Proteómica Tema 3 Metaloproteínas (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica e ingeniería de proteínas
Año del apunte 2015
Páginas 38
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 3 Metaloproteínas Como su propio nombre indica, se trata de las proteínas que unen metales. Son muy interesantes por su abundancia, ya que aproximadamente entre un 25 y un 47% de las proteínas contienen metal.
Además, también resultan de gran interés porque se usan como catalizadores.
En estas proteínas los metales son empleados como cofactores que, normalmente, confieren propiedades a las proteínas que los aminoácidos por sí solos no tienen .
Los metales son elementos químicos que pueden formar cationes y enlaces iónicos. Constituyen uno de los grupos principales de elementos, junto con los no metales, los semimetales y los gases nobles.
Son los metales que aparecen recuadrados en rojo en la tabla periódica de la imagen los que podemos encontrar en proteínas: sodio (Na), potasio (K), magnesio (Mg), calcio (Ca), vanadio (V), cromo (Cr), molibdeno (Mo), tungsteno (W), manganeso (Mn), hierro (Fe), cobalto (Co), níquel (Ni), cobre (Cu) y zinc (Zn).
Unidos a las proteínas los metales tienen funciones catalíticas, de estabilización de la estructura, de sensor, de unión a ligandos y de transferencia de electrones. Por otro lado, los metales también tienen interés desde el punto de vista de la nutrición.
Se trata de compuestos esenciales, es decir, no pueden ser sintetizados por el organismo (se deben ingerir a través de la dieta). Es malo si hay déficit de estos metales pero también encontramos efectos negativos sobre la salud en caso de haber un exceso de éstos (toxicidad).
1 Metaloproteínas En la siguiente tabla podemos ver ejemplos de proteínas en las que se ha descrito que necesitan distintos metales y su función. Como podemos comprobar, una misma proteína puede tener más de un metal.
Hay metales raros que han sido descritos en microorganismos de los que no se tiene constancia de haber sido encontrados en mamíferos.
No se sabe exactamente cómo actúan todos estos metales. Por ejemplo, no se conoce a través de qué mecanismos ejerce el cobre sus efectos, solamente se ha visto que, in vivo, tiene una función (potencia la acción de la insulina).
La siguiente gráfica hace referencia exclusivamente a centros catalíticos. En ella aparecen las frecuencias con las que se encuentran los metales (empleados en catálisis) en el organismo.
Como podemos ver, es el magnesio el metal que se encuentra en mayor proporción.
¿Qué determina que un metal se una a proteína determinada? El metal presente en una proteína dependerá de: - Reactividad de los metales hacia los ligandos - Concentración de metales en la célula - Mecanismos de maduración de la proteína - Afinidad de la proteína por el metal, determinada por su estructura primaria y terciaria.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Reactividad de los metales hacia los ligandos Al medir las constantes de afinidad de varios metales por un ligando concreto se ha obtenido el siguiente resultado (mostrado en la gráfica): por lo general, cuanto más grande es el número atómico, mayor reactividad. El metal que aparece como metal más reactivo es el cobre.
La serie Irving-Williams establece un orden de los metales divalentes encontrados más frecuentemente en las proteínas que va desde el menos reactivo hasta el más reactivo.
Si el metal es más reactivo, la proteína lo enganchará más fácilmente. Es decir, el metal entrará más fácilmente en el centro activo. El cobre es el metal más reactivo (de los que se encuentran en las metaloproteínas) pero no es precisamente el más abundante.
Otro factor determinante de la presencia de un metal en una proteína es, por tanto, la concentración de dicho metal en la célula.
Como es lógico, un metal entrará con más facilidad en una proteína si se encuentra a una elevada concentración. Nos interesa conocer la concentración de metal en forma libre, es decir, la concentración de metal que no esté quelado (solo el metal que no esté unido a ninguna proteína se puede unir a una proteína). El metal en forma libre también recibe la denominación de quelable o lábil (ya que es más fácil de movilizar).
La concentración de metal libre es inversamente proporcional a la afinidad de éste por su ligando. Esto se debe a: - Motivo químico: si el metal tiene mucha afinidad por su ligando, se unirá y quedará poco metal libre.
- Motivo biológico: si un metal tiene alta afinidad o es muy reactivo es mejor que esté en baja concentración, ya que si no, se podría unir en cualquier sitio pudiendo ser nocivo para el organismo.
Es por esto por lo que los sistemas biológicos tienen sistemas para mantener a ralla las concentraciones de los metales (sobre todo las de los más reactivos), haciendo además que éstos lleguen donde interesa.
Vamos a tomar como ejemplo el hierro para ver el comportamiento/dinámica de los metales en el organismo.
El hierro en sangre no se encuentra en forma libre, sino que viaja unido a la transferrina. Al llegar a la célula, la transferrina interacciona con su receptor y ambos se internalizan (complejo transferrina+hierro+receptor). El hierro se libera en el citoplasma por lo que, de entrada, forma parte del hierro quelable. Este hierro tiene varios destinos: - Se une a metaloproteínas - Se une a ferritina 3 Metaloproteínas - Unión a metalochaperonas - unen metales para acompañarlos a otras proteínas.
(- También puede volver a salir de la célula mediante el transportador ferroportina) Normalmente, el único hierro que se puede unir a las proteínas es el que se encuentra en forma libre.
Estos mecanismos pueden extrapolarse a cualquier otro metal que pueda asociarse a proteínas.
En la gráfica se muestra la concentración estimada de metales libres en células eucariotas. Podemos ver que la concentración de cobre libre (que era el metal más reactivo) es la más baja. Por lo general, la concentración de metal libre en la célula es inversamente proporcional a la reactividad del metal en cuestión (relación inversa entre la serie de Irving-Williams y la concentración estimada de metales libres en células).
Esto se debe a que, como ya se ha mencionado anteriormente, las células han desarrollado sistemas para disminuir las concentraciones de los metales libres más reactivos.
Este sistema contribuye a la correcta metalación de las proteínas.
Cuando un metal se coloca en un centro metálico que no le corresponde, hablamos de una mismetalación - esto ocurriría si la concentración de los metales más reactivos o enganchosos en forma libre es elevada.
Estrategias de los sistemas biológicos para la correcta metalación de proteínas: - Control de la absorción de los metales al interior de la célula a través de transportadores. Un metal debe atravesar varios compartimentos para encontrarse disponible para la unión a proteínas: como son ingeridos por la dieta, primero son absorbidos en el intestino y atraviesan el enterocito, llegando al torrente sanguíneo. Después, el metal debe llegar hasta la célula y entrar en ella, atravesado la membrana. Además, según cuál es la proteína a la que se debe unir el metal (y en función de la fase de la maduración de ésta se una) el metal debe entrar a los orgánulos (retículo endoplasmático).
Así, se controla la cantidad de metal libre que llega a su destino final.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV - Mecanismos de quelación: disminuyen la concentración de metal libre.
En la quelación de metales son muy importantes las metalochaperonas, que participan en el transporte de metales hacia los orgánulos e interaccionan con las proteínas que se unen a estos metales, participando en la maduración. Es decir, estas proteínas facilitan la llegada del metal a las proteínas que lo necesitan.
Los sistemas de quelación del cobre en la levadura están más o menos bien descritos.
El cobre entra en la célula a través de un transportador (CTR1). Dentro de la célula existen tres metalochaperonas capaces de quelarlo.
- CCS: conduce el cobre hasta SOD1 (superóxido dismutasa), una proteína citosólica muy conservada que utiliza cobre.
- ATOX1: conduce el cobre hasta el retículo citoplasmático (a partir del cual se puede unir a proteínas en síntesis o puede excretarse).
