Tema 1: Introducció a la histologia (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Biomédicas - 1º curso
Asignatura Histologia
Año del apunte 2016
Páginas 20
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 3
Subido por

Vista previa del texto

Apunts de classe HISTOLOGIA TEMA 1: INTRODUCCIÓ A LA HISTOLOGIA INTRODUCCIÓ A LA HISTOLOGIA La histologia és una ciència que pretén: - Definir què és un teixit cel·lular.
Enumerar els diferents tipus de teixit i la seva classificació.
Descriure els diferents passos del processament histològic per microscòpia òptica i electrònica.
Identificar el colorant i la tècnica apropiats per la demostració d’un teixit o estructura cel·lular específics.
Identificar, a partir d’imatges, seccions tenyides amb tincions topogràfiques, histoquímiques, immunocitoquímiques, immunofluorescència, micrografies electròniques de transmissió i d’escombrada.
TEIXITS FONAMENTALS: CLASSIFICACIÓ Teixits epitelials - Epitelis de revestiment: revesteixen estructures (pell, parets dels vasos sanguinis...).
Epitelis glandulars: glàndules sudorípares, salivals, etc. (glàndules excretores) i suprarenals (glàndules endocrines).
Teixits connectius - Conjuntiu: es troba entremig d’estructures.
Sanguini Adipós (greix) Cartilaginós: teixit amb consistència.
Ossi: molta consistència, teixit mineralitzat.
Teixits musculars - Muscular llis Muscular esquelètic Muscular cardíac Teixit nerviós Teixit nerviós: format per neurones (sistema nerviós central) i nervis (sistema nerviós perifèric).
Teixits epitelials Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Teixits connectius Teixits musculars Apunts de classe HISTOLOGIA PROCESSAMENT HISTOLÒGIC PER MICROSCOPIA ÒPTICA I ELECTRÒNICA El procés histològic comença amb l’obtenció del teixit objecte de l’estudi. En el cas dels teixits vegetals directament es prenen mostres dels diferents òrgans que composen el cos de la planta, mentre que pels teixits animals podem optar per dues opcions: agafar una porció del teixit o òrgan i processar-la o processar primer l’animal complet i després extreure la mostra que ens interessi.
Les mostres són habitualment fixades amb unes solucions lipídiques anomenades fixadors, les quals s’utilitzen per mantenir les estructures cel·lulars i moleculars inalterables durant el processament posterior i amb una organització el més semblant possible a com es trobaven en la mostra viva. També podem fixar les molècules dels teixits per congelació ràpida. La fixació per congelació s’aplica quan la fixació química o els processos histològics posteriors alteren les característiques de la mostra que volem estudiar.
Després de la fixació es procedeix a incloure el teixit per posteriorment obtenir seccions. Quant més prima volem que sigui la nostra secció més hem d’endurir la mostra. Això s’aconsegueix embevent el teixit amb substàncies líquides que posteriorment polimeritzaran (resines) o es tornaran consistents (ceres). També es pot aconseguir el mateix efecte mitjançant congelació ràpida. Talls més gruixuts de 40 µm es poden tallar sense la necessitat d’inclusió utilitzant vibràtom. Els medis d’inclusió no són normalment hidrosolubles per la qual cosa haurem de substituir l’aigua dels teixits per solvents orgànics liposolubles i posteriorment substituirlos per medi d’inclusió.
Després de la inclusió o la congelació es procedeix a tallar els teixits, és a dir, obtenir seccions. Existeixen diferents aparells de tall que permeten aconseguir seccions ultrafines (de l’ordre de nanòmetres), semifines (de 0,5 µm a 2 µm), fines (entre unes 3 i 10 µm) i gruixudes (més de 10 µm). Habitualment les seccions es processen per poder observar-les i estudiar-les, tot i que certs tipus de microscòpia, per exemple amb contrast de fase, permeten observar seccions de teixits sense processar. Normalment les seccions es tenyeixen amb colorants que són hidrosolubles, per la qual cosa s’ha d’eliminar el medi d’inclusió per tal que els colorants puguin unir-se al teixit. Les seccions ultrafines (observades amb el microscopi electrònic) o semifines (amb l’òptic), poden contrastar-se amb metalls pesats o amb colorants, respectivament, sense la necessitat d’eliminar el medi d’inclusió.
