factors de creixement que les cèl·lules necessiten; d’aquesta manera aconseguim que les cèl·lules finalitzin la seva divisió i quedin en estat quiescent.
Cal tenir present que les cèl·lules que creixen adherides, les podem deixar 3 dies sense sèrum i les cèl·lules que estaven a les fases inicials podran completar la divisió però quan arribin a G1, sortiran a G0. Per tant, hem de donar temps per tal que totes les cèl·lules quedin en G0.
Una altra manera per tenir el cultiu sincronitzat a la fase G0 és deixar que les cèl·lules arribin a la fase de plateau però en aquest cas hem de vigilar molt. Quan les cèl·lules arriben a aquesta fase deixen de dividir-se i és per aquest motiu que hem d’anar subcultivant les cèl·lules abans que arribin a aquesta fase; les cèl·lules que estan en G1 i en G0 tenen diferent facilitat d’entrada al cicle. Cal saber que si tenim molt de temps les cèl·lules en fase plateau o G0, podrien morir.
En les cèl·lules que creixen en suspensió, aquest sistema no funciona tan bé.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T9 SINCRONITZACIÓ MITJANÇANT ELUTRIACIÓ PER CENTRIFUGACIÓ Podem separar cèl·lules en funció de la seva mida. Permet separar les cèl·lules que es troben a l’inici de G1, de les mitòtiques o de les de G2 [doble volum].
Aquest mètode es pot utilitzar en cèl·lules que creixen tant adherides com en suspensió. Un únic cicle de centrifugació permet obtenir 107 cèl·lules mitòtiques, mentre que per obtenir el mateix número calen 100 cultius mare en el mètode per agitació (Veure 5). La metodologia s’ha utilitzat amb èxit per sincronitzar cèl·lules HeLa, HL-60, CHO, L, 3T3 i eritroleucèmiques.
SINCRONITZACIÓ PER ALLIBERAMENT DEL BLOQUEIG A S Es poden utilitzar diferents drogues que inhibeixen la replicació com ara la hidroxiurea, la timidina o l’afidicolina. Fan falta dos rondes de bloqueig per aconseguir una sincronització a la fase S.
Imaginem que tenim una població proliferant que està creixent de forma asincrònica. Afegim el primer compost que bloqueja la replicació, de manera que les cèl·lules que estan en fase S quedaran bloquejades però la resta no estaran afectades. Les que estiguin a G2 faran la mitosi i quan arribin a la fase S quedaran bloquejades. Després de la primera ronda de bloqueig tindrem moltes cèl·lules bloquejades a l’inici de la fase S i d’altres repartides durant la fase S. El primer bloqueig ha de durar el que dura la fase G2+M+G1. Considerem que la fase S dura 4 hores.
Hem de retirar el medi que conté l’inhibidor i afegir nou medi per permetre que les cèl·lules tornin a proliferar. Això farà que les cèl·lules que estaven en fase S continuïn el cicle i les cèl·lules que s’havien acumulat a l’inici de la fase S també podran començar la replicació. Hem de deixar el medi sense inhibidor 4 hores i a continuació afegir una altra vegada l’inhibidor. Les cèl·lules que estaven en fase al principi ara es trobaran fora de la fase S, de manera que podran continuar el cicle i quan es trobin a l’inici de la fase S s’aturaran a causa d’aquest segon bloqueig.
Quan eliminem el medi per segona vegada, tindrem cèl·lules a l’inici de la fase S. Cal tenir present que l’eficàcia mai no serà al 100%, però per detectar l’acció d’un fàrmac durant la fase S és suficient.
Per fer aquest tipus de tractaments ens interessa saber quina és la durada del cicle cel·lular ja que sinó no sabem quant temps hem de deixar les cèl·lules proliferar sense inhibidor.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T9 SINCRONITZACIÓ DEL BLOQUEIG A M Imaginem que ens interessa saber quina és la resposta de cèl·lules mitòtiques a un determinat agent. Per fer-ho podem combinar dos sistemes: tractaments químics i agitació de cèl·lules mitòtiques.
Tractaments químics Per una banda, aplicar tractaments suaus que durin poc temps i que inhibeixin la formació de microtúbuls com és el cas del colchemid, colciquina... En aquest cas les cèl·lules arriben a mitosi però no poden passar a metafase i anafase. Aquests tractaments són durs per les cèl·lules i per tant no poden estar molt temps si volem que es recuperin. Com que la mitosi és un període curt del cicle cel·lular, ens permet utilitzar aquest tipus de tractaments Sincronització per agitació de cèl·lules mitòtiques El tractament anterior el podem combinar amb una sincronització per agitació de les cèl·lules mitòtiques. Sabem que en les cèl·lules que creixen adherides, quan són mitòtiques es tornen més rodones. Aquestes cèl·lules com que en el moment de la divisió trenquen moltes de les unions que hi ha amb el substrat, salten i queden surant. Per tant, un bon sistema per tenir cèl·lules en mitosi és sacsejar el cultiu. Si necessitem augmentar el nombre de cèl·lules mitòtiques és augmentar el nombre de cultius i cada X temps anar sacsejant per obtenir més cèl·lules mitòtiques.
Aquesta sincronització és relativament és relativament bona perquè no afegim cap element químic, si no la barregem amb el mètode anterior, i per tant, la distorsió que provoca és relativament petita.
SINCRONITZACIÓ PER ELUCIÓ DE MEMBRANA La sincronització per elució de membrana és un sistema que s'ha descrit fa menys de 10 anys i que la gent que treballa amb cicle cel·lular diuen que és l’únic sistema que dóna resultats fiables. Molta gent pensa que quan fem un tractament com els anteriors no obtenim resultats fiables.
En aquest cas es fa créixer les cèl·lules sobre una membrana que es troben en contacte amb medi de cultiu.
Concretament, les cèl·lules creixen a la part inferior de la membrana. Un cop les cèl·lules han crescut adherides sobre la membrana, s’elimina el medi de la part inferior. La membrana permet la filtració del medi superior de manera molt lenta, així doncs, a mesura que es produeix la divisió cel·lular i la citocinesi, les cèl·lules filles com que no estan en contacte amb la membrana, cauran al medi.
Amb aquest mètode podem recollir cèl·lules que no han estat tractades i fer estudis sabent al 100% que és una cèl·lula normal que està a G1.
3 ...