- COX17: conduce el cobre hasta la mitocondria.
También se ha observado que parte del cobre se dirige hacia el núcleo pero no se sabe cómo (no se ha descubierto si para ello emplea alguna metalochaperona).
Estos sistemas probablemente también existan para otros metales enganchosos y, en menor medida, para metales menos reactivos (a pesar de que no se han encontrado o descrito).
Afinidad de la proteína por el metal También tiene influencia a la hora de que un metal se una a una proteína determinada. Viene determinada por los tipos de ligandos y su disposición estructural.
Cuando se purifican proteínas para estudiarlas, lo que normalmente se hace es clonarlas y expresarlas heterólogamente en una bacteria  la proteína que finalmente se purifica es la que ha sido expresada en la bacteria. Es posible que, en el caso de las metaloproteínas, la concentración de metal a la que se ve expuesta la proteína durante su expresión y purificación no sea la misma que en condiciones fisiológicas.
Esto puede provocar una mismetalación de la proteína.
En la afinidad de la proteína por el metal contribuyen: - Estructura primaria de la proteína - tipo de aminoácidos.
- Estructura terciaria - disposición estructural de la proteína.
5 Metaloproteínas Estructura primaria: hay algunos aminoácidos que tienen una mayor capacidad de quelar metales que otros. Estos son sobre todo aspartato y glutamato, que se unen al metal a través de sus grupos carboxilos. En menor medida, también tienen capacidad de quelar metales: histidina (a través de su grupo imidazol), serina, treonina y tirosina (a través de su grupo hidroxilo). COn una contribución más baja triptófano (a través de su grupo indole), metionina (a través del gripo tioéter), asparagina y glutamina también aparecen como ligandos de metales.
Se considera que, los aminoácidos que actúan como ligando, se comportan como bases de Lewis. Es decir, tipo de compuestos que pueden formar un enlace con un ácido de Lewis, que en este caso es el metal, cediendo un par de electrones (aceptados por el ácido de Lewis).
Además, según la teoría de Pearson, se pueden aclasificar los ácidos y bases de Lewis en fuertes y débiles en función de su capacidad de donar y recibir electrones. Esta clasificación puede, por tanto, aplicarse a ligandos y metales.
Se establece la siguiente norma: las bases fuertes prefieren unirse a ácidos fuertes.
Por ejemplo, el calcio, que se considera un metal fuerte (ácido fuerte), tendrá preferencia por ligandos fuertes (bases fuertes) como aminoácidos ácidos.
Dentro de los metales débiles encontramos el cobre. Éstos metales son más fácilmente quelados por aminoácidos suaves como la cisteína.
Esta es la tendencia pero encontramos que no siempre se cumple (a veces aparecen metales fuertes unidos a ácidos débiles y viceversa).
Estructura terciaria - la disposición estructural de los ligandos también influye en la unión a metales.
Si nos fijamos en el ejemplo de la proteína SOD2 (superóxido dismutasa 2) vemos que los cuatro aminoácidos que actúan como ligandos se disponen de tal manera que el metal queda en el centro. Al quedar en esa posición, el metal puede interaccionar con los ligandos que tiene a su alrededor. El número de enlaces de coordinación o coordinaciones que se forman se corresponde con el número de ligandos que puede unir el metal.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Esta estructura tridimensional puede adoptar diversas configuraciones geométricas.
Se encuentran diversas disposiciones que dependen del número de ligandos y de cómo se encuentran colocados.
Por ejemplo, si tres ligandos se encuentran en el mismo plano, estamos ante una estructura trigonal plana.
Cuando tenemos un metal unido a cuatro ligandos hay dos estructuras posibles: si tenemos todos los elementos en un mismo plano estamos ante una estructura cuadrada plana; si por el contrario los átomos que forman el enlace se encuentran en planos distintos (en forma de pirámide), estamos ante una estructura tetraédrica. Es muy común encontrar metales coordinados con cuatro ligandos, por lo que, habitualmente encontramos estas dos estructuras en las metaloproteínas.
La estructura octaédrica es bastante común en muchas proteínas. El metal se encuentra coordinado con seis ligandos en la disposición que se muestra en la imagen (dos pirámides unidas por la base).
Algunos metales pueden presentar más de un estado de oxidación-reducción. El estado de oxidación resulta importante para la transferencia de electrones (formación del enlace).
Normalmente, los metales que forman parte de las metaloproteínas se encuentran en rango -2, -3, -4 (suelen oscilar entre dos estados de oxidación).
Cada metal presenta unos ligandos más habituales y otros menos comunes. También tienen un número de enlaces de coordinación más común, es decir, un número de ligandos que acostumbran a presentar.
7 Metaloproteínas Como ya se ha comentado, un quelante es una molécula con capacidad de unir metales. Son añadidas a muchas soluciones tampón. Los quelantes son los ligandos del metal y pueden clasificarse en función del número de pares de electrones disponible para coordinar metales (electrones que pueden ceder): Monodentados: tienen una pareja de electrones disponibles, por lo que formarán un solo enlace.
Bidentados: formarán dos enlaces de coordinación.
Polidentados: acostumbran a ser quelantes más fuertes ya que formarán múltiples enlaces.
Qué tipo de ENLACE encontramos en las metaloproteínas El metal se encuentra unido a los ligandos mediante un tipo de enlace especial: el enlace de coordinación o ENLACE COVALENTE DATIVO. Se trata de un enlace covalente entre dos átomos en el que el par de electrones que forma el enlace provienen del mismo átomo . En este caso, es el ligando el que aporta los dos electrones.
Se trata de un enlace más débil que un enlace covalente habitual. Al desnaturalizar la proteína, este enlace habitualmente se rompe ya que no es lo suficientemente fuerte/estable para resistir la pérdida de la estructura terciaria.
Las propiedades del enlace sirven para entender las ayudas espectroscópicas para identificar metaloproteínas.
Estructura atómica Inicialmente, el modelo era puramente electrostático - Crystal Field Theory. Los iones del ligando eran cargas que interactuaban con los cinco orbitales d del ion central. Este modelo describía parte de las propiedades de los complejos de coordinación pero no describía el enlace.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La hipótesis que se aceptó más adelante es la Ligand Field Theory que integra la idea de los orbitales moleculares. Los electrones de un átomo se encuentran situados en un lugar indeterminado (espacio probabilístico), el orbital. No puede haber más de dos orbitales por electrón y los electrones no pueden tener más de un espín.
Inicialmente, los primeros modelos teóricos de la coordinación entre ligandos y metales consideran que el metal está envuelto de ligandos que, en principio serán más ricos en electrones. El hecho de que estén rodeados de ligandos, hace que se reorganicen los niveles energéticos de los orbitales d (ya que los orbitales quedan situados de forma diferente). Es decir, se produce lo que se conoce como un splitting de los orbitales d. Algunos de estos orbitales tendrán un nivel energético superior, ya que son más fuertemente repelidos por los ligandos.
Estos orbitales acaban conteniendo los electrones que ya tenía el átomo más los electrones de los ligandos. Todos los fenómenos ópticos que se producen en las metaloproteínas (empleados para la detección) se deben a el movimiento de los electrones por los orbitales.
Al irradiar con luz a una determinada longitud de onda el electrón puede saltar a un nivel energético superior. Esta idea describe bastante bien todos los fenómenos que se producen al irradiar con ondas electromagnéticas los complejos ligando-metal pero no acaba de explicar por qué estos complejos se mantienen unidos.
Actualmente, se acepta la teoría de los orbitales moleculares: cuando los dos átomos deben formar un enlace cada uno aporta su orbital (1s) - éstos se combinan entre ellos para dar lugar a dos nuevos orbitales: - Orbital bonding - de bajo nivel energético, que permite la formación del enlace (favorece la unión).