Els teixits processats s’observen amb els microscopis. Existeixen dos tipus bàsics de microscopis: òptic i electrònic . Els primers ofereixen una gran versatilitat en quant a modes d’observar els teixits: camp clar, fluorescència, contrast de fase, polarització o contrast d’interferència diferencial, mentre que els segons permeten un gran poder de resolució, podent-se observar característiques ultra estructurals.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA FIXACIÓ Les funcions d’aquesta fase són: - - Preservar el teixit de la putrefacció, autòlisi, etc. (En el cas de reserva experimental, si l’animal o pacient està viu, la fixació i el procés serà molt ràpida. En cas d’una autòpsia, la fixació dependrà de les condicions inicials.) Endurir el teixit per permetre la seva manipulació i evitar alteracions morfològiques.
Manteniment de la citoarquitectura i ultraestructura. (Cal evitar que l’estructura de les cèl·lules es perdi [mitocondris, aparell de Golgi], és a dir, la seva citoarquitectura).
Manteniment in situ de les molècules. Molt important per determinacions histoenzimàtiques [determinació de la presència d’un enzim en un teixit] i immunocitoquímiques [detecció de molècules mitjançant anticossos].
Hi ha característiques dels fixadors que s’han de tenir en compte abans del seu ús: - - - Velocitat de penetració. El procés de fixació ha de ser ràpid i la velocitat de difusió de la substància fixadora en els teixits és un factor determinant. Aquest paràmetre condiciona la mida de la peça que volem fixar, més petita quant menor sigui la velocitat de difusió del fixador empleat, i també determina el temps de fixació, major quant major sigui el temps de difusió.
Velocitat de fixació. Depèn de les propietats químiques del fixador i condiciona el temps que ha de romandre el teixit en contacte amb el fixador.
Enduriment. Els fixadors solen endurir els teixits, la qual cosa depèn del tipus de fixador i del temps que el teixit hagi estat exposat a ell.
Osmosi i pH. S’han d’evitar canvis en el volum de les cèl·lules produïts per una osmolaritat del fixador.
Normalment se solen utilitzar solucions tamponades a un pH semblant al del teixit i isoosmòtiques amb l’esmentat teixit.
Efecte mordent. Alguns fixadors, a més de fixar, modifiquen químicament certes estructures químiques per tal que posteriorment puguin unir-se a elles els colorants.
Artefactes. Poden produir-se canvis en l’estructura del teixit degut al fixador o al mal ús d’aquest.
S’han de tenir en compte per no descriure com a característiques tissulars el que és un artefacte introduït durant la fixació.
Els diferents fixadors que s’utilitzen són: - - - Formol (molt utilitzat en serveis d’anatomia patològica): formaldehid + metanol. Actua mitjançant la formació de ponts entre molècules tissulars. Actua com a conservant, produeix poca retracció tissular, bon fixador per lípids, compatible amb la majoria de tincions.
Paraformaldehid: formaldehid en tampó fosfat.
Bouin: àcid pícric + formol + àcid acètic. Molt utilitzat pel processament de teixits que s’inclouran en parafina i a secciones dels quals se li poden aplicar un ampli rang de tincions. Molt útil per teixits tous i embrions, i preserva bé el nucli i el glucogen.
Carnoy: etanol + cloroform + àcid acètic. Bon fixador per al glucogen, carbohidrats simples i proteïnes fibroses. Bo per visualitzar àcids nucleics, tot i que no la morfologia nuclear.
MÈTODES DE FIXACIÓ Fixació per immersió En aquest mètode de fixació les peces del teixit se submergeixen en la solució fixadora. S’han de tenir en compte unes certes precaucions: Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA - - Mida de les peces (cal fraccionar la peça gran en diferents trossos). Les peces no haurien de superar els 0,5 cm d’espessor per tal que el fixador arribi a l’interior de la peça abans que aquesta comenci a deteriorar-se.
Volum del fixador (hi ha d’haver suficient fixador). El volum recomanat de fixador és 20 vegades superior al volum de la peça.
Osmolaritat (quantitat de solut de la dissolució, ha de ser fisiològica).
pH (ha d’estar dins el rang fisiològic, entre 5 i 8).
