TEMA 6 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 17
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 1
Subido por

Descripción

Inclou els apunts corresponents al tema 6 de l'assignatura Biologia Molecular: La tecnologia del DNA recombinant.

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 6 – La tecnologia del DNA recombinant La clonació cel·lular és agafar una cèl·lula que es fa créixer tota sola i tots els descendents d’aquesta són genèticament idèntics. El que ens referim ara és la clonació de fragments de DNA obtenir moltes còpies d’un fragment de DNA determinat. Introduir-los en cèl·lules hoste i doni lloc a clons on hi hagi amplificat aquest fragment de DNA que no li és propi. Introduït al genoma o mitjançant un vector per permetre que la cèl·lula es divideixi i aquest fragment també es trobi a dins d’aquest clon. Genèticament serà diferent de la cèl·lula original perquè té un fragment de DNA extra. Clon de cèl·lules genèticament idèntiques excepte pel fragment de DNA introduït de manera estable.
Objectius de la clonació gènica (gens o fragments de DNA) Amplificació  amplificar el fragment, obtenir moltes còpies del fragment: interessa tenir prou quantitat del DNA per seqüenciar, per estudiar l’estructura o genomes, pot interessar també estudiar homologies entre espècies o bé identificar mutacions. Els polimorfismes de seqüència pot ser interessant d’identificar (mutacions) Seqüenciació Estudi de l’estructura del genoma Estudi de l’homologia entre espècies Identificació de mutacions Expressió  em pot interessar el producte codificat per aquest fragment. Si és un gen, la proteïna; Si és un fragment de DNA, el RNA. Volem expressar aquest gen perquè ens pot interessar estudiar: Estudi del procés de transcripció i traducció Estudi de la regulació (part codificant i parts reguladores) Producció de la proteïna o RNA: obtenir el producte del gen o fragment de DNA     Per a la seva identificació Pel seu estudi (estructura, propietats, funcions) Per aplicar-la (producció comercial) en diagnosi, terapèutica, nutrició, industria Enginyeria de proteïnes  obtenir proteïna amb propietats millorades (no volem la proteïna salvatge) Per aconseguir amplificar un fragment de DNA necessitem cèl·lules?  No, tenim la PCR. De vegades es pot fer exclusivament la PCR.
D’aquesta manera, diferenciem l’amplificació: - Acel·lular (de vegades no es pot) Cel·lular (expressió) Etapa de lligament o vector 1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Esquema general del procediment de clonació Etapes clonatge gen/fragment de DNA 1- Obtenció del fragment de DNA/gen  es pot obtenir d’una purificació de DNA de la cèl·lula que sigui del teixit que sigui que sàpiga que hi ha el fragment de DNA.
Suposem que tenim DNA genòmic i només volem purificar un fragment petit. Hem de saber trobar el fragment d’interès que volem clonar  Construcció de genoteques o Genòmiques o cDNA (d’un RNA que s’està expressant) Si volem expressar un gen eucariota en una cèl·lula procariota lo ideal seria anar a la genoteca de cDNA perquè els hostes procariotes no tenen la maquinària per eliminar introns. Interessa més construir una genoteca de cDNA. Puc haver perdut elements que regulen l’expressió i per això utilitzaríem les genoteques genòmiques.
  Síntesi química PCR 2- Un cop tenim el fragment de DNA que volem clonar, realitzem la selecció del vector. El vector és una molècula de DNA que es coneix molt bé el mapa de 2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) restricció, la seqüència d’aminoàcids i aquest ha de servir per unir-se amb la seqüència que volem clonar per introduir-lo a les cèl·lules hoste i permetre la seva amplificació. Hi ha molts tipus de vectors. Aquests vectors, tot i ser diferents, han de ser capaços de replicar-se a la cèl·lula hoste.
3- Un cop tinc el vector triat (en funció de la cèl·lula hoste que volem formar) realitzem una reacció de lligament fent servir la DNA lligasa. Barrejo els dos fragments de DNA, el del vector i el d’interès i al tub d’assaig obtinc un producte anomenat DNA recombinant. Molècula de DNA com a mínim de dos orígens diferents. El vector pot ser un plasmidi de cèl·lula procariota o DNA d’un fag. Per a mi serà una molècula de DNA recombinant.