- Orbital anti-bonding - orbital de alto nivel energético, que no permite la formación del enlace.
Los electrones que aporta cada átomo se van a estos nuevos orbitales, en principio a los de menos energía (en la zona bonding).
Si los electrones que aportan los dos átomos van al orbital bonding se forma el enlace ; si por el contrario, los electrones se sitúan en el orbital anti-bonding se deshace. Cuando el orbital bonding y el anti-bonding tienen la misma cantidad de electrones, no se forma el enlace.
Los orbitales se llenan en base a su energía, por lo que los primeros en llenarse serán los bonding, que son los menos energéticos. Si los electrones son suficientes, también se llenarán los orbitales antibonding, pudiendo romperse la interacción si la cantidad de electrones en ambos orbitales se iguala.
9 Metaloproteínas El ligando tiene sus orbitales llenos de electrones mientras que los del metal están semivacíos (tienen pocos electrones).
A continuación, vamos a explicar este fenómeno con un metal coordinado por seis ligandos complejo ligando metal octaédrico. El metal puede aportar diversos orbitales; en este caso, aporta nueve orbitales mientras que cada ligando aporta un orbital (seis en total). Cuando se forma el complejo, tenemos 15 orbitales que se reorganizan en: seis orbitales bonding (energéticamente más bajos), seis orbitales anti-bonding y tres orbitales non-bonding (estado intermedio). Es decir, al producirse la unión, se produce la remodelación de los niveles energéticos de los orbitales de ligando y metal. En la reorganización quedan orbitales en la zona intermedia (non-bonding) parcialmente desocupados.
De todos los electrones, los aportados por el ligando se sitúan en bonding y los aportados por el metal se sitúan en anti-bonding (se encuentran en non-bonding y en anti-bonding).
Los electrones se irán moviendo entre los orbitales en función de las radiaciones o impulsos que demos a la molécula. Así, se da lugar a los fenómenos que observamos en los complejos ligando-metal.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV HEMOPROTEÍNAS Son las metaloproteínas que ofrecen una mayor variedad a la hora de enlazar un metal. Presentan como grupo prostético un grupo hemo, que consiste en un átomo de hierro coordinado en el medio de una molécula de porfirina (se le llama porfirina cuando no está unida al hierro, sino ya es hemo).
El hierro puede formar hasta seis enlaces de coordinación: - Cuatro enlaces con la porfirina.
- Dos enlaces adicionales con otros ligandos. Por lo general, el hierro coordina por un lado con la cadena lateral de un aminoácido y por el otro suele coordinarse con el sustrato de la proteína, con un ligando, etc.
Espacialmente, el átomo de hierro queda más o menos en el mismo plano que la porfirina, mientras que los otros dos enlaces quedan perpendiculares a este plano (a la porfirina).
Se trata de una coordinación de tipo octaédrica (dos pirámides unidas por la base).
Existen diversos tipos de grupo hemo, que se diferencian en la porfirina. Los más comunes son los siguientes: - Hemo a. Se encuentra por ejemplo en la citocromo C oxidasa - Hemo b - es el más simple. Tiene protoporfirina IX. Podemos encontrarlo en el citocromo b o en la hemoglobina.
- Hemo c - se une covalentemente a la proteína a través de dos cisteínas de la proteína. Es el único unido covalentemente a la proteína. Podemos encontrarlo en el citocromo c.
Mientras el hemo c se une a la proteína de manera covalente, los grupos hemo a y hemo b se unen a la proteína mediante una unión no covalente.
 11 Metaloproteínas Biosíntesis del grupo hemo El grupo hemo es un grupo prostético que puede sintetizarse a partir de succinato, succinil CoA y glicina. Su síntesis es catalizada por una serie de enzimas en el citosol y en la mitocondria. La síntesis comienza en la mitocondria, a partir del succinil CoA, continúa en el citosol y su fase final se produce en la mitocondria. Por tanto, cuando hay alteraciones mitocondriales, la síntesis del hemo puede verse afectada.
El último paso es la entrada del hierro en la protoporfirina, catalizada por la enzima ferroquelatasa.
FUNCIONES DEL GRUPO HEMO Transferencia de electrones Las proteínas pueden ser reducidas y oxidadas pero lo son a dos electrones. Esto no es útil para las reacciones del organismo, que necesitan reducción y oxidación a un electrón.
Los aminoácidos aromáticos son los únicos capaces de reducir y oxidar a un electrón, pero no con el potencial redox adecuado.
Por tanto, las proteínas buscan la colaboración de grupos protéticos que les den la capacidad de reducir y oxidar a un potencial adecuado.
El grupo hemo es potencialmente óptimo para reacciones redox.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El grupo hemo puede reducirse y oxidarse para transportar electrones, por tanto, puede variar su estado de oxidación según interese.
Los citocromos de la cadena de transporte de electrones utilizan el hierro para transferir electrones.
Función catalítica El grupo hemo realiza está función cuando se encuentra en el centro activo de las enzimas.
La catalasa, por ejemplo, incluye este grupo prostético en su centro activo. Se trata de una enzima altamente conservada de cuatro subunidades y un grupo hemo. El 5º enlace de coordinación que puede formar el hierro (hay que recordar que los cuatro primeros enlaces corresponden a la unión con la porfirina) es un enlace con una tirosina de la proteína, quedando un enlace de coordinación libre al que se unirá el sustrato de la enzima (6º enlace de coordinación).
La catalasa cataliza la siguiente reacción: La molécula de H2O2 entra en el grupo hemo y se coordina con el hierro (6º enlace de coordinación). El hierro transfiere un electrón al H2O2, oxidándose. Así, queda un átomo de oxígeno en el hierro y se libera H2O. Posteriormente, entra otra molécula de H2O2 que cede un electrón al hierro (que se encontraba oxidado - Fe+2). El hierro vuelve a su estado original (Fe+3) y se libera la molécula de oxígeno que se encontraba unida a él y otra molécula de H2O (derivada del H2O2 que se ha oxidado).
Por tanto, el proceso que realiza el grupo hemo es el siguiente: Fe+3 cede un electrón oxidándose a Fe+4 y posteriormente, gracias a la segunda molécula de H2O2 que entra, se produce la reacción inversa: el Fe+4 se reduce a Fe+3.
El hierro es muy utilizado por la metaloproteínas pero presente un problema: tiene alta reactividad en ambientes aeróbicos y puede dar reacciones no deseadas.
13 Metaloproteínas Unión O2, transporte y almacenaje de oxígeno en los tejidos El grupo hemo es el responsable de que la hemoglobina y la mioglobina puedan unir oxígeno.
Se considera que un 75% del hierro presente en el organismo está formando parte de la hemoglobina. En los eritrocitos, la hemoglobina une el oxígeno y permite transportarlo. La mioglobina la encontramos a nivel de los tejidos y actúa como una reserva de oxígeno, aunque no queda muy claro si es realmente importante para el funcionamiento del organismo (ratones knock out de esta proteína viven perfectamente sin ningún síntoma aparente).
La solubilidad del oxígeno en agua es muy baja, por lo que es necesario un transportador para que ésta pueda ser transportada en sangre  el grupo hemo de la hemoglobina ejerce esta función. Esta proteína, como veremos más adelante, permite modular la afinidad por el oxígeno y el ritmo de transporte de transporte además de reducir la toxicidad del oxígeno.
MIOGLOBINA Es una proteína monomérica formada por hélices α. Contiene un solo grupo hemo en el que el hierro está coordinado con la porfirina (que ocupa cuatro enlaces de coordinación) y con una histidina (5º enlace de coordinación). El 6º enlace de coordinación es ocupado por el oxígeno.