Temps de fixació. Depèn de cada tipus de fixador: velocitat de difusió i velocitat de fixació (rapidesa i intensitat amb la que estableix ponts o coagula proteïnes). En general no es recomanen fixacions majors de 24 hores, excepte en alguns casos com el formaldehid amb el que se sol aplicar una setmana de fixació.
Perfusió cardíaca La solució fixadora s’introdueix a través del sistema circulatori el qual accedeix a totes les cèl·lules del teixit gràcies a la xarxa de capil·lars. Mitjançant aquest mètode es pot fixar un animal complet introduint la solució fixadora a través del ventricle esquerre del cor.
Si es volguessin fixar els pulmons s’hauria d’afegir el fixador pel ventricle dret.
També es pot fixar un únic òrgan en el cas que podem introduir la solució fixadora en l’artèria principal que irriga l’òrgan. La perfusió no sempre es possible en alguns casos com en moltes biòpsies o en els teixits vegetals.
Abans d’introduir el fixador en el sistema de vasos sanguinis s’ha d’eliminar prèviament la sang amb una solució de rentat oxigenada, de no ser així la seva interacció amb el fixador produeix trombos que impedirien la fixació de determinades zones de l’animal o de l’òrgan. També s’han de cuidar l’osmolaritat, el pH i el temps de fixació.
Fixació per perfusió d’un organisme complet. La bomba peristàltica aporta la pressió suficient per permetre al fixador entrar a través del ventricle esquerre (Vi) i passar a l’aorta, des de la qual es distribueix per tot el cos (excepte pel circuit pulmonar). Després de passar per la xarxa capil·lar la solució fixadora passa als vasos venosos que acaben vertint el seu contingut a l’aurícula dreta (Ad). A aquesta cavitat se li ha de fer una obertura per tal que la solució fixadora, un cop realitzada la seva funció, surti del circuit.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Fixació per perfusió d’un òrgan. Mitjançant una bomba peristàltica s’introdueix la solució fixadora a través de l’artèria que irriga l’òrgan. S’obturen tots aquells vasos arterials que no condueixen a l’òrgan.
Apunts de classe HISTOLOGIA PROCESSAMENT PER CONGELACIÓ O INCLUSIÓ Com més dura sigui la peça, més prim podrà ser el tall. Per tant, hem d’endurir la peça el suficient per poder tallar-la. Si fem una inclusió amb parafina (més tova) els talls seran de 5 a 20 micròmetres, amb resina (més dura) els talls podran arribar a ser de 50 a 90 nm. Un cop tenim la peça fixada, s’ha de decidir quin és el gruix que ens interessa. Ens haurem de fixar, per tant, en la tinció, ja que no tota tinció és l’apropiada per tots els tipus de talls. La celoidina no s’utilitza avui en dia, és substituïda per la parafina. La parafina és una cera.
La congelació dels teixits prèviament fixats permet l’obtenció de seccions que poden anar d’unes 50 µm fins a nm de gruix, per la qual cosa s’utilitzen diferents aparells: micròtom de congelació per secciones de senes de µm, criòstat per seccions entre 5 i 20 µm i ultramicròtom per seccions ultra fines de l’ordre de nm. Per evitar danys que es produeixen durant els processos de congelació podem: a) Utilitzar anticongelants que impedeixin la formació de cristalls.
b) Realitzar una congelació molt ràpida amb nitrogen líquid.
La inclusió és el mètode més comú d’endurir el teixit i consisteix en infiltrar la mostra amb substàncies líquides que després d’un procés de polimerització o refredaments se solidifiquen, sense afectar les característiques del teixit. Són també un bon mètode per preservar les mostres durant llargs períodes de temps.
Inclusió en parafina La parafina és una substància d’aspecte cerós que està formada per mescles d’hidrocarburs saturats. A temperatura ambient és sòlida i el seu punt de fusió pot variar entre 40 ºC i 70 ºC segons la seva composició. No és miscible en aigua, mentre que tots els teixits estan formats principalment per aigua. A més, la majoria de fixadors són solucions aquoses. Això implica que per tal que la parafina pugui penetrar haurem de substituir l’aigua per un solvent orgànic, el que s’aconsegueix amb la deshidratació del teixit en alcohols (etanol).
Posteriorment es transfereix el teixit a un líquid que es miscible tant en l’alcohol com en la parafina, denominat substància intermediària, com el benzè, xilè, toluè o l’òxid de propilè. Són substàncies aclaridores.
