TEMA 2. EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES I (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 17
Fecha de subida 22/10/2014
Descargas 27
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 2: EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES I En procariotes la transcripció i la traducció estan acoblades, es donen al mateix lloc. En eucariotes això no passa. El polisoma és el punt en el qual té lloc la transcripció i la traducció.
Tindrem DNA, RNA, ribosomes i polipèptids. La distància és tan petita que podríem dir que es donen alhora.
No tots els gens codifiquen per proteïnes, de manera que ens podem trobar alguns RNA que ja siguin funcionals i no es tradueixin.
ESTRUCTURA DELS GENS BACTERIANS La regió que codifica pel gen en l’mRNA està envoltada per zones anteriors i que no codifiquen per res. El primer codó de traducció es diu inici de traducció (AUG). Al final, com ja se sap, hi ha el codó stop. Hi ha tres codons stop, que es diuen de maneres diferents: - Codó ambar.
Codó ocre.
Codó sèpia.
Si ens hi fixem, tenen el nom de tres colors molt semblants.
La regió inicial de més de mRNA es diu regió líder: hi ha la seqüència RBS (ribosome-binding-site o lloc d’unió del ribosoma). RBS també es pot dir Shine-Dalgarno (pel nom dels científics descobridors d’aquesta seqüència).
El primer nucleòtid de DNA que es transcriu és l’inici de transcripció (que sempre és A o G).
A dins del DNA, per cada un dels gens hi ha dues cadenes (la groga i la taronja al dibuix). La groga és la codificant, que és la que té una seqüència igual que el RNA. L’RNA-polimerasa utilitza la cadena taronja, que és la motlle.
Molts gens són ORF: Open Reading Frame (marc obert de lectura). Tots els ORF són gens, però no tots els gens són ORF.
Hi ha 6 marcs de lectura en qualsevol lloc de DNA: tres per cada cadena (perquè els codons poden començar per un nucleòtid o el del seu costat, i això fa que hi hagi tres combinacions possibles de codons per cadena).
Un ORF és un marc de lectura sense stops: seqüències llargues sense stop, on per tant es poden trobar molts marcs diferents. Estadísticament això és molt poc probable que hi hagi seqüències llargues sense cap codó stop si les bases es posen aleatòriament.
Hi ha virus que en un mateix fragment de DNA podem trobar diferents gens, depenent del marc de lectura amb el que es transcrigui.
La regió promotora està al costat de la codificant, i té dues parts: - -35: es diu així perquè està a 35 pb de la regió codificant. És la regió de reconeixement de la RNA-polimerasa.
-10: o TATA box, està a 10 pb del primer nucleòtid que es transcriu. És la regió d’unió de la RNA-polimerasa.
La regió terminadora permet aturar la RNA-polimerasa, tot i que se’n transcriu una part. El que fa és anar alentint la velocitat d’aquesta fins que es desenganxa. Això fa que l’mRNA es quedi amb una part de la regió terminadora transcrita.
UNITATS TRANSCIPCIONALS Cistró = gen Unitats transcripcionals monocistròniques: Contenen informació de només un gen. El transcrit conté un únic ORF.
Unitats transcripcionals policistròniques: Contenen informació de més d’un gen. En eucariotes no hi ha aquest tipus d’unitats transcripcionals, només als mitocondris (perquè provenen d’un bacteri). En aquestes unitats hi ha ORFs un al costat de l’altre, i tots depenen d’un mateix promotor. Aquest conjunt de gens més el seu promotor formen el que s’anomena un operó. Ex: operó de la lactosa – es troben tots els gens relacionats amb la degradació de la lactosa en una única unitat transcripcional.
Tot i això, en les unitats transcripcionals policistròniques, sempre hi continua havent un RBS (lloc d’unió del ribosoma) per cada gen. Aquesta seqüència uneix el ribosoma i li indica quina és al pauta de lectura del gen, perquè no el llegeixi en un marc de lectura diferent del que ha de ser.
EFECTE POLAR EN LA TRADUCCIÓ En el moment en que es produeix l’RNA i queda accessible un RBS, un ribosoma ja ho reconeix i comença a traduir el producte gènic. És en aquest moment que es forma el polisoma.
El primer gen d’un operó serà el primer a transcriure’s, per tant serà del que sortirà primer un RBS, així que el seu transcrit estarà exposat a ribosomes des de molt més abans que el del segon gen, el tercer o els que hi hagi. Contínuament es van unint ribosomes als RBS que hi ha, encara que hi hagi ribosomes traduint l’mRNA en un altre punt.
