Tema 9 Proteómica libre de gel (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 13
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 9 Proteómica libre de gel La proteómica libre de gel comenzó a desarrollarse cuando se constaron los problemas de la electroforesis y empezó a desarrollarse la tecnología de los espectrómetros de masas. Se pensó que se podía trabajar sin gel acoplando la cromatografía con la espectrometría de masas/masas.
Limitaciones de la electroforesis bidimensional - Rango dinámico limitado, que dificulta la identificación de proteínas poco abundantes.
- Resolución limitada ya que no se pueden hacer geles más grandes que los de 24x24 (como mucho pueden ponerse geles sucesivos). Por tanto, habrá spots que contengan más de una proteína (baja resolución).
- Lleva mucho tiempo (varios días).
- Se trata de una técnica muy delicada y no siempre es reproducible.
- Encontramos muy baja representación de las proteínas de membrana ya que los detergentes que se usan para la electroforesis (zwitteriónicos o no iónicos) no son demasiado fuertes y no solubilizan proteínas con varios dominios transmembrana (y los detergentes iónicos no se pueden utilizar).
La electroforesis también tiene sus ventajas: - Tiene un coste razonable. En las primeras fases no hace falta un equipo sofisticado.
- Se trata de una técnica clásica, muy bien conocida. Como se conocen todas sus limitaciones, se pueden extraer mejores conclusiones. En cambio, los límites y la problemática de la proteómica libre de gel no quedan muy claros ya que se trata de una tecnología en desarrollo.
- Permite analizar con anticuerpos, sondas fluorescentes, … En cualquier trabajo proteómico se sigue el mismo flujo de trabajo (work flow): En los métodos libres de gel, la separación de proteínas y péptidos se realiza mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas (en función de tiempo de retención en la columna y de la masa) y la para la identificación empleamos la espectrometría de masas/masas.
1 Proteómica libre de gel Partimos de una muestra de proteínas. En lugar de hacer una electroforesis bidimensional, primero digerimos la muestra con una proteasa (normalmente tripsina) y la convertimos en una mezcla de péptidos en los que aplicamos una cromatografía líquida. Es este caso, separamos los péptidos en función de su hidrofobicidad. Todo lo que va saliendo del cromatógrafo (a tiempos distintos), se mete en el espectrómetro de masas/masas que realiza un espectro cada segundo aproximadamente. Por tanto, obtenemos varios espectros.
De cada péptido tenemos los datos del tiempo de retención en cromatografía y de su relación masa/carga, por lo que en realidad, hemos hecho algo similar a una separación en dos dimensiones de la mezcla de péptidos. Cada péptido se ve representado en un punto distinto.
Además, después de obtener el espectro de masas, el espectrómetro coge los picos más altos y, en los siguientes milisegundos aísla el precursor del que proceden y lo fragmenta por masas/masas.
Así, se obtienen los espectros de masas/masas de los picos más altos, lo que nos permite, además de separar los péptidos, identificar aquellas secuencias de los picos más abundantes e identificar las proteínas de las que proceden los péptidos.
Por tanto, mediante esta técnica separamos e identificamos las proteínas.
Las proteínas se digieren en péptidos para identificar, ya que es mucho más difícil identificar a partir de la fragmentación de la proteína entera. Además, los espectrómetros de masas acostumbran a tener más resolución en el rango de masas de los péptidos.
En la gráfica de la imagen, los péptidos están representados con puntos o manchas de un color, que marca la intensidad.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Como hemos digerido la proteína, los péptidos que aparecen juntos en el espectro no vienen de la misma proteína, sino de un mismo tiempo de retención (no ocurre como en la huella peptídica). De cada pico tenemos el espectro de fragmentación para poder identificar.
Normalmente, para el acoplamiento entre la cromatografía y la espectrometría de masas se emplea la ionización de tipo ESI (ElectroSpray Ionization). También puede usarse MALDI, pero debe ser offline, es decir, en el momento en que salen los péptidos de la cromatografía se van colocando en el aparato de MALDI. Emplear ESI permite hacer la técnica más automatizable.
