HH (2007)

Apunte Portugués
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 5º curso
Asignatura HH
Año del apunte 2007
Páginas 27
Fecha de subida 19/10/2014
Descargas 7
Subido por

Vista previa del texto

TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica 1. CONCEPTE D’ENZIM, NATURALESA I FUNCIÓ Concepte de catalitzador Un catalitzador rebaixa l’energia lliure d’activació de Gibbs de la reacció catalitzada. L’energia lliure d’activació de Gibbs és l’energia que s’ha de subministrar a les molècules reactants per assolir l’estat activat conegut com a estat de transició (estat intermedi d’alta energia que es forma quan en una reacció química es passa de S a P; aquest és de vida curta, la vida mitja típica és de s).
Concepte d’enzim i funció Els enzims són els catalitzadors dels sistemes biològics. La majoria d’enzims són proteïnes, malgrat tot, hi ha molècules de RNA catalíticament actives.
Els enzims acosten els substrats amb una orientació òptima, fet essencial per a establir o trencar enllaços químics. Al estabilitzar els estats de transició, catalitzen la reacció de l’espècie química de major energia.
Els enzims acceleren la velocitat de reacció química mitjançant l’estabilització de l’estat de transició de la reacció, per tant, disminuint la barrera energètica per a la formació del producte.
Hi ha un seguit de passos: L’enzim (E) més el substrat (S) formen el complex ES, passen l’estat de transició i es forma el complex EP, fins que s’obté el resultat final, enzim més producte (P).
És important veure, doncs, que l’enzim no es consumeix durant la reacció. Quan s’uneix al substrat els aproxima i els orienta en la posició adequada per facilitar la reacció.
1 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Quan es dóna el sistema E+S la primera etapa (que va a ES), normalment, és favorable energèticament (veure gràfic). Observem, també, que el complex EP és menys estable que el complex E+P.
Els enzims acceleren les reaccions disminuint la barrera d’activació (energia lliure d’activació de Gibbs = energia d’activació). L’essència de la catàlisis és la unió específica de l’estat de transició.
Propietats generals dels enzims a) Augmenten la velocitat de reacció (factor ) Els enzims acceleren les reaccions multiplicant-ne la seva velocitat per un milió de vegades o fins i tot més.
L’enzim no és capaç de canviar el balanç de la reacció (no pot fer-la espontània), només pot augmentar la velocitat per arribar a l’equilibri.
Els enzims no alteren els equilibris de reacció, és a dir, els enzims acceleren la reacció en un sentit i un altre amb el mateix factor, de manera que no poden fer-la favorable energèticament. És a dir, amb un enzim o no l’equilibri serà el mateix, no variarà de posició, el què aconsegueix l’enzim és que s’arribi a l’equilibri molt més ràpidament.
b) Condicions de reacció més suaus (temperatura, pressió, pH) Poden actuar en condicions de temperatura i pH molt suaus (catalitzadors seleccionats per treballar en condicions biològiques).
c) Alta especificitat de substrat i producte Els enzims són altament específics, tant en la reacció que catalitzen com en la selecció de les substàncies reaccionants (substrat). D’aquesta manera, com que el grau d’especificitat del substrat és tan elevat, en les reaccions catalitzades per enzims rarament hi haurà reaccions colaterals que condueixin a la formació de productes secundaris. En conclusió, un enzim catalitza normalment una sola reacció química o un grup de reaccions estretament relacionades (com en el cas d’enzims proteolítics: catalitzen la hidròlisis d’enllaços peptídics, però també poden catalitzar la hidròlisis d’un enllaç ester; exemples: tripsina (altament específica, trenca enllaços peptídics pel cantó carboxílic dels residus de lisina i arginina), trombina (participa en la coagulació sanguínia: catalitza la hidròlisis Arg-Gly en seqüències peptídiques determinades)).
*Els anàlegs de l’estat de transició d’una reacció catalitzada són inhibidors molt efectius dels enzims.
2 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica d) Capacitat de regulació (no vol dir que tots siguin regulats) Les activitats catalítiques de molts enzims estan regulades (veure més endavant: inhibició per retroalimentació, modificació covalent...).
El centre actiu d’un enzim El centre actiu d’un enzim és la regió que s’uneix al substrat (i al grup prostètic, si existeix) i conté els residus que participen directament en la producció i trencament d’enllaços. Aquests residus s’anomenen grups catalítics. Encara que els enzims difereixen àmpliament en estructura, especificitat i mètode de catàlisis, és a dir, que cada centre actiu de cada enzim és únic, es poden fer algunes generalitzacions: - El centre actiu d’un enzim és petit (relatiu al volum total de l’enzim).
El centre actiu suposa una porció relativament petita del volum total de l’enzim. Molts dels residus d’aminoàcids d’un enzim no estan en contacte amb el substrat, fet que planteja el perquè els enzim són tan grans.
- El centre actiu té estructura tridimensional: l’especificitat del substrat utilitzat depèn d’una correcta i definida posició dels àtoms en el centre actiu de l’enzim.