Com que el transcrit de tots els gens d’un operó va junt, els ribosomes que tradueixen el transcrit del gen 1, amaguen la seqüència RBS del transcrit del gen 2; i els que tradueixen el 2, amaguen la del 3. Això vol dir que fins que no s’acabi de traduir el gen 1, no podran unir-se ribosomes al gen 2. És més, serà el mateix ribosoma que acabi de traduir el gen 1 que s’unirà a la seqüència RBS del segon i el començarà a traduir.
A més, l’mRNA comença a degradar-se per l’extrem 3’ (que és l’extrem on hi ha el transcrit de l’últim dels gens).
Els ribosomes ajuden a desfer les estructures secundàries que es poden formar en l’RNAm.
Aquestes estructures es creen per la formació de loops. El loops es formen per l’existència de seqüències palindròmiques en la monocadena de RNA. Aquestes estructures amaguen les seqüències RBS, i per tant accentuen l’efecte polar.
Posició de les seqüències - Taronja: stop del primer gen.
Blau: RBS del segon gen.
Verd: inici de traducció del segon gen.
Si RBS (2) està abans del codó stop (1) no passa res, ja que el ribosoma va traduint i li és igual que hi hagi un lloc d’unió, perquè ell ja està unit, així que anirà traduint el gen 1 fins a trobar el codó stop. Llavors es separarà, veurà que més enrere hi havia la RBS (2) i s’hi unirà. Si el marc de lectura del gen 2 és diferent del de l’1, no passarà res perquè ara el ribosoma no veurà el codó stop. Això sabem que ve determinat per RBS, que marca el marc de lectura del gen. Però si el marc de lectura és el mateix, tampoc té importància, perquè fins que el ribosoma no trobi un codó ATG (inici de traducció, codifica per metionina) no es fixarà en els codons que trobi abans, i per tant si hi ha un codó stop no el notarà.
Si ATG (2) està abans de l’stop (1) sí que és important el marc de lectura. Si és el mateix, el gen 2 no serà funcional.
Els gens que es troben en una mateixa unitat policistrònica poden tenir marcs de lectura diferents. Els RBS com a màxim poden determinar tres marcs de lectura diferents de l’RNA.
Hi ha seqüències de RBS amb més afinitat o menys pel ribosoma. Segons això, hi ha millors o pitjors RBS. Això fa que l’efecte polar d’una unitat transcripcional es pugui modular, jugant amb les afinitats de les RBS. Si el millor RBS el té el gen 2, la concentració del seu producte gènic s’acostarà més al del primer gen.
MUTACIONS POLARS (no són el mateix que l’efecte polar) Una mutació en un punt pot afectar a punts colindants. Per exemple, si tenim una mutació sense sentit (passa a codificar per un codó stop) en el primer gen, això variarà en l’efecte polar dels gens 2, 3... El fet que el ribosoma es desuneixi del transcrit del gen 1 pot provocar que no es desfacin les estructures secundàries del transcrit de l’operó, i que llavors els RBS dels altres gens quedin amagats i els ribosomes no s’uneixin per traduir ni el gen 2 ni el 3... Amb la qual cosa s’acabaria tenint molt poc producte gènic dels altres gens, tot i que la mutació només era en el gen 1.
PROMOTORS BACTERIANS Si comparem els promotors de tota una cèl·lula, podem veure quin és el nucleòtid més probable en la primera posició, en la segona... i així podem crear el que s’anomena la seqüència consens: es la seqüència de nucleòtids més probable. Però normalment, la seqüència real d’un promotor no té res a veure amb la seqüència consens.
La seqüència consens, a més, no té perquè ser la òptima de reconeixement de la RNApolimerasa. És simplement una “mitjana” entre les seqüències de tots els promotors.
Hi ha promotors febles i promotors forts. Als febles, la RNA-polimerasa no té una gran afinitat per unir-s’hi, així que pot passar de llarg. Per tant, els gens amb promotors febles es transcriuen poc. En comptes, als forts s’hi uneix sempre i els gens que els tenen es transcriuen molt. Aquest és un exemple de regulació gènica en procariotes.
Totes les espècies no tenen la mateixa seqüència consens per la regió -10 i la -35. Això depèn de la RNA-polimerasa i de moltes altres característiques de la cèl·lula. Per exemple, el contingut en G-C afecta molt a aquestes seqüències: com més G-C hi ha menys probabilitats hi ha que aquestes regions tinguin la seqüència TATA.
Els promotors forts en un organisme potser no són forts en un altre, ja que només són òptims per una RNA-polimerasa concreta. Tot i que no deixarà de fer de promotor, no serà tan bo.