En la cavidad donde se encuentra el oxígeno podemos encontrar otra histidina (His E7), que no interacciona directamente ni con el O2 ni con el grupo hemo. Esta es la histidina distal, que contribuye a modular la afinidad del hemo por el O2.
El monóxido de carbono (CO) presenta una gran afinidad por el hemo, mucho mayor que la afinidad que tiene el O2 por este grupo prostético. Sin la presencia de esta histidina, la afinidad del hemo por el CO es 2000 veces superior que la afinidad por el O2.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Cuando la histidina está en la cavidad, molesta a la unión del CO ya que, como puede verse en la imagen, el CO se coloca en una posición perpendicular  la histidina interfiere en esta colocación. Sin embargo, la histidina no molesta demasiado en la colocación del O2.
Esto se traduce en que, en presencia de histidina, la afinidad del hemo por el CO es tan solo 200 veces mayor que por el O2. A las concentraciones a las que encontramos el CO normalmente en el organismo, esto no es relevante (aunque sí puede suponer un problema si se ve aumentada la concentración del CO en el organismo).
En el entorno del grupo hemo, encontramos mayoritariamente aminoácidos hidrofóbicos (salvo estas histidinas), por lo que el oxígeno queda en una cápsula hidrofóbica. Este entorno hidrofóbico sirve para evitar que se den reacciones en las que se puedan formar radicales libres (como las que se muestran en la imagen). Es decir, la presencia de aminoácidos hidrofóbicos evita la oxidación del grupo hemo y la formación de O2-.
 Si el oxígeno estuviera en un ambiente polar, reaccionaría con el hierro +2 para dar lugar a O 2-, una especie reactiva tóxica. A pesar de todo, los eritrocitos tienen capacidad de detoxificar en caso de que se forme esta especie reactiva del oxígeno.
Cinética de unión al oxígeno de la mioglobina En la curva de la imagen se muestra la cinética de unión al oxígeno que presenta esta proteína - sigue una curva hiperbólica.
A la concentración a la que encontramos el oxígeno en los tejidos, la mioglobina está próxima a la saturación. Por el contrario, si estamos en situación de isquemia, la mioglobina perderá el oxígeno. La afinidad de la mioglobina por el sustrato no varía en función de la concentración de éste (como sí ocurre con la hemoglobina).
15 Metaloproteínas Las funciones de la mioglobina son actúan como reserva de oxígeno y mejorar la difusión del oxígeno de la sangre a los tejidos.
La citocromo oxidasa de la mitocondria tiene gran afinidad por la mioglobina, lo que facilita que el oxígeno vaya circulando de un sitio a otro.
* El contenido en mioglobina es el principal responsable del color de la carne.
HEMOGLOBINA Se trata de una hemoglobina formada por cuatro subunidades, cada una de las cuales es muy similar a la mioglobina - tienen secuencia muy similar y prácticamente el mismo plegamiento. Por tanto, cada subunidad presenta un gripo hemo.
A pesar de tratarse de un tetrámero, las cuatro subunidades no son exactamente iguales: presenta dos subunidades α y dos subunidades β.
La principal diferencia respecto a la mioglobina es la cantidad de subunidades, que le confiere la capacidad de modular su afinidad por el oxígeno mediante el fenómeno conocido como cooperatividad o alosterismo. A bajas concentraciones de oxígeno, la hemoglobina tiene poca afinidad, pero a elevadas concentraciones, la afinidad aumenta mucho.
Cabe destacar que existen dos tipos distintos de alosterismo: - Homoalosterismo o cooperatividad: es la propia unión al sustrato la que provoca un cambio en la afinidad por el mismo sustrato.
- Heteroalosterismo: son compuestos diferentes al sustrato los que se unen a lugares diferentes del centro activo y provocan cambios en la afinidad por el sustrato.
 La afinidad de la hemoglobina por el oxígeno varía en función de la PO2.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Podemos encontrar la hemoglobina en dos conformaciones diferentes: - Forma tensa (T): de baja afinidad por el oxígeno. Presenta, como podemos ver en a imagen, una pequeña cavidad.
- Forma relajada (R): de alta afinidad por el oxígeno.
Cinética de la hemoglobina La hemoglobina presenta una curva de unión al oxígeno sigmoidal debida a los dos tipos de conformaciones que presentan afinidades distintas por el O2. Como ya se ha comentado, a bajas PO2 la hemoglobina está en forma tensa o de baja afinidad, mientras que a altas PO2, la hemoglobina se encuentra en forma relajada o de alta afinidad.
Esto puede observarse en la representación de Hill, donde tenemos en el eje de las X la concentración de sustrato y en el eje de las Y el cociente entre oxihemoglobina/desoxihemoglobina.
P50 de la forma R Pendiente máxima  Nº de Hill P50 de la forma T 17 Metaloproteínas La recta inferior representa la cinética correspondiente a la forma tensa (T) mientras que la recta superior representa la cinética de la forma relajada (R). La recta real presenta la cinética de la forma tensa a bajas PO2 y la cinética de la forma relajada a altas PO2. Por tanto, esta representación permite medir el comportamiento alostérico de las proteínas.
A partir de estas rectas podemos deducir el grado de alosterismo mediante el número de Hill - medida del grado de alosterismo (es la pendiente máxima). Cuanto mayor es el número de Hill, mayor es la pendiente, es decir, la transición es más rápida lo que indica un fuerte efecto alostérico (el enzima tiene un alosterismo muy marcado). Cuando no hay alosterismo, el Nº de Hill = 1, es decir, la enzima sigue la cinética de Michaelis Menten (como es el caso de la mioglobina).
También podemos extraer las constantes de afinidad. La P50 es aquella concentración a la cual el 50% de la proteína está oxigenada (ocupada). Es una medida equivalente a la km de una enzima. Cuanto menor es la P50, mayor es la afinidad de la proteína por el O2.
La PO2 del organismo se mueve en el rango en el cual se produce la transición de hemoglobina en forma T a hemoglobina en forma R. A nivel de los pulmones, donde hay una PO2 mayor, encontramos hemoglobina en forma R (se carga al máximo de O2 para distribuir por el organismo). En cambio, en los tejidos, donde se debe descargar el O2, la hemoglobina se encuentran en forma T.
Transición de forma T a forma R La hemoglobina es un tetrámero pero, en cierta manera, se considera que es un dímero de dímeros ya que tiene dos subunidades α y dos subunidades β. Cuando se produce el cambio de conformación, una mitad de la molécula gira sobre la otra.
Mecanismo bioquímico Como ya se ha dicho, la proteína se une al grupo hemo mediante la histidina proximal, que a su vez está conectada con una hélice α llamada hélice F.
Cuando no hay oxígeno, el grupo hemo solo tiene ocupado uno de los dos enlaces de coordinación (de los 6 que puede formar el hierro, 4 los ocupa el anillo de porfirina), lo que provoca que el grupo hemo se curve.
Cuando se coloca una molécula de O2 ocupando este enlace de coordinación, el grupo hemo se estira, afectando también a la histidina proximal. El movimiento de la histidina hace que la hélice F (a la que se encuentra unida) se desplace también. Es decir, la unión del oxígeno "tira" de la histidina proximal y con ella, de toda la hélice F.
18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Un ácido aspártico es el aminoácido de la hélice F que forma un puente salino con la histidina proximal (es decir, es el nexo de unión entre la histidina y la hélice F). Además de esto, la zona de la hélice F contiene una serie de puentes salinos. Se considera que son estos puentes los que estabilizan la forma T.