Un substrat ha de tenir una forma adequada per a introduir-se en el centre, d’aquesta manera, la geometria ja discrimina per mida i forma. Un cop pot entrar perquè s’ajusta ha de tenir complementarietat, que permet fixar el substrat (mitjançant enllaços no covalents, en general, perquè sinó l’enzim no es recuperaria inalteradament) (veure models d’interacció entre enzim i substrat).
- El centre actiu dels enzims generalment es troba en “hendiduras” i “grietas” de la proteïna.
En tots els enzims d’estructura coneguda, les molècules de substrat queden lligades a un forat o una esquerda de la qual l’aigua queda normalment exclosa, a no ser que sigui un component de la reacció. El forat crea un microambient en el qual certs residus polars adquireixen propietats especials per a la seva funció catalítica. Les posicions internes d’aquests residus polars són excepcions crucials des del punt de vista biològic a la regla general de què els residus polars estan exposats a l’aigua. En resum, a l’interior de la proteïna no hi ha aigua (i si n’hi ha, comptada), no com a la resta del medi.
3 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica - En la majoria dels casos, les interaccions inicials entre l’enzim i el substrat no són covalents.
Els substrats, doncs, s’uneixen als enzims per nombroses forces dèbils. Les interaccions reversibles entre biomolècules es realitzen per enllaços electrostàtics, ponts d’hidrogen i forces de van der Waals (aquestes últimes són importants quan E-S estan prou propers). Consegüentment, l’enzim i el substrat han de tenir formes complementaries. El caràcter direccional dels ponts d’hidrogen entre l’enzim i el substrat sovint obliga a un alt grau d’especificitat.
Models d’interacció entre enzim i substrat a) Model clau-pany Aquest model ens mostra la estereoespecificitat de la catàlisi. En aquest model, el centre actiu de l’enzim per sí sol és complementari a la forma del substrat. Malgrat tot, està actualment provat que la forma dels centres actius d’alguns enzims es modifica sensiblement al unir-se al substrat: model de l’ajust induït.
b) Model de l’ajust induït En aquest model els centres actius dels enzims tenen formes que són complementaries a la del substrat únicament després de què el substrat s’hagi unit. Aquest procés de reconeixement dinàmic s’anomena ajust induït.
Hi ha un canvi conformacional de l’enzim i del substrat quan entra el substrat. L’enzim no és 100% complementari, sinó que a qui és realment més complementari és a l’estat de transició (el fa més estable), però sí que té certa afinitat a S. Quan E s’uneix a S i hi ha el canvi conformacional, aquest canvi d’E força S a adoptar una forma més propera a l’estat de transició (TS).
4 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica El model de l’ajust induït és el considerat com a bo actualment, on la dinàmica de la molècula de l’enzim és actiu. Si s’assembla més a TS la unió serà més forta.
Definició de cofactor Els cofactors són grups funcionals no típics de cadenes laterals d’aminoàcids; els enzims en necessiten molts. Hi ha dos grups de cofactors: a) Ions inorgànics b) Coenzims (si són molècules orgàniques, com NAD+ o FAD): si un coenzim està unit de manera estable a la proteïna (enllaç covalent) s’anomena grup prostètic (FAD).
Els grups prostètics de coenzims + els apoenzims formen els holoenzims. Els apoenzims són enzims sense cofactors (venen dels aminoàcids; són catalíticament inactius perquè no tenen els cofactors necessaris). Un holoenzim és un enzim amb cofactor, és un enzim format per una proteïna (apoenzim) i un cofactor (pot ser un ió, un coenzim o un grup prostètic). Exemple: alcohol deshidrogenasa: síntesi amb o sense NAD+.
5 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica 2. CLASSIFICACIÓ I NOMENCLATURA Classificació d’enzims Els enzims es classifiquen segons un sistema internacional que consta de quatre números. El primer número classifica en un d’aquests grups: 2) Transferases: només hi ha transferència, diferent de les liases.
3) Hidrolases: trencaments que impliquen H2O.
4) Liases: també hi ha trencaments, però sense H2O.
6 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Exemple de catàlisis: anhidrasa El poder catalític de les proteïnes deriva de la seva capacitat per unir-se a les molècules del substrat en la orientació més convenient i de la seva capacitat d’estabilitzar els estats de transició durant la construcció o el trencament d’enllaços químics. Aquest principi bàsic es veu exemplificat en el cas de la reacció d’hidratació del diòxid de carboni catalitzada per l’anhidrasa carbònica, un dels enzims més ràpids que es coneixen.
Com aconsegueix l’anhidrasa carbònica accelerar aquesta reacció més d’un milió de vegades? Una part de la seva eficàcia catalítica és deguda a què el ió Zn està coordinat a tres grups imidazoles d’altres tants residus d’histidina de l’enzim. En les proximitats del ió Zn hi ha un grup de residus que reconeixen i enllacen el diòxid de carboni. L’aigua unida al ió Zn es converteix ràpidament en hidròxid, situat en la posició precisa per a atacar la molècula de CO2 enllaçada junt a ell. El ió Zn ajuda a orientar el CO2, així com a subministrar una concentració local d’hidròxid molt elevada. La anhidrasa carbònica és un potent catalitzador perquè atrau al substrat posant-lo en estret contacte amb ella i aconsegueix una orientació òptima per a que aquest reaccioni.