DOS PROMOTORS PER UNITAT TRANSCRIPCIONAL Podem tenir unitats transcripcionals expressades a partir de dos promotors diferents. La RNApolimerasa fa servir un o un altre depenent de les condicions. També pot ser que normalment faci servir un i l’altre sigui com “de reserva”. També pot fer servir els dos alhora (no ben bé alhora però sí molt seguits un de l’altre). Això incrementa els mecanismes de regulació i modulació de l’expressió gènica.
Si els promotors estan solapats, quan funciona un no funciona l’altre, perquè li tapa la regió -35 i una altra RNA-polimerasa no pot reconèixer el segon promotor.
En els casos c i d són dues unitats transcripcionals però els promotors de les dues estan molt junts. De fet, en el cas c estan en regions codificants del gen oposat al qual pertanyen, i en el d estan fora. Tot i això, en els dos casos, si funciona un promotor no pot funcionar l’altre, ja que es tapa la seqüència -35.
En el cas e, si s’activa el promotor 1, es transcriu una unitat policistrònica de dos gens, si s’activa el 2, la unitat és monocistrònica.
Això fa que hi hagi efecte polar quan s’activi el promotor 1, però no quan s’activi el 2.
UPS i DSR Les regions promotores, a part de les seqüències -35 i -10, també tenen UPS (Up-Stream-Region) i DSR (Down-Stream-Region). A UPS i DSR s’hi ancoren els reguladors transcripcionals.
- UPS: en general s’hi ancoren els activadors i moduladors positius, que impulsen la transcripció, per tant n’hi ha més.
DSR: en general s’hi ancoren els repressors i moduladors negatius. El que fan és evitar que la RNA-polimerasa pugui entrar i transcriure el gen. Per tant hi ha menys transcripció.
INICI DE LA TRANSCRIPCIÓ La RNA-polimerasa reconeix la seqüència -35, es mou pel DNA i quan troba la regió -10 finalment s’hi ancora. UPS, abans de la regió -35, reconeix la RNA-polimerasa i l’enganxa, movent-la i mostrant-li la regió -35, de manera que l’ajuda a unir-se al DNA.
El DNA, a més, ha d’estar en una posició concreta, en una torsió, perquè la RNA-polimerasa pugui veure les regions -35 i -10. Hi ha proteïnes que s’associen a aquestes regions del DNA i el posicionen correctament, de manera que promotors febles es poden convertir en forts perquè ara la RNA-polimerasa veu aquestes regions molt millor.
FIS  proteïnes que donen torsió al DNA i tenen afinitat per la RNA-polimerasa. Enganxen la RNA-polimerasa i la posicionen correctament. Sense elles, el promotor seria molt dèbil, una caca.
Si les regions -35 i -10 estan molt separades, el promotor és molt feble, i hi ha poca transcripció. Hi ha unes proteïnes que reconeixen UPS i DSR i fan força sobre el DNA, torsionant-lo perquè les regions -35 i 10 quedin més a prop en l’espai. Llavors la transcripció és molt alta, el promotor ara és bo. Si tallem les bases que separen les dues regions, llavors no són necessàries les proteïnes perquè el promotor sigui fort.
Per tant, la qualitat dels promotors no depèn només de les seqüències que tenen, sinó també de la posició. La cèl·lula utilitza la distància entre les regions -35 i -10 i les proteïnes per fer que el gen es transcrigui quan volen. És un mecanisme de control de l’expressió.
RNA-POLIMERASA En procariotes és un holoenzim. Tots els gens relacionats amb la RNA-polimerasa es diuen rpo(B, c o A).
- Subunitat α: és important per començar la transcripció, ja que interacciona amb el promotor.
Subunitat σ: reconeix la regió -35 i s’uneix a la -10.
Subunitat β: s’uneix als nucleòtids.
Subunitat β’: s’uneix al DNA motlle.
Les subunitats β + β’ + α formen el nucli de la RNA-polimerasa.
Hi ha diferents tipus de subunitat σ que modulen l’expressió gènica. Cada tipus té uns promotors òptims i seqüències consens per unir-se. Llavors, en funció de la subunitat σ que hi hagi en una RNA-polimerasa, aquesta tindrà per òptimes unes regions -35 o unes altres, que serà les que buscarà més.
Si es controla la concentració de cada tipus de subunitat σ en la cèl·lula, es pot controlar quins gens s’expressen més. La proporció de les subunitats σ variarà segons les condicions i el cicle cel·lular, per variar en cada circumstància els gens que s’expressen.