Cuando el hemo se une al O2, se produce un movimiento que hace que el puente salino que une el aspártico con la histidina proximal se rompa (se separa la hélice F del grupo hemo). Como el grupo hemo (junto con la histidina) se estira, tira de la hélice F, no pudiendo soportar el enlace esta fuerza y rompiéndose. Se produce un efecto dominó, que acaba rompiendo todos los puentes salinos de la zona, alterando la estructura  una mitad de la molécula acaba girando sobre la otra.
La nueva conformación hace que la molécula tenga mucha más afinidad por el oxígeno, ya que facilita la entrada de la molécula.
Por tanto, se trata de un ejemplo de homoalosterismo, ya que es el propio oxígeno el que provoca que se produzca el cambio conformacional.
Como ya se ha comentado, puede diferenciarse otro tipo de alosterismo en el que, compuestos distintos al sustrato se unen a sitios distintos del centro activo y provocan cambios en afinidad por el sustrato heteroalosterismo.
19 Metaloproteínas Se produce un equilibrio entre la forma T y la forma R de la hemoglobina.
Hay tres factores alostéricos que favorecen el cambio de R a T, es decir, se trata de factores que modulan a la baja la afinidad.
pH Respecto al pH se produce lo que comúnmente se conoce como Efecto Bohr: Para que los puentes salinos que se producen entre la histidina proximal y el ácido aspártico de la hélice F tengan lugar, la histidina debe estar protonada (carga +). Generalmente, los aminoácidos tienen equilibrios ácido-base en sus cadenas laterales. El pkA es el pH en el cual el 50% de la molécula se encuentra en forma protonada. En el caso de la histidina, su pka es bastante próximo al pH fisiológico de la sangre.
En torno al pka, pequeños cambios de pH provocan diferencias en el grado de protonación.
En síntesis, el pH de la sangre es muy similar a la pka de la histidina. Esto implica que, cuando la hemoglobina se encuentra en la sangre, el 50% de sus histidinas F8 se encuentran protonadas  cuando la histidina está protonada es más fácil que se pueda formar el puente salino con al aspártico de la hélice F hemoglobina en forma T. Por tanto, cuando la hemoglobina se encuentra circulando en sangre, alrededor del 50% de sus moléculas verán favorecida la disposición en forma T y el otro 50% verá favorecida la conformación en forma R.
Al entrar la hemoglobina en los tejidos, cambia el pH, por lo que se altera este equilibrio (como bien puede verse en la gráfica).
 A pH bajos, la afinidad de la hemoglobina es menor. En el organismo, el pH es más bajo en situaciones de demanda de oxígeno.
 A pH altos, la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno aumenta.
20 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CO2 El efecto del CO2 sobre la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno es doble: - Al reaccionar con agua, el CO2 forma bicarbonato y libera protones, haciendo que disminuya el pH (el CO2 también causa de manera indirecta el efecto Bohr).
- Reacciona con los extremos amino-terminal de las cadenas α de la hemoglobina, provocando que parte del CO2 se trasporte en la hemoglobina y que, una parte de la molécula adquiera carga - y forme puentes salinos, estabilizando la forma T.
Estos dos efectos (uno directo y el otro indirecto) afectan a la función de la hemoglobina.
- En los tejidos: como consecuencia del metabolismo, hay una elevada producción de CO2, que se une a la hemoglobina y hará que el pH de los capilares disminuya. Todo esto favorece la forma T, por lo que se libera oxígeno.
- En los pulmones ocurre justo lo contrario. El CO2 se elimina y, para restaurar esta pérdida, se captan protones formándose CO2 y aumentando el pH.
Así, se favorece la forma R de la hemoglobina y, por tanto, la captación de O2.
Efecto combinado de CO2 y pH en respuesta a demandas altas de oxígeno Al realizar ejercicio (demanda de oxígeno) se produce un efecto combinado de CO2 y pH. Con el esfuerzo físico, se activa el metabolismo anaeróbico (se produce ácido láctico) y aumenta el CO2. Como resultado, el pH de los capilares baja y el CO2 se une a la hemoglobina, favoreciendo la forma T. Por tanto, se libera una mayor cantidad de oxígeno en los capilares.
21 Metaloproteínas 2,3-Bisfosfoglicerato El 2,3 bisfosfoglicerato es una pequeña molécula que se genera como producto colateral de la glucosa. Está presente en concentraciones relativamente altas en el eritrocito.
Esta molécula puede colocarse (se une de forma iónica) entre las dos subunidades (diferentes) de la hemoglobina, en una pequeña abertura de la forma tensa. Es decir, solo puede unirse cuando la proteína está en esta conformación. Cuando esta molécula se encuentra en la proteína, es más difícil que se produzca la transición de forma T a forma R (en la forma R esta molécula no se puede colocar).
Por tanto, hay una relación inversa entre la unión del bisfosfoglicerato y la unión de oxígeno.
La regulación de la unión del oxígeno a la hemoglobina por parte del 2,3 bisfosfoglicerato juega un papel importante en el desarrollo fetal. Como ya sabemos, los fetos tienen una hemoglobina especial de mayor afinidad por el oxígeno, la hemoglobina fetal. Esta hemoglobina tiene, en lugar de subunidades β, subunidades γ. La afinidad de la hemoglobina fetal por el oxígeno es mayor que la afinidad de la hemoglobina de la madre (hemoglobina adulta), hecho que favorece el paso de oxígeno de la madre al feto. La diferencia de afinidad entre ambos tipos de hemoglobina se debe a la presencia de bisfosfoglicerato.
Las subunidades γ tienen, como mínimo, un aminoácido distinto: la Histidina 143 está sustituida por una Serina. Esta histidina es importante para estabilizar la unión del bisfosfoglicerato. Al estar esta histidina en la Hb adulta y no en la fetal, implica que la Hb adulta une más bisfosfoglicerato por lo que el cambio a forma T se encuentra favorecido (respecto a la Hb fetal). Por el contrario, la serina es polar, por lo que disminuye la afinidad por el bisfosfoglicerato.
El bisfosfoglicerato también disminuye la afinidad de la Hb fetal, pero este efecto es mucho más acusado en la hemoglobina adulta.
22 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En la gráfica podemos ver qué ocurre con la hemoglobina a distintas PO2. Como ya se ha dicho, el bisfosfoglicerato solo se une a la forma T, es decir, cuando no hay oxígeno. Por tanto, a bajas PO2 podemos encontrar más bisfosfoglicerato unido a la Hb.
El aumento de la concentración de bisfosfoglicerato mejora la adaptación a la altura.
En un ser humano sano a nivel del mar, la unión de oxígeno a la hemoglobina es regulada de forma que, la cantidad de oxígeno liberada en los tejidos equivale aproximadamente al 40% del máximo que podría ser transportado por sangre.
En cambio, si la misma persona sana se traslada a 4500 metros de altitud, donde la presión de oxígeno es bastante menor, se ve reducida la liberación de oxígeno a los teiidos. No obstante, la concentración de bisfosfoglicerato en sangre aumenta, conduciendo a la disminución de la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno. Este ajuste tiene un efecto muy pequeño pero, por el contrario, afecta de manera importante a la liberación de oxígeno en los tejidos. Como resultado, la liberación de oxígeno en los tejidos vuelve a ser casi del 40% de que puede ser transportado en sangre.
PROTEÍNAS HIERRO-AZUFRE Se trata de otro tipo de proteínas cuyos grupo prostético es un centro metálico Hierro-Azufre. El hierro se encuentra coordinado a la proteína junto con un átomo de azufre.