7 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica La histidina pot actuar com a base traient protons a l’aigua: la última molècula d’aigua quedaria en forma d’hidròxid, fet que fa que el Zn tingui un pKa més baix que l’aigua permetent que sigui més fàcil d’extreure. Afegim H2O a l’intermedi de reacció (transició, l’estabilitza) i s’alliberen protons i bicarbonat. Un cop això agafar un altre per veure si també passa o no.
3. MECANISMES GENERALS: descripció d’alguns mecanismes Mecanisme de les serin-proteases Les serin-proteases són hidrolases que degraden enllaços peptídics de pèptids i proteïnes que posseeixen en el seu centre actiu un aminoàcid de serina essencial per a la catàlisis enzimàtica.
Tallen la cadena polipeptídica pel cantó carboxil d’aminoàcids específics. El trencament de l’enllaç covalent marca la velocitat del procés, ja que és el pas que més costa.
Sempre posseeixen una tríada d’aspartat, histidina i serina (tres posicions que es mantenen).
Un exemple d’una serin-proteasa és la tripsina.
Afavoreixen a que l’oxigen pugui fer atac nucleofílic al S, de manera que O2 queda unit covalentment a C (no és normal), formen C=O trencant l’enllaç N-C. De manera que queden trencades dues parts (C-terminal i N-terminal) i s’allibera H2O que ataca (ara cal trencar altre cop, revés passos anteriors).
8 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica La quimiotripsina és un enzim digestiu que té un paper biològic que consisteix en catalitzar la hidròlisi de proteïnes en l’intestí prim. És selectiva pels enllaços peptídics contigus a l’extrem carboxílic de les cadenes laterals aromàtiques de tirosina, triptòfan i fenilalanina i de grans residus hidrofòbics (com la metionina). La quimiotripsina té una significació addicional com a membre d’una família important de proteïnes, les serin-proteases. Durant la catàlisi d’aquesta família de proteases, una part del substrat s’enllaça covalentment amb l’enzim.
La quimiotripsina hidrolitza enllaços ester a més dels enllaços peptídics. Mecanisme catalític: Quimiotripsina + acetat de p-nitrofenil formen complex ES, l’enllaç ester del substrat es trenca.
Un dels productes (p-nitrofenil) queda alliberat de l’enzim, mentre que el grup acetil del substrat queda lligat a l’enzim de forma covalent (acilació). L’aigua ataca aleshores al complex acetilenzim per produir un ió acetat i regenerar l’enzim (desacilació, etapa molt més lenta: determina la velocitat total d’hidròlisis d’esters per quimiotripsina): E + S – ES (alliberació P1) – EP2 – (alliberació P2) E EP2 és un grup acil, és un intermediari acil-enzim. El grup acil queda lligat a l’àtom d’oxigen d’un residu de serina, la serina de la posició 195, que és extraordinàriament reactiu. El DIPF (DPF) reacciona amb la serina 195 inactivant l’enzim (la reactivitat singular de la serina 195 es veu subratllada pel fet que els altres 27 residus de serina de la quimiotripsina no es veuen afectats pel DIPF). Els enzims proteolítics que contenen una serina altament reactiva són coneguts com a serin-proteases i es posen en manifest per la seva susceptibilitat al DIPF.
La histidina 57 forma part del centre actiu i té un paper catalític. Què és el que fa tan reactiu el centre actiu de la quimiotripsina? La serina 195 queda propera a la histidina 57, juntament amb el grup carboxilat de l’aspartat 102. Aquests tres residus formen una tríada catalítica. L’aspartat 102 orienta l’anell imidazòlic de la histidina 57 assegurant-se que adopti la forma adequada per acceptar un protó procedent de la serina 195 (atacada nucleofílicament per l’oxigen). L’aspartat 102 (càrrega negativa) estabilitza la càrrega positiva que adquireix la histidina 57 en l’estat de transició.
En la desacilació, la histidina 57 arrenca un protó de l’aigua i l’hidròxid ataca a l’àtom de carboni carbonílic del grup acil unit a la serina 195. Es forma un intermediari tetraèdric transitori (com en l’acilació) i la histidina 57 cedeix un protó a l’àtom d’oxigen de la serina 195, donant com a resultat l’alliberació del fragment acídic del substrat. L’enzim queda preparat per un altre cicle catalític.
9 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Concepte de velocitat inicial i velocitat màxima La primera etapa de la catàlisis enzimàtica és la formació d’un complex enzim-substrat. La major part de la capacitat catalítica dels enzims procedeix de juxtaposar els seus substrats en orientacions favorables dins dels complexes ES. Els substrats queden units a una regió específica de l’enzim anomenada centre actiu. La majoria d’enzims són molt selectius en la seva unió als substrats. La capacitat catalítica dels enzims depèn, en gran part, de la especificitat en la unió i, el què és més, les activitats d’alguns enzims estan controlades en aquesta etapa.
A una concentració constant d’enzim, la velocitat de la reacció augmenta amb la concentració de substrat fins que s’assoleix una velocitat màxima. Per contra, les reaccions no catalitzades no mostren aquest efecte de saturació. Michaelis va interpretar la velocitat màxima d’una reacció catalitzada per un enzim en termes de la formació d’un complex ES. A concentracions de substrat suficientment elevades, els centres catalítics estan ocupats per ES, fet que fa que la velocitat de la reacció assoleixi un màxim.