La subunitat σ està unida a l’extrem de la RNA-polimerasa per on surt el mRNA. Això vol dir que si hi està unida el mRNA no pot sortir. Per poder polimeritzar, la RNA-polimerasa no ha de tenir la subunitat σ. Això vol dir que només polimeritza el nucli.
La RNA-polimerasa només pot obrir les cadenes dins seu. Ella mateixa obre les cadenes i les tanca, evita els entortolligaments... És molt diferent del funcionament de la DNA-polimerasa, que necessita que les cadenes estiguin obertes abans, que té les girases i les topoisomerases...
INICI DE LA TRANSCRIPCIÓ La transcripció es fa al voltant del nucleoide. La subunitat σ reconeix la seqüència -35 i situa la resta de subunitats de la RNA-polimerasa a la seqüència -10 perquè s’hi ancorin.
El complex de transcripció al principi està tancat. Passa a estar obert quan els ponts d’hidrogen de la regió -10 es trenquen. Com és una regió rica en A-T és fàcil trencar aquests ponts d’hidrogen. El responsable de sintetitzar el mRNA serà el nucli de l’enzim, i no tot l’holoenzim, és a dir, la subunitat σ no hi participa.
Però com l’espai dins l’RNA-polimerasa és petit, al principi hi ha pocs nucleòtids oberts i la situació és inestable. És necessària mantenir-ho estable i que les dues cadenes de DNA no es tanquin fins que es posin els primers nucleòtids de RNA. Per això és necessari que encara no hagi marxat la subunitat σ. Quan ja s’hagin posat prou nucleòtids de RNA i la RNA-polimerasa pugui començar a avançar la subunitat σ se n’anirà. És més, si la subunitat σ no se n’anés, com fa de tap, l’RNA no podria sortir i la RNA-polimerasa no podria avançar.
ELONGACIÓ DEL TRANSCRIT L’estabilitat de la RNA-polimerasa sobre el DNA és molt alta, si no hi ha res que li impedeixi, transcriu durant molta estona. Si es desenganxa del DNA, no pot tornarse a unir on s’havia desenganxat, ja que necessita la subunitat σ un altre cop per començar, i aquesta només es pot unir a la regió -10, de manera que si es desenganxa, només pot tornar a començar des del principi.
MECANISMES DE FINALITZACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ Necessitem mecanismes per parar l’avanç de la RNA-polimerasa, ja que a causa de la seva estabilitat, podria transcriure més enllà del que li pertoca. Per això hi ha els terminadors transcripcionals. El que fan els terminadors transcripcionals és alentir la RNA-polimerasa, de forma que es tanquin les cadenes de DNA obertes dins el seu nucli abans que les hagi pogut transcriure. Llavors s’ha de desenganxar del DNA, perquè només és capaç de separar les dues cadenes en la regió -10.
MECANISME DE FINALITZACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ RHO-DEPENDENT En aquest mecanisme té un paper clau la proteïna Rho. És una proteïna hexamèrica de subunitats idèntiques en forma d’anell. Pertany a la família de les RNA-DNA helicases, la qual cosa vol dir que pot separa l’RNA del DNA. A més té un domini d’unió al RNA amb molta afinitat.
Aquest domini reconeix seqüències de RNA i alhora pot hidrolitzar RNA. La proteïna Rho s’uneix al principi del transcrit i va circulant per l’RNA fins a atrapar la RNA-polimerasa.
La proteïna Rho s’uneix al RNA en la seva regió d’interacció i va avançant fins arribar a la RNApolimerasa. Llavors fa que vagi més lenta, de manera que es creen loops en el RNA perquè hi ha seqüències palindròmiques. La proteïna Rho estabilitza aquests loops. Alhora, també separa l’RNA del DNA (funció helicasa). Al final fa que l’RNA se separi, i les cadenes de DNA es tanquin abans que la RNA-polimerasa tingui temps de posar-hi més nucleòtids, perquè ara va molt lenta.
Llavors la RNA-polimerasa se’n va.
Efecte polar de la proteïna Rho sobre al transcripció Quan en el transcrit també hi ha ribosomes, és com si Rho hagués de fer cua darrere els ribosomes per avançar per aquest transcrit. Sense ribosomes, l’avanç de Rho és molt més ràpid, amb la qual cosa arriba a la RNA-polimerasa abans que transcrigui del tot l’ORF.
Més ribosomes  RNA-polimerasa ho transcriu tot.
Menys ribosomes  RNA-polimerasa no ho transcriu tot. Això és el que crea l’efecte polar. No hi ha transcrit dels gens més llunyans en l’ORF, de manera que al final només hi ha producte gènic del primer gen. Així un individu pot ser genotípicament wild type, però fenotípicament no perquè no expressa tots els gens.