Finalment es passa el teixit a parafina prèviament liquada en una estufa. Després s’afegeix la parafina líquida en un motlle, s’introdueix la mostra (amb parafina) i es col·loca segons la orientació desitjada del tall i es deixa solidificar a temperatura ambient.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Inclusió en resina Els passos que segueixen amb les resines tipus epoxy és similar als descrits per la parafina amb algunes modificacions. Els passos són fixació de mostres, per immersió o perfusió, deshidratació, líquid intermediari, infiltració i polimerització en el medi d’inclusió.
Gairebé sempre s’utilitzen resines tipus epoxy (líquides quan no estan polimeritzades). La polimerització es duu a terme en calent. Altres resines polimeritzen en fred i amb llum ultravioleta.
Les resines són altament cancerígenes. El glutaraldehid no és gaire penetrant, per la qual cosa la mostra serà molt petita i la haurem de tallar en peces molt fines.
La parafina ha de ser tallada amb un micròtom, la resina ha de ser tallada amb un ultramicròtom.
TALL Micròtom de parafina S’utilitza principalment per material inclòs en parafina i s’obtenen seccions de 5 a 20 µm de gruix. Aquestes seccions s’observen amb el microscopi òptic. Posteriorment posem el tall en aigua calenta per tal que les mostres s’estirin.
Ultramicròtom Es talla material inclòs en resines i s’obtenen seccions de 1 a desenes de nanòmetres de gruix. Les seccions de 0,5 µm o més s’observen amb el microscopi òptic, mentre que les de gruix de desenes de nanòmetres van destinades a ser observades amb el microscopi electrònic de transmissió.
Vibràtom Talla material no inclòs, tot i que sí fixat o dur, en seccions que poden anar de 30 fins a centenars de µm de gruix. Aquestes seccions s’observen amb el microscopi òptic. Es talla amb tampó (respectant un pH i osmolaritat fisiològics). La mostra no passa ni per fred ni calor, per tant es poden dur a terme tècniques de detecció d’enzims.
Criòstat o micròtom de congelació L’aparell té dos motors: un per tal que la ganiveta avanci, i un altre per tal que es mantingui constant la temperatura freda (-12ºC aproximadament). Els talls no s’enganxen a la ganiveta ja que aquesta és molt freda.
Es tallen materials congelats.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA TINCIONS HISTOLÒGIQUES En el cas de talls amb ultramicròtom no ens interessa el color, ja que anem al microscopi electrònic de transmissió (no es veuen els colors), no tenyim. Directament contrastem la mostra, ja que el contrast és el que ens interessa.
En el cas de talls duts a terme amb micròtom, vibràtom, criòstat sí que tenyirem les mostres. El color facilita la diferenciació dels elements de la mostra.
Les tècniques histològiques es poden dividir en quatre tipus: - - - Tincions generals. Aquelles que usen substàncies amb color que s’uneixen a components tissulars per afinitat química.
Histoquímica. Tècniques de tinció que impliquen la modificació química d’algunes molècules tissulars per posteriorment posar-les de manifest amb colorants.
Lectines. Les lectines són dominis de proteïnes, com les selectines, que són capaces de reconèixer glúcids que formen part de polisacàrids. Tenen una gran especificat i s’usen per determinar el tipus de glúcid que apareix en glucoproteïnes de les cèl·lules o de la matriu extracel·lular dels diferents teixits.
Immunocitoquímica. Basada en l’alta especificat d’unió dels anticossos als antígens contra els que s’han produït. Aquests antígens poden ser qualsevol molècula que, purificada i injectada en un animal, sigui capaç de desenvolupar una resposta immune. Aquests anticossos afegits a una secció de teixit reconeixeran i s’uniran específicament a l’antigen.
Hibridació. Tècniques basades en la unió complementària de les bases dels àcids nucleics. Això fa que dues cadenes complementàries d’àcids nucleics s’uneixin entre si de forma molt específica, és a dir, hibridin.
Tècniques topogràfiques o generals Basades en la interacció de substàncies colorants amb les estructures cel·lulars i tissulars.
- - - Colorants iònics àcids o aniònics: Eosina, fucsina àcida, verd ràpid, taronja G. Tenen afinitat per estructures tissulars de càrrega positiva: Estructures proteiques citoplasmàtiques, col·lagen de la matriu extracel·lular.