Com sabem si un enzim és més o menys bo? Valorarem els enzims per l’etapa de catàlisi, ja que es va assumir que l’etapa catalítica era la més lenta i la ràpida era la combinació amb el substrat. Aquest fet, però, NO sempre és així. En el cas que sí que sigui així, en suficient concentració de S (molt gran, que superi la concentració d’E) la velocitat total estarà limitada per k2.
Si la concentració de S és molt baixa, no tot l’enzim estarà en ES i tindrem una velocitat menor.
Si mirem com evoluciona la velocitat en funció de [S], veiem que hi ha un punt on no augmenta més, es manté constant. Aquest punt és l’estat de saturació, és a dir, la velocitat màxima que s’aconsegueix quan tot l’enzim està acomplexat pel substrat.
10 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica La velocitat inicial es mesura quan es creu que no hi ha variació de substrat (en veritat sí que hi ha variació, però molt poc).
Criteri de la velocitat inicial: mirem la velocitat real a 1mM (fent que la reacció no consumeixi més del 10-20% del substrat).
Estat estacionari Definició: es refereix a un període de temps de la reacció enzimàtica durant el qual la velocitat de formació del complex ES és la mateixa que la velocitat de descomposició per a formar l’enzim lliure i producte(s).
A l’inici de la reacció hi haurà un augment ràpid de formació del complex ES, seguit per una fase en la què la velocitat de formació de nou ES és compensada per la seva descomposició a enzim lliure i producte. [ES] constant, fase d’estat estacionari.
11 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Creuament línia vermella i blava: enzim es combina amb substrat. La línia verda mostra el moment en el què comences a tenir producte. Quan la línia vermella i la blava es mantenen, estan en l’equilibri (depèn, doncs, d’aquests dos equilibris).
Efecte de la concentració de substrat en la velocitat Els estudis primerencs sobre les reaccions catalitzades per enzims, van demostrar que la velocitat seguia la dependència de substrat següent: Assumim on la velocitat és lineal, que és velocitat inicial. En condicions de velocitat inicial per cada [S] podem determinar la velocitat de cada producte. El segon gràfic mostra la velocitat en funció de [S], que els punts són els pendents a cada [S]. El gràfic mostra que l’enzim té un comportament Michaelià (el segueixen la majoria d’enzims). Per cada [S] a concentració d’enzim fixa, podem determinar la velocitat. (recorda Km = Vmax / 2).
Equació i cinètica de Michaelis-Menten En la majoria d’enzims, la velocitat de catàlisis, V, varia amb la concentració de substrat, [S], tal i com s’observa en el gràfic (comportament michaelià). La velocitat es defineix com el nombre de mols de producte formats per segon. A una determinada concentració d’enzim, V és casi proporcional a [S], quan aquest és petit. Quan [S] és elevada, V és pràcticament independent.
Michaelis i Menten van proposar un model senzill que explica aquestes característiques cinètiques. L’aspecte crític del seu desenvolupament és que es necessita un complex específic ES intermediari en la catàlisis: 12 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Un enzim E es combina amb S per formar un complex ES amb una constant de velocitat k1. El complex ES té dos destins possibles. Pot dissociar-se en E i S amb una constant de velocitat k1, o pot continuar fins a formar un producte P amb una constant de velocitat k2. Se suposa que casi res del producte reverteix al substrat inicial, una condició que es compleix en l’estat inicial de la reacció, abans de què la concentració de producte sigui apreciable.
Partint de V=k2[ES] i que la velocitat de formació ES = k1 [E][S] i la de destrucció ES = (k-1+k2) [ES], s’arriba a la següent equació: Aquesta equació justifica que quan [S] << Km (constant de Michaelis), la velocitat és directament proporcional a la concentració de substrat (serà lineal). Quan [S] >> Km, la velocitat és màxima i independent de la concentració de substrat. El significat de Km, doncs, és evident en l’equació. Quan [S] = Km, aleshores la velocitat inicial equival a la meitat de la velocitat màxima. D’aquesta manera, Km és aquella concentració de substrat a la qual la velocitat de reacció es fa la meitat del seu valor màxim. Dit en altres paraules, Km és la quantitat de substrat necessari per estar a ½ de la velocitat màxima (Km = (k-1+k2)/k1).
13 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Significat dels paràmetres cinètics Et = enzim total. Si k2 << k-1: podem afirmar que podem prescindir de k2 i aleshores veiem que: Km (afinitat de l’enzim pel substrat) = k2 + (k-1/k1) = k-1/k1 = kd. En teoria, com més petita sigui Km més afinitat tindrà l’enzim pel substrat. La constant catalítica representa el número de molècules de producte formades per unitat de temps per un mol d’enzim. Els enzims més optimitzats tenen una Kcat més petita (més ràpid, veure gràfic pàgina anterior).
