TEMA 4. Replicación y enzimas de replicación. (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2014
Páginas 13
Fecha de subida 17/11/2014
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Apuntes realizados con el material visto a clase y las anotaciones del docente.

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GENÉTICA MOLECULAR Tania Mesa González 2º CURS BIOLOGIA UAB TEMA 4: REPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO Y ENZIMAS DE REPLICACIÓN MODELOS DE REPLICACIÓND EL DNA: Watson y Crick sugirieron que la replicación dependía de la cadena vieja, y en base de esto se propusieron tres modelos para ello:  Semiconservativa  Según esta tesis, las cadenas se abren para duplicarse y sirve de molde. por ello cada célula hija tiene una cadena nueva y otra vieja.
 Conservativa  la célula hija tenía dos cadenas nuevas y las dos viejas.
 Dispersiva  Las cadenas se formaban uniendo trozos de la cadena nueva y de la vieja, que habían sido desestructuradas antes.
Mediante el experimento de Meselson y Stahl se demostró que la replicación del DNA era semiconservativa. En el primer ciclo de replicación descartaron el modelo conservativo y posteriormente eliminaron el dispersivo.
DNA TOPOISOMERASAS: La topoisomerasa es una proteína que puede producir cortes en el DNA y después volverlo a unir.
Por tanto en este paso no son necesarias las ligasas.
 Tipo 1  producen un único corte en la cadena para deshacer el enrollamiento.
a) Topoisomerasas I  E. Coli, Eucariotas.
b) Topoisomerasas III  E. Coli, levadura, humanos.
 Tipo 2  cortan las dos cadenas para desenredarse.
c) Topoisomerasas II  Eucariotas.
d) Topoisomerasas IVn  E. Coli.
CICLO CELULAR La célula pasa por puntos de control para asegurarse de que el ciclo se produce correctamente.
Si no pasa por alguno de estos puntos la célula no se multiplica.
 Fase G1  fase en que crece la célula. Es una fase reversible, que si no pasa el punto de control pasa a G0. Si lo supera correctamente va a la fase S.
 Después de pasar el control G1/S la célula tiene que dividirse.
 Fase S  Se produce la reproducción del DNA.
 Fase G2  La célula se prepara para la mitosis.
 Después de pasar por el control G2/M, pasa a darse la mitosis, con todas sus fases.
 Mitosis  células completamente iguales, porque no hay recombinación.
- Durante la mitosis a veces se produce recombinación “segmentos de recombinación mitótica”, pero es un hecho muy raro.
 Meiosis  células diferentes a causa de la recombinación.
DEMOSTRACIÓN AUTORRADIOGRAFICA DE LA REPLICACIÓN DEL DNA.
Cairns en el 1963 extrajo DNA de E.Cori y marcando las timinas, realizó varias radiografias y observó su estructura.
Observó que había dos puntos en donde se veían que las dos cadenas se separaban, des del origen de replicación = ORIC (Nombre dado para E.Coli). Esta región es rica en A-T, puesto que poseen unos puentes de H más sencillos de reparar que los de C-G, a causa de que son más débiles.
Proceso  El origen de replicación (ORIC) y el TER es conocido como el punto en que se termina el proceso.
Las dos horquillas de replicación, una continua y otra discontinua, avanzan en sentidos contrarios y cuando las dos horquillas han hecho todo el recorrido se encuentran en el TER, y se termina la duplicación. Entonces las dos cadenas quedan unidas hasta que las topoisomerasas, que separa los dos anillos individualmente del DNA, y más adelante convirtiéndolos en DNA circular.
los separa los cierra PROCESO DE REPLICACIÓN DEL DNA: El proceso de replicación del DNA presenta principalmente 2 problemas: 1. La polimerasa actúa siempre en dirección 5’ y 3’, pero las cadenas son antiparalelas.
2. La DNA polimerasa necesita un extremo OH, de un nucleótido, dónde unirse para empezar el proceso.
Cadenas antiparalelas:  Cadena retrasada  es la discontinua.