Colorants iònics bàsics o catiònics: Hematoxilina, tionina, safranina, blau de toluïdina, blau de metilè.
Tenen afinitat per estructures tissulars amb càrrega negativa: DNA (nuclis cel·lulars), RNA (ribosomes i reticle gruixut), glicosaminoglicans de la matriu extracel·lular.
Colorants neutres. Eosinat de metilè. Tenen una porció àcida i una porció bàsica.
Tinció hematoxilina-eosina - - Hematoxilina o Colorant iònic bàsic (càrrega positiva) o Tenyeix estructures amb càrrega negativa (nuclis de color blau, estructures basòfiles) Eosina o Colorant iònic àcid (càrrega negativa) o Tenyeix estructures amb càrrega positiva (citoplasmes de color rosat, estructures eosinòfiles) En qualsevol tinció s’ha de treure la parafina (desparafinat) mitjançant xilè (que és miscible amb la parafina) que anirà desfent la parafina. Posteriorment hidratem la mostra (amb dissolucions d’alcohol cada vegada de Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA menys concentració). Un cop la mostra estigui en aigua la tenyim. Un cop hem tenyit la mostra la tornem a deshidratar, ja que el mitjà de muntatge que li afegim no es miscible en aigua.
Tècniques específiques No ho tenyeixen tot, sinó que tenyeixen algunes coses.
Tècniques histològiques específiques: Lípids - - Oil red O: De color vermellós, tenyeix únicament els lípids.
Vermell Sudán: De color vermellós.
Negre Sudán: Color negre. En la fotografia apareixen glàndules que produeixen esteroides.
Hematoxilina-Eosina: No és específica per lípids. Les cèl·lules adiposes són molt grans i el nucli queda desplaçat cap a una cantonada. No s’observa tinció degut a què mitjançant el processament (alcohol, aigua, etc.) s’han perdut el lípids continguts en els adipòcits. Si es vol demostrar la presència de lípids en una presentació no es pot fer sempre que s’hagi tractat amb alcohols o dissolvents (cetona).
Per tenyir els lípids, doncs, és necessari utilitzar un criòstat.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Tinció hematoxilina-eosina Apunts de classe HISTOLOGIA Tècniques histològiques específiques: Teixit conjuntiu El teixit connectiu o conjuntiu es caracteritza per la presència de fibres.
- - Tricròmic de Masson o Blau de metilè: en blau hi ha les fibres de col·lagen (es tenyeixen amb blau de metilè).
S’anomena tricròmica perquè apareixen tres colors.
o Verd llum: les fibres de col·lagen apareixen de color verd.
o Fucsina Tricròmic de Van Gieson o Fucsina: en color vermell les fibres de col·lagen. Les estructures poc definides en color groc (són les fibres elàstiques). Les fibres més estructurades de color groc són fibres musculars.
Aquest tricròmic separa molt bé les fibres de col·lagen amb altres fibres.
Localització de mucines Les mucines són proteïnes de pes molecular important que estan glicosilades. Hi ha un tipus de secreció (secreció mucosa o de mucines). Les cèl·lules, quan secreten aquestes proteïnes, es queden a la superfície epitelial. Alguns colorants que s’utilitzen per la seva localització són: - - Blau Alcià: Els nuclis apareixen a la part basal (color rosat). En la segona fotografia apareix un epiteli, on la part apical de la cèl·lula està plena de vesícules (plenes de mucina).
Mucicarmí: Les mucines queden tenyides de color vermell. Amb el blau alcià apareixen en color blau, i amb el mucicarmí en color carmí. En la segona fotografia apareix una altra varietat de mucicarmí (glàndula salival).
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Tècniques histoquímiques Impliquen una reacció química: transformació d’un producte en un altre diferent amb característiques diferenciables.
- PAS (àcid periòdic de Shiff): detecció de carbohidrats Àcid periòdic que actua sobre els carbohidrats produint la formació de grups aldehids que són els que reaccionen amb el colorant.
- Lectines: detecció de residus glucosilats Lectines biotinades. Tripsina o neuraminidasa per exposar els residus amagats. Avidina peroxidasa.
Revelat amb DAB.