En el cas de l’eficiència catalítica, com més gran sigui més bon enzim serà (com més gran Kcat i més petita Km). Hi ha un límit màxim que ve determinat per temps de difusió dels enzims per solució aquosa (equació lineal): Els valors de Km dels enzims varien àmpliament. Per la majoria d’enzims, Km varia entre i M. El valor de Km per a un enzim depèn de cada substrat particular i també de les condicions ambientals tals com pH, temperatura i força iònica. La constant de Michaelis té dos significats.
Primer, Km és la concentració de substrat a la qual la meitat dels centres actius estan ocupats.
Segon, Km es relaciona amb la constant de velocitat de les etapes individuals en l’esquema catalític representat en l’equació: E+S - ES - E+P. Definim Km com a (k-1+k2)/k1. Considerem un cas límit en el qual k-1 >> k2. Això significa que la dissociació del complex ES cap a E i S és 14 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica molt més ràpida que la formació de E i P. Sota aquestes condicions, k-1 >> k2 i podem dir que Km = k-1 / k1, de manera que la constant de dissociació del complex ES ve donada per: Kes = [E][S] / [ES] = k-1 / k1. Dit en altres paraules, Km és igual a la constant de dissociació del complex ES quan k2 és molt menor a k-1. Quan s’aconsegueix aquesta condició, Km és la mesura de la estabilitat del complex ES: una Km alta indica una unió dèbil, una Km baixa indica una unió forta. Cal subratllar que Km indica la afinitat del complex ES només quan k-1 >> k2.
El nombre de recanvi d’un enzim és el número de molècules de substrat convertides en producte per unitat de temps per una molècula d’enzim quan aquest està totalment saturat de substrat. És igual a la constant cinètica k2. La Vmax revela el nombre de recanvi d’un enzim si es coneix la concentració de centres actius [Et]: Vmax = k2 [Et] (valor de k2 és en segons a la menys 1, 1/k2 = temps de cada cicle catalític).
Com hem dit, doncs, quan la concentració de substrat és molt més gran que Km, la velocitat de catàlisis és igual a k2, el nombre de recanvi. Malgrat tot, la majoria d’enzims no estan habitualment saturats de substrat. En condicions fisiològiques la raó [S]/Km acostuma a estar compresa entre 0,01 i 1. Quan [S] << Km, la velocitat enzimàtica és molt menor que k2, perquè la major part dels centres actius no estan ocupats. Quin és el paràmetre adequat per precisar la cinètica enzimàtica en aquestes condicions? V = (k2 [E][S]) / Km Quan [S] << Km, la concentració d’enzim lliure, [E], és aproximadament igual a la concentració total de l’enzim [Et]. Consegüentment, quan això passa la velocitat enzimàtica depèn del valor de k2/Km i de [S].
Observem que k2/Km = (k2k1) / (k-1 + k2) Suposem que la velocitat de formació del producte (k2) és molt més ràpida que la velocitat de dissociació del complex ES (k-1). En aquest cas, el valor de k2/Km s’aproxima a k1. Per tant, el límit extrem del valor k2/Km l’estableix k1, la velocitat de formació del complex ES. Aquesta velocitat no pot superar la velocitat de trobament de l’enzim i el substrat, controlada per la difusió. La difusió limita el valor de k1, de manera que no pot superar xifres de a . En conseqüència, aquest és el límit màxim de k2/Km.
Aquest restricció també és vàlida per enzims amb un procés de reacció més complex que E + S – ES – E+P. La seva velocitat catalítica màxima a saturació de substrat, designada per Kcat, depèn de varies constants de velocitat, en lloc de únicament de k2. El paràmetre corresponent per a aquests enzims és Kcat / Km.
carbònica està compresa entre La raó Kcat / Km de certs enzims com l’anhidrasa i , el qual demostra que aquests enzims han 15 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica assolit una perfecció cinètica. La seva velocitat catalítica només està limitada per la velocitat a la què troben els seus substrats en la dissolució. Qualsevol augment en la velocitat catalítica només podria aconseguir-se disminuint el temps de difusió. De fet, existeixen series d’enzims associats en estructures organitzades, de manera que el producte de reacció d’un enzim és ràpidament trobat pel següent. En efecte, els productes són catalitzats d’un enzim al següent com en una cadena de muntatge. Així, el límit imposat per la velocitat de difusió en el medi pot superar-se parcialment segrestant els substrats i els productes en l’espai limitat del complex multienzimàtic.
Variant la concentració de substrat poden mesurar-se Vmax i Km. La constant de Michaelis i la velocitat màxima poden derivar-se fàcilment de les velocitats de catàlisis a diferents concentracions de substrat, si un enzim opera d’acord amb l’esquema senzill: E+S – ES – E+P.
És convenient transformar l’equació de Michaelis-Menten en una altra que, representada gràficament resulti en una línia recta. Això s’aconsegueix prenent valors inversos de l’equació: 16 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica La representació gràfica de 1/V enfront 1/[S], denominada representació de Lineweaver-Burk, és una línia recta amb una coordenada d’origen igual a 1/Vmax i una pendent de Km/Vmax. De manera alternativa, Km i Vmax es poden obtenir ajustant les dades de l’equació mitjançant un programa d’ordinador.