 Cadena adelantada  es la continua.
Estas cadenas se transcriben a diferente velocidad. La cadena que va de 3’ a 5’ es la adelantada, porque a medida que abre, la polimerasa puede avanzar en el sentido 5’-3’. En cambio la otra cadena tiene que abrir camino e ir transcribiendo a trozos para poder hacerlo en el sentido 5’- 3’.
La polimerasa siempre sintetiza nucleótidos en dirección 5’-3’. Además para empezar siempre necesita un nucleótidos que le proporcione un enlace OH libre. Por tanto en el primer paso va a actuar la primasa, que es una ARNa polimerasa, que es capaz de añadir nucleótidos de RNA, considerados como cebador o primer, de la nada, porque no necesita ningún OH libre.
Después de la actuación de la primasa, ya puede actuar la polimerasa III (cadena continua) Las helicasas son aquellas proteínas que rompen puentes de H, para poder separar las dos cadenas. Una vez la helicasa actúa, si las cadenas no sufren ningún cambio pueden volver a unirse.
 Para evitar esto se interponen las proteínas SSBP, que se unen por unión simple al DNA monocatenario. A medida que la cadena se replica, estas van desapareciendo, para que las cadenas puedan volver a unirse.
A medida que se va abriendo la cadena, la cadena retrasada se va trascribiendo, primero actuando la primasa y después la polimerasa III, hasta llegar al cebador. Una vez llegue allí la polimerasa I, elimina el cebador y sustituye el RNA por DNA.
Los telomeros aparecen en los huecos que deja la polimerasa I al quitar el cebador.
Las polimerasas no pueden crear el enlace fosfodiester, para unir el último nucleótido con el primero del otro fragmento, por ello aparecen las ligasas, que si son capaces de formar este enlace y crear los extremos del DNA.
Las topoisomerasas son enzimas capaces de actuar sobre la topología del ADN, ya sea enredándolo para permitir que se almacene de manera más compacta o desenredándolo para que controle la síntesis de proteínas y para facilitar la replicación del mismo.
El proceso se repite varias veces para ir sintetizando todos los nuevos ADN.
 Fragmentos de Okazaki  es aquel fragmento formado por la cadena de DNA molde y de RNa cebador. Se localiza en la cadena retrasada.
 En la cadena avanzada el cebador es eliminado de igual manera por la polimerasa I, pero en esta no se substituye y deja un hueco, responsable del acortamiento de los telómeros.
ESTRUCTURAS REPLICATIVAS (DNA circular): a) Modelo círculo rodante  modelo de replicación del DNA en los plasmidIos que participan en la conjugación de materia. Los plasmidos se produce el corte de una cadena por una nucleasa, dejando un oH libre.
Este lugar se utiliza como el cebador y entonces da pie a empezar la replicación. Las helicasas abren el circulo y la cadena queda libre.
La cadena discontinua es la que queda libre (alargada), depende de cómo se desenrolle. En la cadena continua no hay primers.
b) Modelo de lazos  es la replicación del DNA mitocondrial y también en cloroplastos, pero en este último caso no está del todo claro. Se separan las dos cadenas, pero hay un origen diferente para la cadena adelantada y para la atrasada. Se replica la cadena contínua y la otra (discontínua) no lo hace hasta que la duplicación de la primera no llega hasta un cierto punto.
REPLICACIÓN DE CROMOSOMAS EN EUCARIOTAS: En eucariotas la velocidad de replicación de la polimerasa es menor que en los procariotas. Pero dicho aspecto, se soluciona con la aparición de distintos puntos de origen de replicación, llamados replicones.
 Cada replicón solo se activa una vez por ciclo celular, por tanto tienen que estar regulado.
 Todos los replicones deben activarse para poder replicar todo el cromosoma.