Lectines unides a fluorocroms - Tècniques histoenzimàtiques: detecció de proteïnes enzimàtiques Detecció de fosfatases PAS: Detecció histoquímica de carbohidrats Tenyeix: polisacàrids simples, mucopolisacàrids neutres, glucoproteïnes i glucolípids: glucogen, membranes basals, mucines, glicocàlix. La tècnica consisteix en: - Desparafinat. Hem de treure la parafina de la mostra.
Hidratació. Hidratem la mostra per acabar d’extreure tota la parafina.
Àcid periòdic + Aigua destil·lada + Reactiu de Schiff + Aigua destil·lada + Hematoxilina.
De vegades s’utilitza aigua de l’aixeta que, gràcies a les sals, ajuda a realitzar les reaccions.
Deshidratació. Mitjançant alcohol de cada vegada més concentració i xilè.
Tinció amb hematoxilina-eosina (imatge de l’esquerra) i PAS-hematoxilina (imatge de la dreta) de les vellositats de l’intestí humà tallades transversalment. Es pot apreciar a les cèl·lules calciformes tenyides de rosat amb la tècnica de PAS pel seu alt contingut en mucopolisacàrids, mentre que en una tinció general apareixen transparents, sense tenyir.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Lectines: Detecció histoquímica de sucres (residus glucosilats) Les lectines són proteïnes, usualment d’origen vegetal, que tenen afinitat per glúcids terminals de cadenes d’oligosacàrids lliures o components de glucoproteïnes.
Cinc grups de lectines que reconeixen: - Manosa Galactosa / N-acetil galactosamina N-acetil-glucosamina / N-acetil-lactosamina Fucosa Àcid siàlic Interès: algunes poblacions cel·lulars presenten en la membrana citoplasmàtica sucres característics.
Processat de la mostra per tinció PAS Exemple: Lectina de Lycopersicum esculentum (tomàquet) El residu glucosilat de poli-N-actil-lactosamina fa que les cèl·lules que el contenen apareguin de color marronós.
1. Afegim lectina (lligada amb una biotina) que s’enganxa si hi ha poli-N-acetil-lactosamina.
2. Posteriorment afegim avidina peroxidasa, que s’enganxa tan sols si hi ha biotina.
Problema: sovint hi ha biotina en el mitjà, per tant s’ha d’inactivar la d’origen de la pròpia mostra i fer que tan sols reaccioni aquella que nosaltres afegim.
3. La peroxidasa catalitza la reacció de peròxid d’hidrogen a molècules d’aigua i oxigen. La diaminobenzidina s’oxida en presència d’oxigen, i és la que dóna el color marró.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Tècniques histoenzimàtiques: Detecció d’enzims Exemple: Detecció de la fosfatasa NDPasa (nucleòsid difosfatasa) Per fer que actuï l’enzim NDPasa, afegim més substrat (ADP). S’ha d’haver tallat amb un mecanisme que no hagi desnaturalitzat l’enzim (per exemple: vibràtom). Posem la mostra a temperatura fisiològica. L’enzim actua i trenca un dels fosfats de l’ADP i la passa a AMP (alliberant una molècula de fosfat). Si afegim nitrat de plom, el fosfat substitueix el nitrat per plom, formant-se fosfat de plom. Si afegim, a més, sulfur d’amoni, el fosfat se substituirà per sulfur, i obtindrem sulfur de plom (visualment de color marró).
En color més marronós apareixen els vasos sanguinis (cèl·lules endotelials).
Tècniques immunocitoquímiques S’utilitzen per localitzar molècules concretes resultat de la fisiologia d’una cèl·lula. Per tant, es pot saber el procés de la cèl·lula en funció de la molècula localitzada. Això sempre passarà si la molècula té capacitat antigènica.
La resposta del sistema immunitari en presència d’un antigen és la producció d’un anticòs.
- Es basen en l’aplicació d’anticossos dirigits cap a epítops (grups amb característiques antigèniques) concrets de molècules.
Els anticossos són proteïnes sèriques (immunoglobulines) sintetitzades per les cèl·lules plasmàtiques, derivades dels limfòcits B activats després de reconèixer un antigen estrany (immunogen). Usualment s’utilitzen IgG o IgM.
Tipus d’anticossos: - Anticossos policlonals: conjunt d’anticossos específics per un immunogen (diferents epítops).
Anticossos monoclonals: específics d’un epítop únic d’un immunogen.