Mecanismes de les reaccions bisubstrat En general, hi ha tres possibles mecanismes: a) Mecanisme seqüencial ordenat L’enzim primer addiciona un substrat, sempre el mateix. Si per exemple tenim el S1 = NAD+ i S2 = etanol, primer sempre afegirà NAD+ i després etanol formant un complex ternari E·S1·S2 (sortida: normalment primer P1) b) Mecanisme seqüencial estadístic Les dues esquerdes que donen a centres actius permeten l’entrada tant de S1 com de S2. Entrarà un o l’altra i la sortida també serà random.
c) Mecanisme ping-pong Primer s’addicionarà S1, alliberarà P1 i l’enzim quedarà modificat de manera que s’addicionarà S2 i es formarà P2 (el què ha estat modificat passa a S2 donant P2) de manera que tornem a tenir l’enzim com a l’estat inicial.
17 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Inhibició enzimàtica per molècules específiques Exemple: Inhibidors de la proteasa HIV-1 La replicació del virus 1 de la immunodeficiència humana (HIV-1), que origina el SIDA, requereix el trencament proteolític d’una poliproteïna que conté vàries proteïnes víriques fonamentals. La proteasa HIV-1 és un dímer simètric amb els dos residus clau d’aspartat en la interfase entre les subunitats. Aquest enzim víric és molt semblant a aspartilproteases d’eucariotes (tenen la seqüència Asp-Thr-Gly en els centres actius). La mutació en el centre actiu d’un dels dos aspartats origina una proteasa totalment inactiva. La N-acetilpepstatina i d’altres, són inhibidors potents de la proteasa HIV-1, que tenen un grup hidroxietil (substituint la prolina: proteases humans no poden tallar Tyr-Pro o Pbe-Pro, però les dels virus sí) que interactua íntimament amb la parella d’aspartats claus de l’enzim.
En aquest cas, però, s’ha de tenir en compte que un fàrmac contra el SIDA que bloquegi la proteasa HIV-1 no ha d’inhibir apreciablement les aspartilproteases humanes importants, com la renina. La proteasa vírica difereix d’aquests perquè té una simetria binaria. D’aquesta manera, un inhibidor amb la mateixa simetria que la de la proteasa vírica i amb el grup hidroxietil ha de resultar molt específic.
Alguns exemples d’inhibidors de la proteasa HIV-1: indinavir (crixivan)...
La inhibició de l’activitat enzimàtica per molècules específiques petites i per ions és important perquè constitueix el principal mecanisme de control en els sistemes biològics. També molts fàrmacs i agents tòxics actuen inhibint a els enzims. És més, la inhibició enzimàtica pot subministrar una idea sobre el mecanisme de l’acció enzimàtica: sovint poden identificar-se residus importants per la catàlisis utilitzant inhibidors específics. La inhibició enzimàtica pot ser tant reversible com irreversible: a) Inhibició enzimàtica reversible La inhibició reversible es caracteritza, en contrast amb la inhibició irreversible, per la ràpida dissociació del complex enzim-inhibidor. Trobem dos tipus d’inhibició reversible: inhibició competitiva o inhibició no competitiva. Vegem què passa en cada cas: Inhibició competitiva 18 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Anàlegs del substrat que s’uneixen al centre actiu on s’uneix el substrat: hi ha una competència que fa disminuir la velocitat, inhibeix la reacció. Com més baixa sigui la constant d’inhibició més afinitat E-I (més bon inhibidor). En aquesta inhibició s’arriba a Vmax, però cal més substrat (la Km aparent amb inhibidor és més gran: s’acosta més a zero) i en les rectes veiem que difereixen en l’eix de les x. Km aparent = Km · (1 + [I]/Ki).
En la inhibició competitiva, l’enzim pot unir-se al substrat formant el complex ES o al inhibidor EI, però no a ambdós (formant ESI). Molts inhibidors competitius s’assemblen al substrat i s’uneixen al centre actiu de l’enzim. D’aquesta manera, s’impedeix la unió del substrat al mateix centre actiu. Un inhibidor competitiu disminueix la velocitat de catàlisi reduint la proporció de molècules d’enzim que queden lligades al substrat: 19 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Val a dir que és freqüent que el producte d’una reacció enzimàtica sigui un inhibidor competitiu del substrat, a causa de la seva semblança estructural. La inhibició competitiva pot superar-se al augmentar la concentració del substrat.
Exemples E-I: malonat-succinat i 1,3-BPG amb 2,3-BPG.
Inhibició no competitiva L’inhibidor no afecta al centre actiu, pot unir-se a un altre punt, quan se li uneix l’enzim no és actiu, però el S pot unir-se igualment. Si Ki (d’unió E+S) és diferent de Ki’ (d’unió ESI) és una inhibició mixta. Si Ki = Ki’ és una inhibició no competitiva. La inhibició no competitiva és un cas particular de la inhibició mixta que només afecta a la velocitat, en aquest cas varia Vmax, però NO Km!!! En aquí variarà el punt de tall en y, però no en x.
en aquest cas tenim una Vmax aparent = Vmax / (1 + [I]/Ki). Per tant, com més gran [I] més petita serà la Vmax aparent.