4- Un cop tinc la molècula de DNA recombinant dins del tub d’assaig, necessito un mètode que em permeti transportar o transferir aquesta molècula de DNA recombinant (rDNA) del tub d’assaig a l’interior de la meva cèl·lula hoste. El que em farà moltes còpies. Trobem diferents metodologies en funció de quin hoste volem transformar (eucariotes superiors vegetals o animal, eucariotes inferiors, procariotes... és diferent).
5- Un cop introduïdes a les cèl·lules hoste anirem obtenint moltes còpies però quan realitzem el transport no totes les cèl·lules que tracto incorporen la molècula de DNA recombinant. Necessito realitzar una selecció d’hostes que han incorporat el DNA recombinant. Aquest està relacionat amb el tipus de vectors que hem utilitzat i porten gens que ajuden al procés de selecció: Sistemes de selecció  Selecció genètica El plasmidi conté un gen que codifica per a: 1- Resistència a antibiòtics  Com el vector té un gen de resistència a antibiòtic la cèl·lula hoste ha adquirit la capacitat de ser resistent a un antibiòtic 2- Síntesi aminoàcid (auxotròfia)  el meu vector portarà un gen que codificarà per un enzim que permet fer la síntesi per un aminoàcid i permet complementar l’auxotrofia.
Un cop feta la selecció deixem que el cultiu creixi i tenim moltes còpies del fragment de DNA. És possible que no m’interessi quedar-me només amb un procés d’amplificació sinó que realitzem el procés d’expressió. Em pot interessar expressar el fragment de DNA (suposant que és un gen que codifica per una proteïna).
3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Si el que interessa és expressar el gen o fragment de DNA: 6- Fem servir els vectors d’expressió. Tenim un promotor darrere del qual hem afegit el gen al vector. Aquest promotor permetrà que el gen es pugui expressar i el DNA sigui transcrit a RNA i posteriorment aquest traduït a proteïna. Interessa que el promotor sigui induïble.
7- Purificació de la proteïna recombinant del RNA que sigui. Si volem aconseguir un producte determinat hem de ser capaços de separar la proteïna o RNA de tot el contingut cel·lular i a més a més necessitem a part de la purificació una caracterització. Si és una proteïna que volem fer servir per un procés determinat (serà recombinant) ha de tenir les mateixes característiques que si s’hagués aïllat o es trobés al teixit original.
De totes les etapes, les cinc primeres etapes poden realitzar-se de forma senzilla.
On molts cops els processos de clonatge fallen és als dos últims passos. O la proteïna s’expressa de forma molt lleu o bé les proteïnes tenen característiques que no interessen.
Reacció catalitzada per la DNA lligasa (REACCIÓ DE LLIGAMENT) Catalitzada per la DNA lligasa del fag T4. RECORDAR: La lligasa uneix extrems ROMS, COHESIUS que siguin complementaris i REPARA OSQUES. El que tenim aquí esquematitzat és una reacció de la lligasa.
La lligasa més utilitzada és la del fag T4. Aquesta i les lligases de cèl·lules eucariotes necessiten ATP. La lligasa de E. coli necessita NAD.
Necessiten aquests nucleòtids perquè puguin funcionar, s’ha de modificar el centre actiu per addició d’AMP. S’allibera el pirofosfat i l’AMP queda lligat covalentment al centre actiu. Formant un enzim adenilat. Està modificat i si tenim lligasa però no posem ATP ni NAD. No s’unirà res si no tenim AMP.
Una SOLA cadena de DNA i està oscada. Tenim un grup fosfat en 5’ i OH en 3’. Com ho farem per tancar una sola osca però funciona exactament igual quan enganxem dos extrems roms, o dos cohesius o bé una osca.
4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Es transfereix, en primer lloc, el grup fosfat i es forma un enllaç fosfodièster amb el fosfat de la osca. Aquesta transferència de l’AMP fa que el grup fosfat sigui més reactiu i facilitat l’atac nucleofílic d’aquest grup fosfat. Tot això catalitzat per l’enzim. Es forma l’enllaç fosfodièster i la DNA lligasa queda lliure per un nou procés. De vegades no funciona la reacció i és perquè s’ha fet malbé l’ATP. Començar amb un enzim adenilat (AMP o NAD és l’originari) el grup fosfat acabarà formant els enllaços fosfodièster.