L’estructura tridimensional d’una molècula molt gran pot produir més d’un anticòs, ja que pot tenir diferents fraccions immunògenes.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Epítop: zona d’una molècula que pot donar reacció antigènica.
Amb el policlonal, la probabilitat d’obtenir resultat positiu és molt àmplia i podem arribar a errors. Per tant, sempre que es pot, es treballa amb anticossos monoclonals de forma que la detecció d’allò que volem és més acurada.
Immunofluorescència: Dobles i triples marcatge mitjançant immunofluorescència Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Detecció Immunocitoquímica mitjançant revelat amb DAB En aquest cas, l’anticòs no té color, per la qual cosa s’ha d’utilitzar una estratègia per tal de detectar el filament (antigen). Ens interessa molta especificitat per no tenir falsos positius.
- - - L’anticòs primari és el que s’uneix a l’antigen. Posteriorment afegim un anticòs secundari que s’uneixin de forma específica a la regió Fc de l’anticòs primari.
Aquest anticòs secundari pot ser lligat a una molècula que ens interessi (biotina).
Després afegim una molècula amb molta avidesa per la biotina (avidina) (la unió avidina-biotina és molt específica).
L’avidina la podem afegir lligada a molècules de peroxidasa (enzims).
El nombre de peroxidases serà major al nombre d’antígens utilitzat.
Afegim substrat per les peroxidases, que mitjançant una reacció el trencaran i formaran aigua i oxigen.
Si en el mateix mitjà hi hem afegit diaminobenzidina (DAB), la presència d’oxigen que s’alliberarà de la presència de peroxidasa farà que la DAB s’oxidi. La DAB oxidada presenta color marró.
TINCIONS PER MICROSCOPIA ÒPTICA I ELECTRÒNICA Si hem tallat amb resines (utilitzant l’ultramicròtom), podrem obtenir preparacions molt fines que aniran al microscopi electrònic de transmissió o obtenir-ne semifines.
Tincions talls semifins (0,5 – 2 µm) obtinguts amb l’ultramicròtom El colorant usat per tenyir seccions semifines és normalment el blau de toluïdina, el qual pot infiltrar-se en la resina escalfada en una planxa i arribar fins al teixit.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA Contrast de talls ultrafins (50 – 60 nm) obtinguts amb l’ultramicròtom El contrast no és una tinció, donat que no dona color a la mostra, però sí un procés habitual per poder observar components ultraestructurals de la cèl·lula.
Tot i que les seccions per microscopia electrònica es poden veure directament amb el microscopi electrònic, se solen tractar prèviament amb metalls pesats en un procés anomenat contrast, obtenint així una imatge òptima.
En microscopia electrònica és important afegir molècules que puguin interferir amb el camí dels electrons emesos pel microscopi i que xoquen contra la mostra. Els electrons que travessin la mostra incideixen sobre una pantalla fosforescent que emet flaixos de llum quan reben l’impacte d’un electró i permet observar les característiques del teixit. Els metalls pesats units al teixit impediran que passin els electrons i per tant es veure una zona negra en la pantalla fosforescent, mentre que aquelles zones de la cèl·lula on no estiguin aquests metalls provocaran àrees lluminoses en la pantalla.
OBSERVACIÓ L’últim pas de tot procés histològic és la observació del resultat produït per la tècnica realitzada. El poder de resolució de l’ull humà és de 0,2 mm, mentre que una cèl·lula eucariota típica sol tenir unes dimensions d’uns 10 a 50 micròmetres. Per tant, necessitem aparells que ens permetin augmentar la imatge de les mostres per discriminar estructures tissulars diminutes com les cèl·lules i els seus compartiments.
MICROSCOPIA ÒPTICA També anomenats de camp clar, utilitzen llum visible i lents de vidre que permeten un augment de les mostres d’unes 1.000 vegades, amb un poder de resolució d’uns 0,2 micròmetres. Això és la màxima resolució que permet la llum visible, per les seves propietats de longitud d’ona. S’utilitzen per observacions generals, característiques cel·lulars i tissulars, i estan presents en tots els laboratoris d’histologia.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA MICROSCOPIA DE FLUORESCÈNCIA En el microscopi confocal la font de llum és un làser, en el cas del de fluorescència és una llum (bombeta). El filtre d’excitació fa que de moltes longituds d’ona, tan sols travessi una determinada, que arribarà fins la preparació. S’utilitza en el cas que haguem utilitzat fluorocroms. La llum excita el fluorocrom i això emet llum d’una altra longitud d’ona que la que ha incidit.