En la inhibició no competitiva, que també és reversible, l’inhibidor i el substrat poden unir-se simultàniament a una molècula d’enzim. Això significa que els seus centres d’unió no se solapen. Un inhibidor no competitiu actua disminuint el nombre de recanvi de l’enzim, en lloc de disminuir la proporció de molècules enzimàtiques que s’han lligat al substrat. La inhibició no competitiva, en contrast amb la competitiva, no pot superarse al augmentar la concentració de substrat.
20 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Com hem observat en les gràfiques, la inhibició competitiva i no competitiva són distingibles cinèticament. Tornant a la cinètica de tipus Michaelis-Menten, les mesures de velocitats de catàlisis a diferents concentracions de substrat i inhibidor serveixen per a distingir entre la inhibició competitiva i la no competitiva. En la inhibició competitiva, la intersecció amb l’eix d’ordenades en la representació de 1/V enfront 1/[S] és la mateixa en presència i en absència de l’inhibidor, encara que la pendent sigui diferent. Això reflexa el fet de què Vmax no resulti alterada per l’inhibidor competitiu. La característica fonamental de la inhibició competitiva és que aquesta pot ser superada a concentració suficientment alta de substrat. A concentracions de substrat suficientment altes, pràcticament tos els centres actius esta ocupats per substrat i l’enzim és completament operatiu. L’augment en la pendent de 1/V enfront a 1/[S] indica la força d’unió de l’inhibidor competitiu. En presència d’un inhibidor competitiu, l’equació inversa de Michaelis-Menten pot representar-se: 21 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica On [I] és la concentració d’inhibidor i Ki és la constant de dissociació del complex E-I (Ki = ([E][I] / [EI]). Dit en altres paraules, en presència d’un inhibidor competitiu la pendent de la gràfica està augmentada pel factor 1 + [I] / Ki.
En la inhibició no competitiva, Vmax disminueix a Vi,max i, consegüentment, la intersecció amb l’eix y està augmentada. La nova pendent, que és igual a Km / Vi,max, està augmentada pel mateix factor. En contrast amb Vmax, Km no està afectada per aquesta classe d’inhibició. La inhibició no competitiva no pot ser superada augmentant la concentració de substrat. La velocitat màxima en presència d’un inhibidor no competitiu, Vi,max, ve donada per: b) Inhibició enzimàtica irreversible Modifiquen l’enzim i l’inactiven per sempre. Són més tòxics, però més importants per la farmàcia. Ex: cianur, penicil·lina...
En la inhibició irreversible l’inhibidor queda, covalentment o no, unit a l’enzim o lligat tan fortament a ell que la seva dissociació és molt lenta.
L’acció dels gasos neurotòxics sobre l’acetilcolinesterasa, un enzim que juga un important paper en la transmissió d’impulsos nerviosos, és un exemple d’inhibició irreversible. El DFP inhibeix enzims reaccionant amb un residu de serina en el centre actiu, com la acetilcolinesterasa. Un altre exemple n’és el cianur, que reacciona amb ions metàl·lics d’enzims. Les seves dianes primàries són els enzims de la cadena respiratòria.
La penicil·lina també n’és un exemple. Aquesta, inactiva irreversiblement un enzim clau en la síntesi de la paret de la cèl·lula bacteriana (constituïda per peptidglicà) (inhibeix la transpeptidasa, que participa en l’últim pas de la formació de la paret bacteriana, en l’entrecreuament de les cadenes de polisacàrid lineals amb pèptids curts).
22 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica 4. REGULACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA: Al·losterisme. Modificació covalent i canvis en la concentració d’enzim La capacitat de les proteïnes per unir-se de forma específica pràcticament a qualsevol biomolècula i estabilitzar el seu estat de transició confereix als enzims un gran poder catalític.
Molts enzims, poden regular la seva activitat catalítica per quatre vies principals: control al·lostèric, modificació química covalent, control de la estimulació i de la inhibició de proteïnes i activació proteolítica.
Control de la concentració d’enzim El mecanisme principal és el control de la disponibilitat d’enzims, però és molt lent (resposta pot trigar un dia...) i es dóna per coses molt cròniques.
Alguns enzims se sintetitzen en forma de precursor inactiu i són activats en un temps i lloc fisiològicament apropiats. Els enzims digestius mostren aquest tipus de control, que és denominat activació proteolítica. Per exemple, el tripsinògen se sintetitza en pàncrees i s’activa pel trencament d’un enllaç peptídic en l’intestí prim, per formar l’enzim actiu tripsina. Aquest tipus de control s’usa també repetidament en la seqüència de reaccions enzimàtiques que porten a la coagulació de la sang. Els precursors enzimàticament inactius dels enzims proteolítics s’anomenen zimògens.
Retroinhibició en rutes metabòliques És el més important, participen enzims que catalitzen etapes irreversibles. Molts cops, si el producte s’acumula actua sobre E1 o així inhibint tota la via (retroinhibició o feedback). No té una cinètica michaeliana, sinó sigmoïdal cooperativa (semblant a l’oxigen).
23 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica La retroinhibició també denominada inhibició per retroalimentació o “feed-back” és el cas en què l’enzim que catalitza la primera etapa és inhibit pel producte final. La biosíntesi de isoleucina en bacteris serveix per a il·lustrar aquest tipus de control: la treonina es converteix en isoleucina en cinc etapes, la primera de les quals està catalitzada per la treonina desanimasa. Aquest enzim s’inhibeix quan s’aconsegueix una concentració d’isoleucina suficientment elevada. La isoleucina l’inhibeix unint-se en un centre regulador de l’enzim (diferent del centre catalític). Quan torna a disminuir el nivell d’isoleucina, la treonina desanimasa torna a activar-se.