La reacció que catalitza una lligasa pot reparar extrems roms i cohesius. Els extrems cohesius permeten major especificitat. Si el vector té un extrem 3’ que sobresurt s’unirà amb la seqüència de bases complementària. Permeten hibridació i posicionen els dos fragments perquè la lligasa pugui tancat. Necessitem el P a 5’ i el OH a 3’.
Lligament d’extrems cohesius Tallem el vector que deixi extrems cohesius. Per evitar el fragment de DNA necessitem tallar amb el mateix enzim de restricció. S’uneixen els fragments i formem el vector.
El fragment pot entrar en les dues orientacions si tallem amb un únic enzim de restricció. Complementarietat de bases.
Si tinc el meu fragment que tingui els extrems cohesius tenim els mateixos extrems perquè tallem amb el mateix enzim de restricció. Si giro 180º també pot unir-se. Aquest és un factor a tenir en compte quan parlem de vectors d’expressió. Una de les cadenes és la codificant i l’altre és la motlle, necessitem la correcta orientació.
5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Regions policonnectores en vectors Plasmidi amb origen de replicació, marcador de selecció. Tots els vectors presenten una regió anomenada regió policonnectora o polilinker. Aquesta no és res més que una seqüència que conté múltiples dianes de restricció. Són dianes úniques, només hi son una sola vegada en el vector. Coneixem molt bé el mapa de restricció d’aquesta seqüència.
Hi ha dianes que els nucleòtids d’una diana se solapen amb altre diana.
Aquesta regió serveix per saber amb quin enzim tallaré el meu vector per després unir el vector.
Vector de la família pET. Té dianes de restricció al mig de la seqüència del vector, factor de selecció, gen que codifica pel repressor lac i la regió policonnectora que té múltiples dianes de restricció úniques. Pot passar, de totes maneres, que hi hagi vegades que interessi clonar un fragment de DNA i no tingui a la diana policonnectora la diana que interessi.
Podem modificar el vector i introduir aquesta diana.
6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Introducció de regions policonnectores en vectors Encarreguem la síntesi de dues cadenes d’àcid nucleic i en aquesta seqüència quan hibriden hi hagi present la diana per l’enzim que a mi m’interessa. Procuro que deixin extrems a cantó i cantó que siguin complementaris d’alguns dels enzims que sí tinc presents a la seqüència policonnectora.
Barrejo i formo estructura secundària  com són complementàries hibridaran i un cop hibridades deixaran extrems cohesius a cantó i cantó i tallo el vector amb l’enzim que sigui que deixi extrems complementaris a dues bandes. Barrejo el vector obert amb el fragment de DNA artificial que he permès que hibridés al laboratori. Si obro el vector als dos punts d’interés amb enzim A i B i les cues són complementàries a lo que he tallat amb cada enzim i es poden unir gràcies a la DNA lligasa.
Amb la qual cosa, he fet una modificació de la regió policonnectora per introduir la diana que interessa per introduir el fragment que sigui.
Pots eliminar un fragment petit de la regió policonnectora original i introduir el fragment artificial que tu has construït.
7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Creació d’extrems cohesius per acció combinada de l’exonucleasa del fag lambda i de la transferasa terminal La lligasa tot unir extrems roms i cohesius de vegades interessa més unir els cohesius.
Si no podem generar extrems cohesius hi ha dues estratègies per transformar els extrems roms en cohesius.
El primer exemple és el següent: El que fem és tractar aquest fragment (el vector hauria de tenir extrems roms) i el tractem per separat del vector amb un enzim que és l’endonucleasa del fag lambda que es menja la cadena per l’extrem 5’ i deixa un extrem 3’ que sobresurt. Aquest producte es tracta amb la transferasa terminal. Per exemple amb una específica que introdueix només T. Aquesta permet addicionar nucleòtids en un extrem que sobresurt sense necessitat d’un motlle.