Esta forma de trabajar supera muchos de los inconvenientes de la electroforesis bidimensional. En principio, alcanza un mayor rango dinámico ya que permite la detección de proteínas menos numerosas, Además, es más reproducible y automatizable (espectrometría y tiempos de retención rara vez cambian entre repeticiones), lo que nos permite analiza un mayor número de muestras.
Podemos usar detergentes fuertes y después eliminarlos, por lo que podemos identificar proteínas transmembrana. Además para identificar la proteína no hacen falta todos los dominios por lo que no pasa nada si se pierden las zonas más hidrofóbicas.
El principal inconveniente es que los equipos son caros y solo se encuentran en servicios de proteómica (que se encuentran saturados). Como se trata de una técnica en desarrollo, cada dos o tres años la capacidad del espectrofotómetro aumenta mucho - los aparatos son caros y su compra supone un esfuerzo económico considerable como para que se queden anticuados a los pocos años.
Cromatografía líquida en proteómica La cromatografía líquida que se usa para la proteómica libre de gel es la cromatografía de fase reversa ya que en la fase móvil se emplean solventes orgánicos que se evaporan más fácilmente en la ionización electrospray, Con los solventes que se emplean en el resto de cromatografías líquidas no se consigue ionizar bien.
La segunda cuestión es que se tienden a usar sistemas de nanoLC con flujos muy bajos, es decir, se utilizan columnas con diámetros internos muy pequeños. Se utilizan estas columnas por una cuestión de 3 Proteómica libre de gel aumentar al máximo la sensibilidad. Cabe recordar que, en cromatografía, se considera que al reducir el diámetro a la mitad, aumenta cuatro veces la sensibilidad.
Además, gracias al espectrómetro de masas se consigue una gran resolución con poca cantidad de muestra.
La cantidad de muestra necesaria para un análisis proteómico completo acostumbra a ser muy baja, sino, las proteínas más abundantes podrían saturar el espectrofotómetro.
Sistema de HPLC-Chip: tienen una forma de hacer las columnas algo distinta. Se trata de un sistema algo microfluídico en la columna. En el chip hay un pequeño canal donde se localiza la columna.
Conceptos Top-down y Bottom-up Se trata de conceptos que tienen que ver con el tipo de componente (proteínas o péptidos) que metemos en el espectrómetro de masas.
Hablamos de top-down (de arriba a abajo) cuando partimos de la proteína y, a partir de su fragmentación, la identificamos. En cambio, cuando introducimos péptidos, hablamos de bottom-up (de abajo a arriba).
Hay gente que aplica la diferencia entre top-down y bottom-up en función de la especie que es separada.
Es decir, hay gente que con top-down se refiere a separación de proteínas y con bottom-up se refiere a separación de péptidos. Aplicando esta definición, la electroforesis bidimensional es considerada topdown y la proteómica libre de gel, bottom-up.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Proteómica Shotgun - hace referencia a cuando, mediante masas/masas (MS/MS) se separan péptidos.
Como se identifican proteínas a partir de péptidos, estas aproximaciones libres de gel son, en muchos aspectos, sinónimas de las Bottom-up. Esta técnica es una analogía a la shotgun DNA sequencing.
Reducir complejidad (fraccionamiento antes de la LC-MS) Ya que la muestra se trata del proteoma entero, hablamos de una muestra de gran complejidad. Partimos de muchas proteínas que fragmentamos obteniendo miles de péptidos. Además, al ionizar, cada péptido puede coger varias cargas, por lo que de cada péptido podemos obtener distintas relaciones masa/carga y con ello diversas señales.
También tenemos que contar con el fenómeno se resampling: el espectrómetro obtiene un espectro de masas por cada segundo, pero lo más probable es que cada péptido (todas las moléculas de un mismo péptido) tarde más de un segundo en salir. Esto supone que una misma relación masa/carga aparezca representada varias veces en el espectro.