MICROSCOPIA ELECTRÒNICA Els microscopis electrònics es basen en l’alta freqüència dels electrons per aconseguir un poder de resolució d’1 nm. S’utilitzen per observar la ultraestructura de la cèl·lula i els teixits, és a dir, per estudiar el nivell subcel·lular (orgànuls, membranes i organitzacions moleculars).
MICROSCOPIA ELECTRÒNICA DE TRANSMISSIÓ (TEM) Es produeix el feix d’electrons en un filament de tungstè que funciona com a càtode. S’emeten els electrons i passen per diferents condensadors, que concentren el feix d’electrons en un punt. El feix travessa el teixit (sempre que no hi hagi molècules electrodenses). Posteriorment el feix passa per l’objectiu, el projector i xoca contra una pantalla fluorescent. Els rajos que han reflectit de la pantalla són els que observem. 2 MICROSCOPIA ELECTRÒNICA D’ESCOMBRADA (SEM) Serveixen per observar superfícies tissulars. Això és possible perquè els electrons no travessen la mostra sinó que interaccionen amb la seva superfície i reboten. Per produir aquest efecte el teixit ha d’estar banyat d’or o algun metall pesat. Els electrons xoquen sobre la superfície de la mostra i emeten en diferents direccions.
Aquestes emissions són recollides en la pantalla d’un ordinador. La mostra s’escombra amb el feix d’electrons i els electrons reflexats per un punt de la superfície són captats per una pantalla receptora que crearà una imatge en la pantalla digital. La imatge completa es forma quan el feix recorri tota la superfície (la escombri o escanegi).
Comparativa de la composició bàsica d’un microscopi òptic (esquerra), electrònic de transmissió (centre) i electrònic d’escombrada (dreta) Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA 1 Microscopi òptic. Hi ha molta resolució, per tant el tall és semi-fi (ultramicròtom) i s’ha tenyit amb un colorant que s’escalfa (blau de toluïdina). 2 Microscopi electrònic d’escombrada (SEM). És un epiteli, la cèl·lula central té microvellositats i les altres tenen cilis.
1 Microscopi electrònic de transmissió (TEM). És un epiteli, la part superficial són microvellositats i les parts més fosques són mitocondris. Els punts més petits són ribosomes. Al mig es veu la unió de dues cèl·lules (es distingeixen les membranes). 2 Microscopi òptic. Menys resolució, tall més gruix . Tinció hematoxilina-eosina.
1 És cervell. Tècnica de Golgi (per detectar neurones). 2 Microscopi de fluorescència. Tècnica immunohistoquímica de fluorescència.
S’observen proteïnes de la membrana plasmàtica de determinades cèl·lules.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA 1 Microscopi òptic. Tinció hematoxilina-eosina. Tall fet amb parafina (bastant fina). 2 Microscopi òptic. Tinció tricròmic de Masson (es poden localitzar les fibres de col·lagen).
1 Microscopi òptic. Tinció específica per detectar fibres de reticulina (la seva proteïna d’origen és la mateixa que el col·lagen però són fibres més primes). La plata (del nitrat de plata) s’oxida i es veu de color negre. Tinció de Jones. 2 Microscopi òptic. Tinció tricròmic de Masson.
1 Microscopi òptic. Es tenyeixen amb la tècnica d’orceïna. 2 Microscopi òptic. Tinció Van Gieson.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA El primer tall és més gruixut (parafina) i l’altre és semi-fi. Tinció hematoxilina-eosina.
1 Microscopi de fluorescència. S’han utilitzat dos fluorocroms, un que emet color vermell i l’altre emet verd. 2 Microscopi òptic. Tinció tricròmic de Masson.
1 Microscopi electrònic de transmissió. 2 Microscopi òptic. Tinció amb blau alcià (tenyeix les mucines).
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques Apunts de classe HISTOLOGIA 1 Microscopi òptic. Tall semi-fi. 2 Tècnica immunohistoquímica (posem un altre producte [no la DAB] que quan s’oxida dóna color blau.
Tècnica NDPasa que dóna color marró.
Joan Roncero Carol 1r Ciències Biomèdiques ...