Regulació al·lostèrica Té una cinètica sigmoïdal, fet que implica que la unió del substrat sigui cooperativa. La és el punt mig de V (semblant a la Km, però no és de Michaelis perquè no és una corba Michaeliana). Els enzims tenen multisubunitats amb punts d’unió al S i al regulador al·lostèric.
Alguns enzims poden estar controlats per proteïnes reguladores, que poden estimular-los o inhibir-los. És el cas de la calmodulina. Les activitats de molts enzims estan regulats per la calmodulina, una proteïna que serveix de sensor per al calci en casi totes les cèl·lules eucariotes. La unió de calci a varis centres de la calmodulina indueix a importants canvis conformacionals que la converteixen en una forma activa a partir d’una forma inactiva.
24 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Posteriorment, la calmodulina activada s’uneix a altres proteïnes o enzims cel·lulars i modifica les seves activitats.
Exemple molt estudiat: aspartat transcarbamilasa (ATCasa) (retroinhibició).
Els enzims al·lostèrics són aquells que canvien de conformació al unir-se a un efector, fet que condueix a un canvi aparent d’afinitat d’unió d’un altre lligand en un lloc diferent de la molècula.
Els enzims al·lostèrics no segueixen la cinètica de Michaelis-Menten. Els enzims al·lostèrics, sovint mostren corbes sigmoïdals de velocitat de reacció enfront a [S], enlloc de hipèrboles (similar al cas on la unió de l’oxigen a la mioglobina és hipèrbola, mentre que la de l’hemoglobina és sigmoïdal). En els enzims al·lostèrics, la unió d’un substrat a un centre actiu d’una molècula enzimàtica pot afectar a les propietats d’un altre centre actiu de la mateixa molècula d’enzim. Una conseqüència possible d’aquesta interacció entre subunitats és que la unió del substrat es transforma en cooperativa, fet que donaria una representació sigmoïdal de V respecte a la [S]. L’activitat dels enzims al·lostèrics pot veure’s alterada per molècules reguladores que estan lligades a centres diferents als catalítics, de la mateixa manera que la unió de l’oxigen a la hemoglobina està afectada per PGB, H+ i CO2.
Considerem un enzim al·lostèric que consti de dues subunitats idèntiques amb centres actius.
La forma T (tensa) té baixa afinitat per al substrat, i la forma R (relaxada) la té elevada. En el model seqüencial simple, la unió al substrat per una de les subunitats indueix la transició de T a R en aquesta subunitat, però no en la altra. La afinitat de la altra subunitat pel substrat s’augmenta perquè la interfase d’ambdues ha estat alterada per la unió de la primera molècula de substrat. En el model concertat, la unió del substrat a una de les subunitats incrementa la probabilitat de què ambdues subunitats canviïn la seva forma de T a R. Aquest últim model conserva la simetria i pot explicar de manera senzilla els efectes dels activadors i inhibidors al·lostèrics. Un inhibidor al·lostèric s’uneix preferentment a la forma T, mentre que un activador al·lostèric ho fa preferentment a la forma R. En conseqüència, un inhibidor al·lostèric desplaça l’equilibri conformacional R-T cap a T, mentre que un activador al·lostèric el desplaça cap a R.
D’aquesta manera, un activador al·lostèric augmenta la unió del substrat a l’enzim, mentre que un inhibidor al·lostèric la disminueix.
Regulació per modificació covalent 25 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica Nombrosos enzims estan controlats per la unió reversible de grups fosforil en residus específics de serina i treonina. Les activitats dels enzims que sintetitzen i degraden el glucogen estan coordinades d’aquesta manera. La fosforilació de residus de tirosina en els receptors del factor de creixement constitueix un pas crític per a la inducció de la diferenciació i proliferació cel·lular. Els enzims específics denominats quinases catalitzen la inserció de grups fosforil, mentre que les fosfatases catalitzen la seva separació per hidròlisis.
La fosforilació, el tipus més comú de modificació covalent reversible, és un poderós medi per a controlar l’activitat dels enzims i d’altres proteïnes. Una família de proteïna quinases fosforila específicament a residus de serina i treonina en les proteïnes diana, una altra família de quinases fosforila residus específics de tirosina. Algunes proteïna quinases fosforilen una única proteïna diana, mentre que les proteïna quinases multifuncionals modifiquen covalentment a molts diversos substrats.
Exemple: glucogen fosforilasa (enzim que allibera residus de sucre del glucogen, una reserva d’energia) s’activa per la fosforilació d’un residu específic de serina.
Exemple: tripsina: s’activa per la hidròlisis d’un o uns pocs enllaços peptídics en els seus precursors inactius, denominats zimògens o proenzims.
5. APLICACIONS DELS ENZIMS EN LA INDÚSTRIA En la següent taula observem exemples d’utilització d’enzims en la indústria alimentària: 26 TEMA6. Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Bioquímica 27 ...