Por todas estas cosas se ha observado que la resolución que se alcanza con estas técnicas no es suficiente para analizar un proteoma completo - el proteoma tiene una complejidad demasiado elevada como para ser resuelto en dos dimensiones (relación masa/carga y tiempo).
Por tanto, era necesario añadir una tercera dimensión: se logró mediante un pre-fraccionamiento de la muestra.
Métodos de pre-fraccionamiento 1D-electroforesis (SDS-PAGE) + cortar bandas Queremos analizar un proteoma completo: lo extraemos y separamos las proteínas en un gel de electroforesis desnaturalizante. Se corta el gel en varias bandas, cada una de las cuales se coloca en un tubo al que se le echa tripsina. Gracias a la tripsina las proteínas quedan digeridas en péptidos. Los péptidos generados se extraen y se incorporan al sistema líquido de masas/masas.
Así, hemos dividido el proteoma en varios grupos para reducir la complejidad de estos.
Para realizar esta técnica es necesario perder más tiempo.
5 Proteómica libre de gel Otra opción para el pre-fraccionamiento es hacer un isoelectroenfoque preparativo.
Cromatografía líquida multidimensional También podemos usar otra cromatografía líquida extra antes de hacer la cromatografía de fase reversa (cromatografía líquida multidimensional). Es habitual emplear la cromatografía de intercambio iónico. Esta aproximación se puede hacer online u offline, para lo que será empleado usar dos cromatógrafos (tras la primera cromatografía se van recogiendo las distintas fracciones que se van incorporando al segundo cromatógrafo). Si la hacemos online necesitamos un sistema que tenga las dos columnas juntas: a medida que los analitos van saliendo de la primera columna, se van incorporando directamente a la segunda.
En el ejemplo de la imagen, se ha hecho una cromatografía de fase reversa a pH ácido seguida de una cromatografía de fase reversa a pH básico - los tiempos de retención en las dos cromatografías no serán los mismos.
La electroforesis desnaturalizante es el sistema de pre-fraccionamiento que parece que funciona mejor, además de ser el más barato.
Estrategias cuantitativas Habitualmente en proteómica, además de la identificación de proteínas, el objetivo es cuantificar.
Label free Se trata de un sistema que es empleado a la hora de comparar entre muestras distintas que, normalmente, corresponden a condiciones diferentes. Para comparar entre las muestras, se usa la información cuantitativa de la intensidad de los picos - Spectral Count: se cuenta el número de veces que se identifica una proteína determinada. La ventaja es que tenemos un rango dinámico mayor.
6 Cuando se realiza este tipo 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV de aproximaciones, la cuantificación no funciona demasiado bien. En la imagen podemos ver un ejemplo en el que se ha analizado la misma dos veces. En este caso, es de esperar que la primera cuantificación sea igual a la segunda cuantificación, es decir, que todos los puntos aparezcan representados en la gráfica en la diagonal.
Podemos ver que en los péptidos más abundantes, tenemos cierta reproducibilidad pero, a medida que disminuye la abundancia encontramos grandes diferencias entre la primera y la segunda cromatografía, por lo que la cuantificación mediante este sistema resulta inútil. En general se cumple siempre este patrón, es decir, el caso del ejemplo no es un caso aislado.
Marcaje isotópico (Isotope labelling) Para solucionar el problema de la cuantificación que presentaba la estrategia label free, se desarrolló el marcaje isotópico. Las dos muestras a comparar se marcan diferencialmente con isótopos de masas distintas, por ejemplo, C12 y C13. Las dos muestras diferencialmente marcadas se mezclan y se procesan en paralelo. El espectrómetro de masas da dos picos por cada péptido que se corresponden a la versión ligera (marcada con el isótopo ligero) y a la versión pesada.