Tracto per un cantó el fragment d’extrems roms amb l’endonucleasa i després afegim la transferasa terminal. Creem una cua de timines.
Si el meu vector es tracta amb aquesta endonucleasa però amb una transferasa terminal que incorpori només adenines estic convertint extrems roms en extrems cohesius. Fem el tractament previ amb l’endonucleasa perquè treballem millor amb un extrem 3’ que sobresurt que no pas tenint extrems roms.
Si aleshores tractem el fragment i el vector, quan barregi fragment amb vector es podran unir per complementarietat de bases. El que no controles és el nombre de nucleòtids que afegeix la transferasa terminal.
Pot passar que hagi addicionat més timines que adenines i queda un forat. Si faig aquest tractament un cop permeto la hibridació entre DNA i vector hem de omplir el forat amb DNA polimerasa 1 i després tancar amb lligasa.
8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Creació d’extrems cohesius per unió de linkers Una altre manera de passar d’extrems roms a cohesius s’addicionen linkers. Aquests són fragments de DNA curts de doble cadena que a la seva seqüència s’han dissenyat de manera que contenen una diana per un enzim de restricció.
DNA de doble cadena curt i simplement el que fem és agafar el fragment de DNA amb extrems roms i es barreja amb el linker que té extrems roms. La lligasa els uneix i tenim a dues bandes extrems roms. A cantó i cantó del fragment enganxarà linkers i un linker es pot unir a un altre linker. A cantó i cantó del fragment podem tenir més d’un linker.
Un cop tenim la reacció de lligament digerim amb EcoRI. Només quedarà el linker d’un cantó i de l’altre unit al meu fragment.
9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Possibles productes d’una reacció de lligament La reacció de lligament té una sèrie de productes secundaris.
Vector + fragment  barrejo i afegeixo lligasa. Busco la molècula de DNA recombinant que contingui una molècula de vector i una molècula d’inserit.
Quan es duu a terme la reacció de lligament i he tallat amb un sol enzim de restricció, tant el meu fragment com el meu vector ningú em diu que això no es pugui tancar sobre si mateix. Es tanca el fragment que jo he generat sobre si mateix.
Produir concatenacions i vaig enganxant diferents fragment que m’interessa clonar.
Això pot passar amb el vector i podem tenir un vector lineal que es torna a circularitzar.
Es poden unir dues molècules de vector.
Es poden produir concatenacions lineals en comptes de circulars.
Es poden produir unions de vectors amb dos o més inserits (fragments a clonar).
De tot aquest conjunt el que busco es el marcat en rosa.
El fragment tancat sobre sí mateix és igual perquè no tenen origen de replicació i es perdrà quan la cèl·lula es divideixi tot i inserir-se a la cèl·lula.
Les lineals no es poden transformar.
Els vectors transformaran però quan la cèl·lula es divideixi no seran estables perquè tenen més d’un origen de replicació.
Vector recircularitzat si es pot propagar i molesta. Té marcador de selecció i origen de replicació. El mateix passa amb el vector amb altres associacions també molesta.
Variables més importants en una reacció de lligament - Si posem molt vector i poc inserit afavorim que el vector es tanqui sobre si mateix.
Si posem molt fragment i poc vector afavorim concatenacions d’inserits (un vector amb molts fragments).
La temperatura òptima de l’enzim és 37 ºC.  Si estic treballant amb extrems cohesius és una temperatura massa alta perquè hibridaran però es separaran contínuament. Si treballo hibridant extrems cohesius busco una temperatura de compromís de treball de la lligasa i que permeti la hibridació d’extrems cohesius.
En el cas d’extrems roms no és tan crític.
10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - - Si treballo amb extrems cohesius necessito que es treballi a 18ºC tota la nit o 25ºC durant 2-4h.
Si no tenim ni idea de les concentracions de vector i inserit que hem d’utilitzar s’aconsella que en el cas d’extrems cohesius fem 1 picomol de vector i 4 picomols de inserit per extrems cohesius o bé 0,5 picomols de vector i 4 picomols de inserit per extrems roms.
Un altre aspecte important és la puresa dels fragments tant del vector com de l’inserit. si partim d’un vector no pur o DNA contaminat amb altres molècules el producte o productes possibles de la reacció de lligament incrementen. Cal assegurar-se de que són el màxim de purs possibles.