Si en el primer gen hi ha una mutació sense sentit (codó stop) els ribosomes marxen abans del transcrit, deixant així que la proteïna Rho vagi més ràpida i que la RNA-polimerasa pari abans.
Això incrementa encara més l’efecte polar.
Tot i això, l’efecte polar causat per una mutació sense sentit depèn de la posició d’aquesta mutació amb la següent seqüència RBS. Si estan molt a prop, els ribosomes no se n’aniran, ja que només desenganxar-se del primer stop ja veurien l’RBS del segon gen i s’hi unirien. Així, els ribosomes continuarien traduint, i la proteïna Rho tindria les mateixes dificultats per arribar a la RNA-polimerasa.
MECANISME DE FINALITZACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ RHO-INDEPENDENT Es creen loops en l’RNA molt estables. Es transcriuen regions molt riques en G-C, i que després tenen molt U. Les regions riques en GC són palindròmiques i formen els loops.
Aquests loops intenten sortir de la RNA-polimerasa però creen una mena de tap molt estable. A més, els següents nucleòtids són d’uracil, que creen ponts d’hidrogen molt dèbils amb el DNA i per tant és fàcil desunir el RNA. Les cadenes de DNA tenen més afinitat entre elles que amb l’RNA.
PROCESSAT DE RNA: SÍNTESI DE tRNA i rRNA Els gens que codifiquen per rRNA s’anomenen rrn. Es troben agrupat en unitats transcripcionals policistròniques, de les quals trobem més d’una còpia en el genoma.
En aquest exemple veiem unitats transcripcionals d’rRNA en el genoma d’E. coli: No totes les unitats transcripcionals de rRNA són iguals. A més també són diferents els gens qeu codifiquen per rRNA, ja que n’hi ha que codifiquen per l’RNA 23S, uns altres pel 16S i uns altres pel 5S. I dins aquestes unitats transcripcionals també hi pot haver gens que codifiquin per RNAs de transferència.
Diferents tipus d’unitats transcripcionals rrn.
El transcrit primari surt directament del promotor. Després hi ha unes endonucleases que tallen en llocs precisos per separar els transcrits de cada un dels gens de la unitat transcripcional.
Després hi ha unes exonucleases que treuen els trossos de RNA sobrants de cada un dels fragments resultants de l’acció de les endonucleases, i així s’arriba a tenir el transcrit secundari de tRNA i rRNA.
També hi ha unitats transcripcionals que només codifiquen per tRNAs. En aquest cas també hi ha un transcrit primari, del qual es tallen els diferents tRNAs transcrits amb la endoribonucleasa.
Després una exoribonucleasa elimina la part de transcrit que sobra. El final en el cas del processament dels tRNA és una mica diferent, perquè tots han d’acabar amb la mateixa seqüència, la regió que és reconeguda per l’enzim que carrega l’aminoàcid al tRNA. Però després de l’acció de l’exoribonucleasa alguns tRNA tenen aquesta seqüència i altres no, de manera que es necessita un enzim que durant el processat enganxi aquesta seqüència als tRNA que no la tenen.
CONTROL DE L’OPERÓ rrnB La quantitat de ribosomes que té una cèl·lula és un dels factors que controlen l’expressió dels gens. Els promotors també poden tenir ancorades proteïnes FIS o H-NS que donen torsió al DNA, i així exposen més o menys els promotors a la RNA-polimerasa.
També hi ha una regió discriminatòria dependent de ppGpp (ja s’explicarà més endavant això).
La torsió provocada per FIS és contrària a la de H-NS.
(a) Quan només hi ha FIS ancorada, la torsió del DNA no és molta, de manera que la RNA-polimerasa ho té fàcil per reconèixer el promotor i hi ha molta transcripció. Com més proteïnes FIS hi ha, més fàcil ho té la polimerasa per unir-se al promotor i transcriure.
(b) Quan hi ha proteïnes FIS i H-NS unides alhora la polimerasa encara pot unir-se al promotor però té algunes dificultats, de manera que hi ha poca transcripció.
(c) Quan només interacciona H-NS amb el promotor, la torsió que agafa aquest evita l’accés de la RNA-polimerasa i no hi ha transcripció.
Controlant l’expressió de les proteïnes FIS i H-NS podem controlar la producció de rRNA. Per tant en un medi ric hi haurà moltes proteïnes FIS, per així tenir més ribosomes i que es produeixen moltes proteïnes; mentre que en medis mínims els nivells de proteïnes FIS seran molt baixos, perquè en aquests casos no interessa gastar energia en produir moltes proteïnes que potser no són necessàries.
...