Tipos de marcaje isotópico - Forma SILAC o marcaje metabólico: se añaden aminoácidos pesados y aminoácidos ligeros en el medio que se incorporan a las proteínas. Es decir, se trata de un marcaje isotópico estable mediante aminoácidos en cultivo. Se emplea para comparar dos condiciones distintas en células que crecen en cultivo: cultivos A y B se hacen crecer en presencia de aminoácidos distintos - pesados y ligeros.
Lo más común es usar argininas y lisinas marcadas con C13 y N15.
Una vez llevado a cabo el proceso, se extraen las proteínas de cada cultivo, se mezclan y se analizan. Por cada péptido obtendremos doble señal (que se corresponde a los isótopos pesados y ligeros).
7 Proteómica libre de gel Para calcular la proporción, es decir, para obtener información cuantitativa, se calcula el ratio entre isótopos pesados e isótopos ligeros.
En la gráfica vemos una representación del ratio entre péptidos marcados con aminoácidos pesados y marcados con aminoácidos ligeros. Como se trata de rectas, lo ideal es que todos los valores sigan la recta con valor 1 (la mayoría de puntos se encuentran en la recta y como se trata del análisis comparativo entre dos condiciones, el ratio debería ser igual para todos los fragmentos de proteína).
Podemos comprobar que, aunque los resultados no son del todo reproducibles, son mejores que los obtenidos con Label-free (la desviación es mucho menor).
Como ya se ha dicho, los aminoácidos más empleados para la técnica SILAC son Arginina y Lisina. Esto se debe a que la tripsina corta cada vez que aparecen estos aminoácidos en la secuencia, por lo que, al marcarlos te aseguras de que cada péptido tríptico tendrá un aminoácido marcado. Además, si la digestión es lo suficientemente eficiente, cada péptido tendrá solo uno.
El hecho de que los aminoácidos se añadan al medio de cultivo representa una limitación ya que no pueden incorporarse para el análisis de muestras humanas (la persona a la que se realizase un análisis de este tipo debería ingerir durante mucho tiempo los aminoácidos pesados). Tampoco puede llevarse a cabo en animales o en células con un turn-over bajo como las neuronas (que no crezcan).
En estos caso debe realizarse un marcaje químico.
- ICAT o Isotope Coded Affinity Tags En este caso, ya estamos hablando de marcaje químico. Se trata de un reactivo que consta de varias partes: Grupo yodoacetamida: es una estructura que reacciona muy fuertemente con cisteínas, a las que se une covalente e irreversiblemente.
En el otro extremo nos encontramos un grupo biotina que tiene una gran afinidad por la proteína avidina. Por tanto, el añadir biotina a las proteínas nos facilita la purificación en columnas de avidina.
Por último, tenemos la región linker o espaciadora, de la que podemos encontrar dos versiones diferentes, la ligera, que tiene H y la pesada, que tiene deuterio. La diferencia entre ligera y pesada es de 8 Daltons.
Tenemos dos condiciones biológicas distintas en las que extraemos las proteínas. Antes o después de la tripsina, añadimos el reactivo: en las proteínas de una de las condiciones añadimos el reactivo pesado (deuterio) y las proteínas de la otra condición, el ligero (H). Después, aislaremos en una columna de avidina los péptidos que han unido el reactivo (gracias a la biotina). Como nos quedamos solo con los péptidos que tienen cisteínas, reducimos la complejidad de la muestra. Después, se realiza un análisis con masas/masas.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La relación entre el primer pico y el segundo pico será igual a la relación del péptido en ambas muestras.
En el ejemplo de la imagen no observamos una diferencia de 8 Da entre los dos picos, sino de 4 Da. Esto se debe a la carga de los péptidos, ya que estamos midiendo la relación masa/carga, no solo la masa. Si el péptido en cuestión tiene dos cargas en lugar de una sola, la diferencia será de la mitad.
- iTRAQ o Isobaric tags for relative and absolut quantification Se trata de un método de marcaje químico más complejo basado en un compuesto de tres partes: NHS, que reacciona con grupos amino.