Malgrat treballar en les condicions òptimes no ens evitem productes secundaris i hi ha estratègies per evitar tant la formació de recircularitzacions de vectors com evitar els vectors que porten inserits.
Mètodes per evitar la recircularització del vector 1. Tractament amb fosfatasa alcalina El que hem dit és que perquè la lligasa pugui funcionar necessitem un grup P a l’extrem 5’, es transfereix l’AMP i fa atac nucleofílic. Eliminem grups P 5’ del vector.
Fem un tractament amb fosfatasa alcalina, enzim que elimina els grups P dels extrems 5’. Tracto el meu vector amb aquest enzim i això implica que aquest vector no pot ser tancat per la lligasa, ja que un requeriment pel funcionament de la lligasa és la presència del grup P 5’.
Es barreja amb el inserit o fragment de DNA que conserva els P 5’ i permet la hibridació mitjançant la DNA lligasa.
Queda el grup 5’ del P enganxat al 3’ de un dels extrems del vector. La lligasa fa servir el P5’ del DNA per tancar la cadena. Si li traiem el P5’ del vector quedarà la cadena oberta. Sempre tindrem una cadena tancada i l’altre oscada.
Malgrat tenir aquesta molècula de DNA amb dues osques als dos extrems quan transformem la cèl·lula amb aquesta molècula oscada les cèl·lules entenen que les osques son mutacions i els sistemes de reparació cel·lular tapen les osques.
Guanyem que no hi hagi molècules de vector que es puguin tancar sobre si mateixes.
11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 2. Clonatge direccional A la regió policonnectora hi ha múltiples dianes de restricció. Obrim el meu vector amb dos enzims de restricció que deixin extrems cohesius NO COMPLEMENTARIS. Triem dos enzims que NO siguin ISOCAUDÒMERS.
Evidentment, el meu fragment de DNA serà complementari als fragments del vector ja que s’han tallat amb el mateix enzim. Només pot entrar amb una única orientació.
Això és important per evitar que es tanqui un gen sobre si mateix i per la expressió gènica. Com col·locar-lo respecte el promotor.
Deixa extrems cohesius però no complementaris, no tenen tendència a tornar-se a unir i es poden unir amb el fragment d’interès amb una única orientació possible.
3. Utilització d’isocaudòmers Tallem un fragment amb un enzim A i l’altre cantó amb B, enzims isocaudòmers deixen els mateixos extrems tot i ser enzims diferents. Uneixo el meu vector amb el meu fragment i faig la reacció de lligament en presència de l’enzim A. Si es tanca sobre sí mateix recupero la diana de A però els relligats tornaran a unir-se per la presència de l’enzim A.
No recuperem cap de les dues dianes al final del procés.
L’enzim A pot tallar el vector relligat però no pot tallar el vector inserit amb el DNA.
NO POSEM EL B, s’ha de posar el A. Durant la reacció de lligament afegim A. Si recuperes un altre cop la diana de A no transformarà.
12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Selecció de clons amb insert Com seleccionar clons que porten la molècula recombinant o bé els que només tenen el vector (relligat). Es basa en transformar una soca de E. coli que té una mutació i té el gen lacmz15. Té l’enzim de la beta galactosidasa i ha estat modificat genèticament i no és actiu perquè li falta un fragment per complementar el seu centre actiu anomenat lacZ. Si hi és present, tot i no estar unit covalentment a la cadena permet que l’enzim sigui actiu.
Com ha de ser el meu vector per transformar la soca d’E. coli?  Marcador de selecció i regió policonnectora. Aquesta regió la porta situada enmig del fragment que codifica justament per aquest fragment lacZ.
Vaig a clonar i tallaré amb un dels enzims la regió policonnectora, obrim el vector i tallem per BamHI que deixa extrems cohesius, els fragments que interessen clonar tallats amb el mateix enzim de restricció i si s’incorpora, el gen lacZ que ha quedat partir si s’incorpora el fragment queda lacZ tallat. Quan transformi les meves soques de E. coli (porten marcador per ampicil·lina) i si és un relligat haure recuperat el lacZ (amb beta galactosidasa activa) que s’unirà a la beta gal i podrem tenir soques d’E.
coli amb activitat betagalactosidasa.