Hay varios tipos aunque los más comunes son los siguientes: - Mononuclear o tipo Rubredoxina - es el más simple. Consiste en un átomo de hierro coordinado con cuatro cisteínas, que aportan los átomos de azufre (es, por tanto, azufre orgánico).
- [2Fe2S] - se trata de una estructura con forma de rombo que dos átomos de Fe y dos átomos de S, en este caso inorgánico. La coordinación con la proteína se hace a través de los átomos de hierro, ya que cada uno puede tener dos ligandos proteicos - el más común es la cisteína.
- [4Fe4S], este centro metálico tiene forma de cubo y está formado por cuatro átomos de Fe y cuatro átomos de S inorgánico. Esta coordinado con la proteína a través de los átomos de hierro  cada átomo presenta un ligando. Son muy comunes las cisteínas.
De entrada estos centros necesitan cuatro ligandos, por lo que hay cuatro aminoácidos implicados.
23 Metaloproteínas Los centros hierro-azufre pueden presentar diversos estados de reducción y oxidación.
El centro [2Fe2S] puede encontrarse en dos situaciones con un electrón de diferencia: [2Fe2S]+1 y [2Fe2S]+2.
El centro [4Fe4S] puede presentar 3 estados: [4Fe4S]+1, [4Fe4S]+2 y [4Fe4S]+3, también con un electrón de diferencia.
Normalmente, en una misma proteína solo oscilan entre dos de estos estados redox. Raramente se ven proteínas en las que puedan encontrarse los tres estados.
En algunas ocasiones, los ligandos pueden ser histidinas, moléculas de agua, sustratos de la enzima, … Los centros 2Fe2S unidos a dos histidinas y a dos cisteínas fueron descritos en las proteínas Rieske, que se encuentran en las cadenas de transporte de electrones. Es por esto por lo que a los centros [2Fe2S] también se les llama centros Rieske.
FUNCIONES DE LOS CENTROS Fe-S Generalmente, estos centros tienen tres funciones distintas: Transferencia de electrones Muchos de los complejos que intervienen en las cadenas de transporte de electrones tienen proteínas con subunidades con centros Fe-S. Por ejemplo, SQR de E. Coli. La subunidad SdhA tiene una flavina. Los electrones pasan de la flavina a estos centros hasta llegar al lugar de unión de la ubiquinona.
24 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Otro ejemplo es el Complejo I de Termus Thermophilus. Tiene una región transmembrana que permite bombear protones. Es en la región transmembrana en las que se encuentran los centros Fe-S que también contribuyen al transporte de los electrones: los electrones llegan hasta el lugar de unión de la quinona. El paso de los electrones provoca cambios conformacionales en la región transmembrana que favorecen el bombeo de protones.
Función catalítica Se trata de un tipo de catálisis relativamente rara en mamíferos, ya que la mayoría de enzimas catalíticas que llevan a cabo reacciones como esta han incorporado otros metales. Hay algunas enzimas que aún conservan este centro - son débiles y sensibles al O2.
Aconitasa Convierte el citrato en isocitrato usando como intermediario aconitato. El citrato interacciona con el centro Fe-S (con un enlace del hierro no coordinado con las tres cisteínas) que favorece que se produzca el fenómeno de isomerización.
25 Metaloproteínas Sensores Por ejemplo, los organismos procariotas tienen la proteína FNR (relativamente simple) con un lugar de unión al DNA y un lugar que actúa como sensor con un centro Fe-S.
En función de la concentración de O2 del medio, se activan una serie de genes.
Cuando no hay O2, la proteína, con un centro 4Fe4S es un factor de transcripción activo que activa genes necesarios para crecer sin O2.
En presencia de O2, éste reacciona con el centro Fe-S y promueve la descomposición hacia centro 2Fe2S, inactivando la proteína.
En mamíferos también encontramos sensores como éste. Por ejemplo, un sensor que regula los niveles de hierro intracelular. La responsable de esta regulación es la proteína aconitasa citosólica (los mamíferos tenemos dos aconitasas, una citosólica y una mitocondrial, que participa más en el ciclo de Krebs).
Aparte de poder catalizar la isomerización del citrato a isocitrato, la aconitasa citosólica tiene funciones adicionales: su centro Fe-S actúa como sensor de diversos factores, entre ellos el hierro.
Cuando hay niveles de hierro insuficientes, el centro Fe-S se desestabiliza y la proteína cambia de conformación, pasando a una conformación más abierta. Se convierte en IRP1, la proteína de respuesta a hierro, que se une a regiones del mRNA y modula su estabilidad. Se une a las secuencias IRE (Iron Responding Elements).
26 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Se sabe que hay proteínas relacionadas con el metabolismo del hierro cuyos mRNA contienen regiones IRE en el 3' o bien en el 5': - Receptor de transferrina: garantiza la captación de transferrina que tienen unida el Fe  garantiza que entre Fe en la célula.
- Ferritina: proteína de almacenaje del Fe cuya expresión aumenta en situaciones de exceso de este metal.
Como ya hemos dicho, los mRNAs que codifican para estas proteínas tienen IIREs: Las proteínas que tienen que expresarse en ausencia de Fe (receptor de transferrina) tendrán los IREs en el 3'.
Las proteínas que deben disminuir su expresión en ausencia de Fe (ferritina) tendrán los IREs en el 5'.
Cuando caen los niveles de Fe en el organismos, aparece IRP1 (que proviene de la aconitasa en situación de falta de Fe) que se engancha a la secuencia IRE:  Si la secuencia IRE se encuentra en el 3', IRP1 estabiliza el mRNA evitando su degradación, por lo que aumentan los niveles de expresión. En ausencia de IRP1, el mRNA puede ser degradado por endonucleasas (la degradación de la RNAasa comienza por el 3') ya que sin IRP1 pueden unirse al 3'.
 Si la secuencia IRE se encuentra en el extremo 5', IRP1 bloquea su traducción (no permite que se una la maquinaria de traducción), por lo que disminuye la expresión de la proteína.
Metabolismo del hierro El hierro en el organismo se encuentra en homeostasis. Debe haber un equilibrio entre el hierro que se absorbe, el hierro que circula unido a la transferrina y el hierro que se encuentra en eritrocitos y macrófagos. Cuando hay un exceso de hierro, éste se almacena en el hígado.
27 Metaloproteínas Ferritina Se trata de una proteína compuesta por 24 subunidades (pesadas y ligeras) que se ensamblan formando una esfera de 210 nm de diámetro. En el interior de esta esfera se almacena el hierro de una forma particular.
Coge el Fe+2 y lo oxida a Fe+3 (gracias a una subunidad de la ferritina).
Dentro de la cavidad el hierro se almacena unido a O2 (hierro híbrido).
En el interior de la ferritina se forman complejos de hierro híbrido. Estos complejos son la manera de almacenar el hierro de forma no tóxica para que pueda ser utilizado cuando sea necesario.
Biosíntesis de centros Fe-S Este proceso tiene interés desde el punto de vista bioquímico y desde el punto de vista e ciertas patologías. Tiene lugar mayoritariamente en la mitocondria, donde hay enzimas como la aconitasa y la succinato-DH que contienen estos centros.
Une vez entre el Fe en la mitocondria, encuentra toda una maquinaria de ensamblaje de centros Fe-S.
Hay una proteína, Isu1, que actúa como molde o scaffold, que a su vez recibe el S de la proteína Nfs1. Este S proviene de una cisteína.
En estos procesos participan muchas enzimas, pero la mayoría no se conocen.
En el interior de la mitocondria hay toda una serie de proteínas que participan en ayudar a transferir el Fe-S a las proteínas diana.
28 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Isu1 (es el nombre de la proteína en levaduras) y Nfs1 son proteínas muy conservadas, por lo que podemos deducir que se trata de un proceso que ha sido importante a lo largo de la evolución.