Reporter group: existen diferentes variantes con marcajes con N y con C, que pueden tener distintas masas. Este grupo puede coger carga, por lo que puede indicar qué cantidad de péptido hay (es la región reportera).
Balance group - neutral loss: esta región incorpora isótopos o carbonos de forma que compensa la masa del reporter group. Esta parte del compuesto no coge carga y se pierde durante el proceso.
Existen hasta 8 isótopos de iTRAQ diferentes, en los que la masa es idéntica. Los isótopos se diferencian en la proporción de la masa entre el reporter group y el balance group (como ya hemos dicho, ambos grupos tienen distintos isótopos de manera que se compensan las masas - la masa de la molécula es siempre la misma).
9 Proteómica libre de gel Durante la cromatografía líquida todos los isótopos se mueven de la misma manera, ya que tienen la misma masa. Al digerir con tripsina, se fragmentan de modo que se libera el reportero. La cantidad de reportero nos indicará la cantidad de péptido que contenía la muestra. Obtenemos un espectro de masas en el que, en una zona, aparecen una serie de picos que se corresponden a los distintos grupos reporteros: la proporción de cada pico indica la cantidad de proteína de la muestra.
El nombre de etiquetas isobáricas (isobaric tags) viene de que todos los isótopos pesan exactamente lo mismo.
En las primeras versiones, solamente había 4 isótopos distintos. Ahora hay como mínimo 8, por lo que podemos analizar hasta 8 muestras simultáneamente.
En algunas ocasiones podemos usar otra forma de marcaje: usando un estándar interno. La principal limitación de los marcajes químicos es el número de péptidos, por lo que hay gente que usa una referencia interna. Se puede tener una línea celular marcada con isótopos pesados de la que se extraen las proteínas marcadas pesadamente. Se añade una cantidad de este proteoma para que actúe como referencia para todas las muestras - el número de muestras que sean.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Proteómica dirigida La idea es que, en lugar de tratar de identificar todo el proteoma, tratamos de identificar unas proteínas concretas. El proteoma humano (o de cualquier otra especie) es muy complejo, por lo que es muy difícil analizarlo e identificar todas sus proteínas. Para solventar este problema tenemos dos opciones:  Desarrollar aparatos muy potentes  Centrarnos en lo que nos interesa y optimizar las condiciones para detectar únicamente las proteínas de interés  proteómica dirigida.
Muchas veces, solo nos interesa conocer y analizar un grupo de proteínas concreto. Como sabemos qué proteínas queremos analizar, las buscamos en una base de datos que contiene información de los péptidos que han ido detectando los grupos de investigación en sus experimentos (número de péptidos por proteína y espectros de masas). Se genera un listado de los péptidos y fragmentos que es más probable detectar (ya que alguien ya los ha detectado). Nos centramos en los iones que han sido detectados y optimizo las condiciones para detectar solamente estos iones - los detectaré con mucha más especificidad y sensibilidad.
Cuando tripsinizamos una proteína, obtenemos diferentes péptidos. Al analizarlos por espectrometría de masas algunos que, por el motivo que sea (se han cortado mejor, se ionizan mejor, ...) se detectan más eficientemente que otros. Lógicamente, son estos péptidos que mejor se detectan los que nos interesan. Podemos deducir cuáles son estos péptidos a partir de la información de las bases de datos: los péptidos que más se detectan serán los que se detectarán más fácilmente.
Un péptido único es aquel que cuya secuencia se encuentra solo en una única proteína. A la hora de hacer proteómica dirigida, los péptidos únicos también nos interesan. Cuando un péptido aparece tras las digestión de más de una proteína, al detectarlo no sabremos exactamente qué proteína hemos detectado.
Por tanto, en proteómica dirigida hablamos de péptidos proteotípicos, que son aquellos péptidos únicos que sol fácilmente detectables por espectrometría de masas.
El objetivo de la proteómica será centrarnos, siempre que sea posible, en los péptidos proteotípicos.