SÍNTESIS DE DNA: La replicación del DNA eucariota es igual, tiene las dos cadenas. Pero las polimerasas si son diferentes y los primers también se eliminan de forma diferente.
Hay diferentes etapas de la replicación en eucariotas: 1. INICIACIÓN  hay una región del cromosomas que es la que actúa de replicón. (Se producen varios a la vez). La iniciación de la replicación comienza cuando una proteína se convierte en un complejo de 6 proteínas llamado ORC (complejo de reconocimiento del origen del replicón). Este complejo reconoce la zona y se une a él. Una vez se une recluta la Cdc6 y la Cdt11 y se unen. Más adelante, se unen las dos helicasas, Mcm2-7.
Todo ello se llama complejo de preRC, que se localizará en cada replicón.
 De momento NO se ha iniciado la replicación.
Las ciclinas son aquellas que activan con su alta concentración el preRC, ya que si su concentración es baja este complejo anterior no actuará.
En el momento en que se activa la replicación no será posible la formación de nuevos preRC y así de este modo queda la duplicación controlada. Del mismo modo, a bajas concentraciones de ciclina la formación de preRC sigue activa.
2. REPLICACIÓN / ELONGACIÓN Efecto de CdK  Las quinasas DdK y la Cdk (ciclinas), se fosforilan y activan la replicación.
- Las quinasas también fosforilan las helicasas y estas comenzaran a abrir el DNA. De este modo las polimerasas ya pueden empezar a duplicar.
- En el ciclo celular la concentración de Cdk aumenta en la fase S, G2 y la mitosis, mientras que disminuye en G1.
En los eucariotas hay muchas más polimerasas.
a) Polimerasa y  Son homologas de la polimersa II y actúan siempre jutas. Son las enzimas principales.
 Ambas polimerasas necesitan su cebador.
b) Polimerasa α-primasa  se recluta posteriormente. Tiene la actividad RNApolimerasa (primasa) y ADNpolimerasa. Sintetizará el cebador y más adelante los primeros nucleótidos de DNA. Al poco tiempo de sintetizar estos nuleótidos se produce el intercambio polimerasa, por otras más eficaces.
 La polimerasa α tiene una procesividad (incorporación de nucleótidos) baja, por ello es substituida por las Polimerasa Las polimersas y y .
entran en acción, pero para que actúen necesitan el coofactor RF-C (cargador de abrazadera).
- La abrazadera mantiene unidas la cadena antigua con la nueva, va detrás de la polimerasa y es importante para que estas polimerasas tengan una actividad alta.
En ese momento se unen las polimerasas y empieza la duplicación en ambas cadenas a la vez, simplemente que en una de forma continua y en la otra a trocitos.
La RNAsa H (FENH) elimina a los cebadores y la DNA polimerasa , los substituye por DNA: - La ligasa es la que produce el cerrado de este último fragmento.
Control del cargador abrazadera  El cargador de abrazadera recibe ATP y recibe la abrazadera, que se abre para que entren las cadenas de DNA.
- Después se hidroliza el ATP y esta abrazadera se cierra uniendo las dos cadenas.
Activación de replicones  Durante la replicación del DNA se activan los replicones, pero no todos al mismo tiempo. Al finalizar el ciclo, todos habrán sido activados.
A lo largo del cromosoma hay más replicones del que necesita la célula. Estos se activan por si mismos o pasivamente, en el caso de que se active a causa de que los de su lado lo hayan hecho.
a) Replicación activa  se activa el replicón = inició de la replicación.
b) Replicación pasiva  no se activa el replicón por sí solo, sino porque lo hacen los del al lado y siguen con la replicaciones.
Si queda algún replicón sin activarse algunas regiones del cromosoma quedarán de cadena simple y supondría un gran problema y una rotura del cromosoma.
En el replicón aparecen dos horquillas, una a cada lado, puesto que las direcciones se invierten.
Polimerasas en células eucariotas:  Polimerasa α: 5’  3’. Inicia la síntesis DNA, DNA reparador y actividad primasa.