Aparentemente, este proceso también sirve para suplir de centros Fe-S a las proteínas extramitocondriales, como la aconitasa citosólica, aunque no se sabe muy bien cómo llegan los centros hasta ellas.
Algunas enfermedades minoritarias están causadas por mutaciones en los genes que codifican para las proteínas que participan en el ensamblaje de estos centros (se muestran en la imagen anterior).
Se cree que la razón o una de las razones que van ligadas a estos problemas tiene que ver con una desregulación del metabolismo del hierro.
Cuando no hay hierro en el organismo, Isu1 no puede formar el centro Fe-S, por lo que la proteína aconitasa, sensor de la falta de hierro, interpreta que no hay hierro en el organismo. La aconitasa se convierte en IRP1, que se une a las secuencias IRE, produciéndose la regulación vista anteriormente. En caso de que hay alguna mutación o algún problema en las proteínas que forman los centros Fe-S, la aconitasa tampoco recibe el centro Fe-S hecho que interpretará también como una falta de Fe en el organismo. Es decir, la célula recibe señales de que hay déficit de hierro, por lo que se activan proteínas como el receptor de ferritina  se acaba produciendo un exceso de hierro que se acumula en las células.
En el caso de la ataxia de Friedrich, hay problemas en las primeras fases del ensamblaje de los centros, por lo que se produce una acumulación de hierro  se puede observar mediante una tinción para ver estos depósitos.
CENTROS NO-HEMO, NO HIERRO-AZUFRE Se trata de centros que tienen un átomo de hierro coordinado por diversos aminoácidos, mayoritariamente cisteínas. Este tipo de coordinación es la que más se parece a la coordinación que presentan otros metales (que no son hierro) en otras metaloproteínas.
La mayoría de enzimas que incluyen estos centros acostumbran a utilizarlos en la catálisis.
Un ejemplo de metaloproteínas que presentan estos centros son las dioxigenasas. Esta proteína también tiene un centro Fe-S ya que se trata de una proteína que puede presentar más de un tipo de centro.
29 Metaloproteínas Las oxigenasas son enzimas con capacidad de oxidar sustratos, mediante la introducción de grupos -OH.
Hay procesos químicos industriales que requieren la oxidación de compuestos y utilizan esta enzima como catalizador.
Estos centros acostumbran a oscilar entre más de un estado de oxidación-reducción. Por ejemplo, en el caso de las dioxigenasas, el metal puede llegar a oxidarse hasta un estado Fe +5.
Otro ejemplo de proteínas con estos centros son las ribonucleótido reductasas.
Se trata de una enzima que cataliza la conversión de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos. Es la única enzima capaz de llevar a cabo esta reacción, por lo que es vital para que haya proliferación.
Es una posible diana de los antiproliferativos.
Hay muchas enzimas de este tipo diferentes. La ribont reductasa de los mamíferos contiene en una de sus subunidades un centro diferro.
Este centro consiste en dos átomos de hierro coordinados con distintos aminoácidos.
Normalmente, esta enzima tiene subunidades pequeñas y subunidades grandes. El principal centro catalítico se encuentra en la subunidad grande (subunidad α), mientras que la subunidad pequeña (subunidad β) ejerce de regulador.
La subunidad activadora tiene dos hierros coordinados con aminoácidos, cerca de los cuales se localiza una tirosina. En situación normal, los hierros se encuentran en forma reducida (Fe+2).
En presencia de oxígeno y de una fuente de electrones y protones, forma una estructura en la que un oxígeno queda capturado por el hierro, que se oxida a Fe+3. La tirosina pierde un electrón, formándose un radical tirosil y quedando activa la enzima (el radical es necesario para que se active la enzima) .
30 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Una vez se ha activado, puede reducir muchos nucleótidos. Esto puede servir para muchos centros catalíticos.
AYUDAS PARA EL ESTUDIO DE LAS METALOPROTEÍNAS: ESPECTROSCOPÍA Desde el punto de vista espectroscópico, existen diversas ayudas empleadas para estudiar las metaloproteínas. Muchas se basan en la zona intermedia - zona non-bonding- de los orbitales que se forman al fusionar ligandos y metales, es decir, en la zona en la que no se forman los enlaces metálicos.
Como ya se ha comentado, los orbitales de los ligandos se encuentran llenos de electrones, mientras que los orbitales de los metales se encuentran más vacíos.
La región bonding queda ocupada por los electrones correspondientes a los ligandos, mientras que los electrones de los metales ocupan la región intermedia. En esta zona la conformación (configuración electrónica) de los orbitales depende del número de ligandos y de su conformación espacial.
31 Metaloproteínas Las diferencias entre los dos niveles energéticos en estructuras octaédricas pueden ser más altas o más bajas. Por ejemplo, el hierro +3 en coordinación octaédrica puede presentar los siguientes espines: El espín S=1/2 se suele producir cuando la coordinación provoca una diferencia importante entre el nivel energético de los diferentes orbitales.
En cambio, cuando se da el espín S=5/2 estamos ante una coordinación que no provoca una diferencia tan importante entre el nivel energético de los diferentes orbitales - se mantiene en principio de exclusión de Pauli.
Por tanto, podemos ver cómo los electrones pueden ocupar los orbitales de distinta manera en función de la energía.
La espectroscopía detecta cómo se mueven los electrones en esta zona cuando son irradiados a distintas longitudes de onda (con ondas electromagnéticas) y, a partir de la información obtenida se deduce cómo es la coordinación del centro metálico.
UV-visible Partimos del ejemplo de un compuesto de titanio y H2O, que absorbe la luz a una determinada longitud de onda. En un principio, los orbitales tienen la misma energía. Al irradiar con luz llega un punto en que la energía aportada por la luz es suficiente para promocionar el electrón desde un nivel de energía más basal hasta un punto de mayor energía. Dependiendo de la estructura del centro metálico, esta transición se produce a una longitud de onda determinada.
Cuando la longitud de onda está en el espectro visible, puede observarse a simple vista. Por ejemplo, la hemoglobina y los centros Fe-S acostumbran a absorber en una zona del espectro visible, por lo que puede medirse la absorción con cualquier espectrofotómetro.
32 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Espectrofotometría de Mossbauer Emplea rayos gamma (γ). La muestra se irradia con una fuente de rayos γ y se mide la absorbancia con un detector. En función de la absorbancia podemos deducir qué tipo de centro metálico tiene la proteína. La muestra absorbe la radiación a una determinada longitud de onda, que dependerá del estado electrónico y del entorno.
La muestra es irradiada con rayos gamma con pequeñas diferencias de longitud de onda. Se aprovecha el efecto Doppler: cuando la fuente de los rayos se acerca, la longitud de onda es menor. Por tanto, la fuente de los rayos se va movilizado para provocar pequeñas variaciones en la longitud de onda.
Normalmente los espectros de Mossbauer se expresan en transmisión (100%= 0 absorción) en función de la velocidad.
No es posible aplicar el efecto Mossbauer a todos los metales, ya que solo lo presentan algunos isótopos (de los metales representados en rojo en la imagen).
33 Metaloproteínas Electron Paramagnetic Resonance (EPR) o Electron Spin Resonance Se trata de una técnica similar a la resonancia magnética nuclear pero, en lugar de aplicarse a los núcleos, se aplica a los electrones. Se mide el cambio de espín que se produce cuando los electrones son irradiados.
Un electrón tiene dos estados de espín posibles: -1/2 y +1/2, de entrada igual de energéticos.
Cuando la muestra es sometida a un campo magnético, uno de los dos queda energéticamente favorecido y el otro queda energéticamente desfavorecido.