MRM - Multiple-Reaction Monitoring Como conocemos las relaciones masa/carga y los fragmentos que queremos detectar, hacemos que los dos analizadores de masas se centren directamente en detectar aquello que nos interesa . El primer analizador de masas está fiado en la relación masa/carga del ión parental y el segundo analizador de masas en la medida de los posibles fragmentos resultantes de este.
11 Proteómica libre de gel Como analizadores de masas va bien usar quadrupoles, aparatos bastante sensibles y fiables cuya limitación principal es la resolución. La baja resolución resulta un problema a la hora de hacer un rastreo completo pero no es una limitación para analizar una relación masa/carga determinada.
Se emplea la máquina nLC-QQQ (con tres cuadrupoles).
Flujo de trabajo Queremos detectar una proteína o conjunto de proteínas concreto. Como ya hemos dicho, buscamos en una base de datos (Peptide Atlas, Proteomics Db) información sobre los péptidos proteotípicos y las transiciones (parejas entre la masa del ión parental y los "iones hijos", es decir, la relación entre los datos a fijas en los analizadores). En la base de datos se nos sugieren cuatro transiciones por cada péptido (las más observadas).
En el siguiente ejemplo vemos un artículo sobre la primera vez que se usó esta forma de trabajar.
Analizaron hasta qué nivel de sensibilidad podían detectar proteínas de levadura mediante este método y, por otro lado, aplicaron esta tecnología a un problema real.
Para la primera parte del experimento cogieron 100 proteínas de levadura que cubrían todo el rango dinámico - para cada proteína escogieron 5 péptidos proteotípicos. En los casos en los que la proteína no se había detectado nunca emplearon un software para elegir los péptidos. Detectaron unas 90 proteínas, entre ellas algunas muy poco abundantes.
En segundo lugar, plantearon si se podía aplicar la proteómica dirigida a un problema real: intentaron analizar los niveles de expresión de múltiples proteínas.
En presencia de glucosa, la levadura tiende a producir gran cantidad de etanol. Cuando la glucosa se acaba, la levadura emplea el etanol que ha producido para seguir creciendo. Ellos analizaron los cambios de expresión de las enzimas que participan en estas rutas metabólicas cuando disminuye la cantidad de glucosa.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En este estudio pudieron observar como había determinadas enzimas que aumentaban mucho su expresión, mientras otras apenas aumentaban y otras enzimas mantenían su expresión estable.
Así, demostraron que esta técnica podía aplicarse y que resultaba eficaz: en una hora detectaron caso 50 proteínas.
Este trabajo abrió el camino de la aplicación de la proteómica dirigida para según qué estudios.
La proteómica dirigida tiene interés desde el punto de vista de la búsqueda de marcadores, en la detección de proteínas del plasma, … Hay gente que piensa que la espectrometría de masas dirigida podría suplantar las técnicas que se usan ahora.
Nos encontramos con un pequeño problema a la hora de aplicar proteómica dirigida al plasma. En términos de rango dinámico, el plasma es el proteoma más profundo. La proteína menos abundante que se ha conseguido detectar con estos métodos en el plasma es la fibronectina, que tan solo se encuentra en la mitad (en términos de rango dinámico) del proteoma constituido por el plasma. El problema es que muchas de las proteínas que resultan interesantes como biomarcadores se encuentran en menor concentración.
Para vencer esta complicación se ha propuesto la aproximación SISCAPA que intenta juntas la espectrometría de masas con la detección con anticuerpos. Como el proteoma plasmático es demasiado profundo, se intenta enriquecer con anticuerpos las proteínas menos abundantes. Se desarrollan anticuerpos contra los péptidos proteotípicos. Tras tripsinizar el plasma, mediante estos anticuerpos anti el péptido de interés, lo enriquecemos, haciendo que el péptido "ascienda" hacia la zona detectable. A continuación, se analiza con MRM.
Para tratar de hacerlo más cuantitativo, se añade una pequeña cantidad del péptido marcado con un isótopo pesado.
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