Seminari II i III: electroforesis de DNA/ Tècniques d’hibridació dels àcids nucleics. (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Profesor D.S.
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 04/11/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Seminari II i III: electroforesis de DNA/ Tècniques d’hibridació dels àcids nucleics.
ANÀLISI ELECTROFORÈTIC DE FRAGMENTS DE DNA  Gels d’agarosa: Ens permet separar les molècules de DNA al desplaçar-se en un camp elèctric, a una velocitat inversament proporcional al logaritme de la seva mida.
Separació en funció de la seva mida: els que són molt petits baixen bastant ràpid.
 El DNA a ph neutre té una càrrega negativa, es desplaçarà cap al pol positiu.
 Factors que afecten a la velocitat de migració:  Voltatge: la velocitat és directament proporcional al voltatge aplicat.
 Concentració d’agarosa (determina la mida dels porus del gel).
 Conformació del DNA.
 El DNA es visualitza amb agents que s’intercalen entre les bases del DNA i que emeten fluorescència al ser irradiats amb llum UV (com el SS: syber safe o el bromur d’etidi).
Bromur d’etidi: és un agent intercalant, d’introdueix entre les bases apilades del DNA, obre una mica la doble hèlix i provoca un desenrotllament. La seva fluorescència augmenta al unir-se amb DNA.
 En un dels pouets del gel s’addiciona una barreja de fragments de DNA de mida coneguda que es fan servir com a patró o marcadors de massa molecular.
PRINCIPALS APLICACIONS DE L’ELECTROFORESI DELS ÀCIDS NUCLEICS  Determinar la mida i el numero de fragments de restricció al tallar un DNA.
 Elaborar mapes de restricció: per saber les posicions relatives de les dianes de restricció d’una molècula de DNA.
 Estimar la quantitat aproximada d’un DNA en solució.
 Purificar directament una determinada molècula de DNA.
 Identificar una molècula de DNA o RNA en una barreja mitjançant les tècniques d’hibridació d’àcids nucleics.
 Comprovar amplificacions (síntesi) de molècules de DNA per la tècnica de la PCR.
TÈCNIQUES D’HIBRIDACIÓ DELS ÀCIDS NUCLEICS  Permeten identificar seqüències especifiques de DNA o d’RNA d’un extracte d’àcids nucleics.
 Capacitat de formar híbrids, sempre que hi hagi complementarietat de bases.
 Base: desnaturalitzar cadenes d’àcids nucleics i renaturalitzar-les amb cadenes complementàries de DNA o d’RNA marcades (sondes) que permetin detectar els híbrids.
 Les sondes són cadenes curtes de DNA o RNA de seqüències complementàries al DNA o RNA que es vol identificar.
 Es poden classificar en: fase líquida, suport sòlid i in situ.
HIBRIDACIÓ EN SUPORT SÒLID: Southern blot (DNA).
SELECCIÓ DELS HIBRIDS ESPECIFICS: L’especificitat d’un híbrid està relacionada amb la seva estabilitat. L’híbrid més estable és el més complementari i per tant més específic.
     Percentatge de complementarietat Seqüència de bases Longitud dels híbrids Temperatura d’hibridació: més estable suporten temperatures elevades Força iònica del medi: concentració elevada de Na, els cations neutralitzen les carregues negatives dels fosfats i estabilitzen híbrids no específics. Ens interessa disminuir la concentració de sodi.
 Agents desnaturalitzants (urea, formanamida): estableixen ponts d’hidrogen amb les bases, impedint la hibridació. Augmentem la concentració d’agents desnaturalitzants, per a poder seleccionar híbrids específics.
SONDES PER HIBRIDACIÓ Sonda: fragment petit de DNA o d’RNA marcat, què és complementari d’una seqüència de DNA o RNA que es vol detectar.
Tipus de sondes  Sondes de DNA: obtingudes per clonació clàssica o per la tècnica de PCR  Sondes de RNA: ribosondes  Sondes sintetitzades químicament, oligonucleòtids sintètics.
Per a dissenyar la seqüència de la sonda s’ha de conèixer:  Seqüencia de DNA que es vol identificar (la sonda ha de ser complementària)  Si no es coneix la seqüència del DNA, la sequüencia de la proteïna que codifica.
 Si no es coneix la seqüència de la proteïna: buscar seqüència conegudes de proteïnes homologues d0aktres especies i seleccionar les zones més conservades.
Tipus de marcatge:  Directes: isotips radioactius (autoradiografia), fluorocroms-NTPs (llum emesa per fluorimetria), enzims-NTPs (espectrofotometria, fluorimetria o luminiscència).
 Indirectes: molècules indicadores que uneixen molècules marcades amb fluorocroms o que transformen un substrat amb un producte de color o luminescent.
RANDOM PRIMING (iniciació a l’atzar de la polimerasa).
 Sonda inicial: és una cadena doble de DNA, desnaturalitzada que actua com a motlle.
 Es fan servir encebadors de 6 nucleòtids a l’atzar amb totes les seqüències i el fragment de Klenow de la DNA polimerasa I d’e.coli  S’afegeixen nucleòtids marcats i se sintetitzen les cadenes complementaries de la sonda inicial de DNA  El resultat és una sonda de DNA marcada d’idèntica seqüència a la inicial però més curta.
HIBRIDACIONS SOBRE SUPORT SÒLID  Southern blot: transferència de fragments de DNA. Té aplicacions en medicina forense (tipificació del dna  Northern blot: transferència de fragments de RNA  Western blot: transferència de proteines. Ens permet saber si un gen s’expressa i es tradueix a proteïna. Les proteïnes es separen en un gel de poliacrilamida-SDS. Es transfereixen a una membrana i s’incuben amb un anticòs específic (primari) pot estar marcat o detectat per un anticòs secundari marcat que reconeix el primari. El complex proteïna-anticòs marcat es visualitza per luminescència, fluorescència o radioactivitat.
TÈCNIQUES D’HIBRIDACIÓ AUTOMATITZADES: matrius de DNA  Aplicació de les tècniques d’hibridació pel diagnòstic molecular de malalties genètiques, detecció de mutacions i polimorfismes.
 Plaques sòlides de molt petita mida que porten adherides de forma ordenada i coneguda milers de molècules curtes de DNA, que actuen com a sondes.
 Es marquen els DNAs i RNAs de la mostra, que s’utilitza en molt petita quantitat.
 Les mostres marcades i desnaturalitzades s'aboquen sobre la matriu i s’hibrida, es renta i es detecta la posició on hi ha marcatge.
...

Tags:
Comprar Previsualizar