Las moléculas que contienen electrones desapareados se denominan paramagnéticas. Se irradia la muestra con una longitud de onda determinada. Si el átomo tiene electrones despareados, habrá un punto en el que la energía con la que se irradia la muestra es justo la necesaria para que se produzca una transición de un estado de espín a otro. Esta transición se produce cuando la diferencia de energía entre los espines es igual a la onda electromagnética con la que hemos irradiado la muestra. El grado de paramagnetismo de la molécula es proporcional al número de electrones desapareados que contiene.
Por tanto la EPR aprovecha el hecho de que los diferentes espines de un electrón presentan diferente estado energético cuando se someten a un campo magnético y que los electrones pueden absorber radiación para cambiar su espín.
Se emplea para conocer cómo están distribuidos los electrones en los diferentes orbitales en aquellos centros metálicos que tienen un metal de transición.
Se va variando el campo magnético al que se somete la muestra hasta llegar al campo magnético en el que se produce esta absorción.
EXAFS - Extended X-ray Absorption Fine Structure La técnica se fundamenta en la absorción de rayos X por parte de los elementos, por ejemplo, metales. Da información del número de ligandos y su naturaleza en un radio de unos 5-6 Å en torno al metal.
34 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV APLICACIONES DEL ESTUDIO DE LAS METALOPROTEÍNAS: CATALIZADORES El principal interés práctico de las metaloproteínas es que muchas de estas son biocatalizadores con elevadas tasas de recambio y con capacidad de ser selectivos (incluso isoselectividad). La catálisis resulta muy interesante desde el punto de vista químico.
De entrada, podemos pensar dos formas de cómo aplicar las enzimas en la catálisis: - Pueden emplearse las proteínas enteras modificando algunos de sus aminoácidos - así se cambian algunas propiedades y se mejora la proteína a favor a nuestro interés.
- Desarrollar catalizadores artificiales de naturaleza química orgánica. Es posible preparar complejos artificiales con actividad catalítica similar a centros activos de metaloproteínas. Dentro de este campo podemos diferenciar dos ramas: Química biomimética: se intenta desarrollar un compuesto orgánico que reproduzca de la forma más exacta posible el centro activo de la enzima.
Química bioinspirada: la enzima sirve de fuente de inspiración.
La diferencia entre estas dos disciplinas es muy sutil. La aplicación suele quedarse en un punto medio entre ambas, aunque tiende más a la química bioinspirada.
A continuación, vamos a ver algún ejemplo de síntesis de catalizadores artificiales.
OXIDASAS Se trata de enzimas que catalizan oxidaciones. Muy comúnmente tienen un centro con hierro. En la industria química resultan muy interesantes las reacciones de oxidación de sustratos. Por lo que sobre la idea de un átomo metálico coordinado con diferentes ligandos, se han desarrollado compuestos orgánicos que actúan como quelantes de metales, que catalizan reacciones de oxidación. La producción de estos compuestos resulta más barata que la producción de la enzima.
Los seres vivos tenemos enzimas capaces de eliminar los radicales libres que se producen como consecuencia del metabolismo. Podemos encontrar por ejemplo, la superóxido dismutasa (SOD1) que elimina superóxido. El centro activo de esta enzima tiene un átomo de manganeso.
Se cree que los radicales libres están relacionados con el proceso del envejecimiento, por lo que los antioxidantes tienen interés científico.
Una serie de investigadores desarrollaron una serie de miméticos de SOD1 con un átomo de manganeso envuelto por anillos aromáticos que actúan como quelantes. Este compuesto artificial elimina el radical superóxido y H2O2.
Este compuesto se administró a C. elegans  fueron capaces de aumentar la esperanza de vida de este organismo.
Interés industrial en el hidrógeno El hidrógeno puede usarse como combustible alternativo a los combustibles fósiles, ya que se puede convertir en protones y electrones.
Actúa en cierto modo como una pila de hidrógeno, que puede dar lugar a electricidad.
Gracias a un catalizador se genera una corriente de electrones que acaban llegando al cátodo. Los electrones y protones derivados del H2, se han producido en el ánodo. Es en el cátodo donde, gracias a la catálisis, se combinan los electrones con oxígeno, dando lugar a agua.
35 Metaloproteínas Normalmente se utiliza como catalizador platino, un material escaso (y poco ecofriendly).
Además, otro inconveniente es que es necesario producir el hidrógeno y debe poder hacerse sin necesidad de emplear energía. Parece que estos problemas pueden solventarse mediante la aplicación de enzimas.
Algunos microorganismos tienen una enzima, la hidrogenasa, con capacidad de producir H2 a partir de protones y electrones, que pueden provenir de una fuente de C (estos microorganismos los obtienen del metabolismo normal del C).
Esta enzima es muy sensible al oxígeno.
Un estudio a plantear es la creación de un sistema biológico que produzca H2 gracias a esta enzima mediante la iluminación con luz  en organismos capaces de realizar la fotosíntesis, ésta sería la forma de obtener los electrones y los protones. Hay grupos que se dedican a buscar variables de la hidrogenasa más resistentes al oxígeno.
En el centro activo de la hidrogenasa encontramos un centro metálico compuesto por níquel y hierro que se corresponde con el centro catalítico. También tiene una cadena de centros Fe-S que sirven para hacer entrar los electrones (hasta el centro catalítico).
Además, hay unos canales de gas hidrofóbicos por donde sale el hidrógeno una vez se ha formado.
La hipótesis es que, por estos canales de hidrógeno también puede entrar el oxígeno. La idea fue modificar algunos aminoácidos del canal para impedir el paso del oxígeno.
36 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV A la salida del canal hay unos aminoácidos que custodian la entrada a este (una valina y una leucina).
Si estos aminoácidos se sustituyen por otros más hidrofóbicos puede restringirse el paso del oxígeno al canal (sin afectar al paso del hidrógeno).
Se hicieron las siguientes pruebas (se aplicaron mutaciones para cerrar la salida del canal): - Sustitución de la valina por isoleucina o por metionina.
- Sustitución de la leucina por metionina o por fenilalanina.
Obtuvieron resultados al sustituir los dos aminoácidos por metioninas  lograron una mayor resistencia el oxígeno.
Catalizadores bioinspirados en la hidrogenasa La mayoría de los que se han desarrollado resultan no tener ni una actividad ni una estabilidad extraordinarias. Además también acostumbran a ser poco solubles (bastante hidrofóbicos).
Otra aproximación a este problema son las enzimas artificiales.
Lo que se ha hecho es añadir un polipéptido a los catalizadores orgánicos (sintéticos).
Si por ejemplo cogemos el citocromo C, que tiene un grupo hemo, y le quitamos el hemo sustituyéndolo por el catalizador orgánico, hacemos el complejo soluble.
También se ha probado a añadir a esto un compuesto orgánico fotoexcitable, para que, al iluminar, se genere un flujo de electrones  se genera H2.
Parece ser que ninguno de estos compuestos artificiales funciona demasiado bien.
Se ha encontrado una solución que parece que sí funciona: Siguiendo con la idea de enganchar el catalizador orgánico a una molécula proteica se ha enganchado directamente a un fotosistema (no se sabe muy bien cómo).
Al irradiar el complejo con luz o mediante una fuente de electrones externa, son capaces de producir electrones.
La estabilidad no es excelente y es muy caro de producir.
37 Metaloproteínas Otra aproximación es acomplejar el catalizador conjugado con un nanotubo de carbono con capacidad de transportar electrones. Con bastante eficacia se ha conseguido introducir electrones para formar hidrógenos (y también la reacción inversa - obtener electrones a partir de H2).
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