 Polimerasa β: 5’  3’. DNA reparador y recombinación DNA.
 Polimerasa : 5’  3’ / 3’  5’. Replicación y reparación DNA mitocondrial.
 Polimerasa : 5’  3’ / 3’  5’. Síntesis cadena líder, DNA reparador y transició síntesis DNA.
 Polimerasa : 5’  3’ / 3’  5’. Síntesis de la cadena líder.
3. TERMINACIÓN DE LA DUPLICACIÓN: Los cromosomas circulares procarióticos: no presentan problemas porque la estructura theta termina cuando las dos uniones han recorrido totalmente la molécula.
Los cromosomas eucariotas tienen problemas para finalizar la duplicación. Por tanto lo que ocurre es que el cromosoma se va a cortando a medida que va sufriendo ciclos de replicación.
A fruto de que ese trozo no se puede postponer por la Polimerasa , cuando la RNAsaH quita el cebador, queda una cadena más corta. Pero no hay problema porque la cadena molde obtendrá la misma longitud (más corta). Todo este proceso es el que explica el acortamiento de los telómeros.
La telomersa es una enzima, que por una parte está formada de proteínas y por la otra de RNA.
- En las células germinales lo que ocurre es que las telomerasas son capaces de crear DNA a partir de su propio RNA. De este modo se consigue alargar el telómero. Por tanto la telomerasa actúa como transcriptasa inversa y además como cebador de una polimerasa, ya que deja un extremo 3’ OH libre.
- Las secuencias teloméricas están muy conservadas y son repetitivas.
Buncle en T de los telómros  La última parte de monocadena es importante para la formación del telómero. Lo que ocurre es que dicha monocadena se repliega, con ayuda de proteínas, sobre sí misma.
- La proteína TRF1  promueve el plegamiento.
- La proteína TRF2  promueve que la monocadena larga se replegué sobre la otra sellandola.
Finalmente otra serie de proteínas tapizan y refuerzan la formación. El conjunto de proteínas que actúan en este proceso y protegen el telómero se llaman telosoma (Proteínas + DNA).
La formación del bucle T varía en función de las especies.
RESUMEN REPLICACIÓN ADN EUCARIÓTICO: Diferencia con procariotas: - Rondas no solapadas - Existencia de telómeros - Fragmentos de Okazaki más cortos - Velocidad menor - Múltiples orígenes - Control más complejo - Polimerasas distintas: 1. delta y épsilon  la hebra continua y discontínua 2. alfa  síntesis de cebadores 3. beta  reparación DNA 4. gamma replica DNA mitocondrial COHESINAS  Las cohesinas son las que mantienen las cromatidas unidas hasta la anafase.
NUCLEOSOMAS Después de la replicación es importante que se mantengan las modificaciones de las histonas, tal y como estaban previamente a este proceso.
Cuando pasa la horquilla de duplicación, el octámero de histonas se desensambran y algunas histonas van a un nucleosoma de la cadena nueva, mientras que otras se quedan en la cadena vieja. Por tanto hay una reorganización dónde se suplen los huecos con histonas nuevas.
 Los H2A y los H2B (dímero), van juntos, por tanto los dos serán nuevos o viejos.
 Las H3 y las H4 también van siempre juntas y les ocurre lo mismo que a la pareja anterior.
La reorganización cromosómica de las histonas para reorganizar los nucleosomas viene dada por las chaperonas histónicas:  CAF-1  colocan los tetrameris de H3-H4  NAP-1  colocan los dimeros de H2A y H2B Los bromodomonios reconocen la acetilación y los cromodominios reconocen la metilación.
Los bromodomions reconocen las colas de las histonas, entonces la acetiltranferasa acetila la de las histonas viejas. De este modo los nucleosomas acetelidos, sirven para marcar los nucleótidos vecinos. De este modo se produce el sistema de memoria para la organización de las histonas.
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