En canvi, si tinc un clon que ha sigut seleccionat amb el marcador d’ampicil·lina i lacZ ha quedat obert perquè ha incorporat el fragment de DNA i no té funcional l’enzim, tindrem una soca d’E. coli betagalactosidasa deficient, no activa.
Afegim un substrat de la betagalactosidasa anomenada Xgal i els que tinguin l’enzim actiu podran trencar aquest substrat, el qual un cop hidrolitzat dona un color blau.
Quan afegim el substrat i l’enzim és actiu adoptaran un color blau.
Les soques que no tenen activitat betagalactosidasa, tot i tenir el substrat al medi no el podran trencar i tindran color blanc.
He de tenir molt pocs relligats i moltes molècules que provenen d’incorporar un fragment de DNA.
Inactivació insercional i això és vàlid perquè estem inactivant un “gen”. Inactivem a partir d’inserir un fragment.
El sistema de la betagalactosidasa rep el nom de alfa complementació. La soca presenta la mutació que la betagalactosidasa sigui activa.
Fins ara hem estat veient maneres de clonar amb vectors utilitzant sempre vectors i fragments tallats amb enzims de restricció.
14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Estratègies per evitar insercions en tàndem Per evitar insercions en tàndem podem utilitzar isocaudòmers i faig la reacció de lligament en presència de l’enzim B (utilitzat per tallar el fragment de DNA que m’interessa per clonar).
Molècules de vector amb 1 inserit o bé amb més d’una molècula d’inserit.
Recuperem la diana de B i a l’extrem del vector no recupero les dianes. Tot el que siguin inserit o portin més d’un inserit, com no recupero la diana de B, queda tallat i em trec de sobre els que tenen més d’un inserit. És lo mateix que l’altre però utilitzant altre enzim.
O bé puc tenir un lligament en presència d’una diana per un enzim de restricció que només és present en l’inserit: No la trobem cap vegada en cap vector i puc obrir el meu fragment amb l’enzim de restricció que sigui i barrejo vector i fragment i s’incorporen massa fragments en única molècula de vector. Faig, després de la reacció de lligament, digestió del producte de lligament que presenta una diana interna al fragment que m’interessa clonar.
Purifico ***romana*** la molècula grossa i un cop purificat podem tancat amb lligasa.
Passem d’una molècula que té n insercions en tàndem i una que no té. Recupero el fragment que ha quedat partit, un de sol.
15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Sistemes d’obtenció de molècules recombinants que no utilitzen enzims de restricció Volem tallar fragments molt i molt grans. Tenim molts números de que les dianes que van bé per clonar els extrems no hi siguin a l’interior. Tenim esquematitzat una altre manera d’aconseguir molècules de DNA recombinant sense utilitzar enzims de restricció. Les topo isomerases són enzims que ens permeten convertit topo isòmers.
Consisteix en tenir un vector que presenta aquesta seqüència que és reconeguda per una topoisomerasa del virus i topoisomerasa de tipus I.
Talla les cadenes i aquesta topoisomerasa talla la seqüència deixant una timina que sobresurt a l’extrem 5’ del vector. Aquesta queda unida a la topoisomerasa. La meva topoisomoerasa talla i en una primera etapa l’extrem 5’ de la cadena queda unit covalentment a la topoisomerasa. El que tinc és el vector linealitzat, la topoisomerasa reconeix la seqüència i paral·lelament necessitem amplificar el fragment que volem clonar mitjançant PCR fent servir una Taq polimerasa. Amplifica el fragment i després de n cicles deixa un producte majoritari amb extrems 3’ que té un nucleòtid de adenina que sobresurt. La timina s’aparellarà amb l’adenina a un extrem i a l’altre passarà el mateix. Un cop format l’aparellament la topoisomerasa continua treballant i es produeix un atac nucleofílic del grup OH cap al grup P que uneix l’extrem 5’ amb el centre actiu de l’enzim. S’allibera la topoisomerasa. Hem aconseguit el mateix.
17 ...

Tags:
Comprar Previsualizar