Resum article microarrays (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular de Sistemes
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 14/03/2016
Descargas 7
Subido por

Vista previa del texto

Article: A Concise Guide to cDNA Microarray Analysis – II S’explica l’optimització dels següents aspectes del procediment de l’anàlisi de cDNA en un microarray: - Amplificació per PCR del cDNA dels clons Lligació dels productes de PCR al microarray Marcatge de la mostra (al article posa de la sonda, això és perquè en el passat es confonien els dos termes, però nosaltres ara sabem que és de la mostra perquè no tindria sentit marcar la sonda) Hibridació de la mostra en el microarray Estratègies per normalitzar les dades de l’anàlisi  INTRODUCCIÓ: El procés d’anàlisi de l’expressió es pot dividir en 3 etapes principals: 1) Fabricació del array 2) Preparació de la mostra i hibridació 3) Recollida de dades, normalització i anàlisi  FABRICACIÓ DEL ARRAY: 1. Amplificació per PCR per a la preparació de clons: es necessita una gran quantitat de clons ja que els microarrays presenten una alta densitat de sondes en una superfície molt petita (spot) 2. Purificació del producte de PCR: s’eliminen els nucleòtids i primers lliures 3. Array Printing: unió dels productes de PCR a cadascun dels spots  PREPARACIÓ DE LA MOSTRA I HIBRIDACIÓ: 1. Extracció de RNA 2. Marcatge de RNA a. RNA total: s’usen dNTPs marcats  Com es marquen els dNTPs? S’ha vist que la incorporació directa de Cy3 i Cy5 pot generar artefactes durant la hibridació. És per aquest motiu que s’ha buscat una solució que consisteix en el següent: o Síntesi de cDNA amb dNTPs que tenen el grup amino marcat amb allyl per a les dues mostres (suposem que volem fer una comparació de patrons d’expressió de dues mostres) o Unió covalent del grup allyl amb NHS-èster de fluor de cianina. Cadascuna de les mostres es marcarà amb un fluorocrom diferent. Aquest procés és més laboriós que el típic, però evita el soroll de fons i és més barat.
o Ànalisi de la reacció de marcatge: aquest pas és essencial abans de dur a terme la hibridació al microarray.
Cal tenir en compte que Cy3 i Cy5 són fotosensibles, de forma que s’ha d’evitar l’exposició a la llum durant el marcatge, la hibridació, el rentat i el procés d’escanejat.
b. mRNA: es marquen els primers de oligo(dT), aquest pas permet l’estalvi de la posterior purificació del mRNA respecte al total 3. Hibridació: l’objectiu és que aquesta es produeixi amb una alta especificitat i amb el mínim background a. Prehibridació: es bloquegen els grups amino lliures del slide amb una solució d’albúmina bovina al 1% b. Hibridació   RECOLLIDA DE DADES, NORMALITZACIÓ I ANÀLISI o Escanejat del slide  Canal Cy5 (633 nm): s’escaneja primer aquest perquè és més fotosensible  Canal Cy3 (543 nm) o Processat de la imatge  Identificació dels spots que presenten gens, distingint-los respecte els artefactes i contaminants  Estimació del background: identificació dels spots i determinació del soroll de fons local  Substracció del background de la senyal de cada spot o Normalització de dades i anàlisi: la normalització de les intensitats de fluorescència relatives és necessària per ajustar les diferències en el marcatge i detectar l’eficiència del marcatge fluorescent i les diferencies en la quantitat de RNA inicial de les dues mostres. Hi ha diferents estratègies de normalització, cadascuna fa una determinada assumpció:  Ús de la fluorescència total mesurada: s’assumeix que la quantitat de RNA marcat amb Cy3 i Cy5 és la mateixa, es a dir, que la mitjana del ratio d’expressió de tots els spots de l’array ha de ser 1. De forma que, la intensitat entre dos spots pot ser diferent, però quan es fa la mitjana de centenars de spots de l’array, aquestes fluctuacions desapareixen, conseqüentment, la integració total integrada en tots els spots del array ha de ser equitativa en els dos canals. De forma alternativa, es poden afegit uns controls en concentracions creixents però equimolars per a les dues reaccions de marcatge i posteriorment la suma de les intensitats d’aquests spots ha de ser equivalent.
 Ús de l’anàlisi de regressió lineal: s’assumeix que, en mostres relativament similars, els gens s’expressaran a nivells gairebé constants. En conseqüència, el Scatterplot (vist en el Tema 3) de la intensitat de Cy5 mesura respecte la de Cy3 tindrà un pendent de 1. Les intensitats mesurades amb l’addició de controls equimilars ha de ser similar. Es tendeix a reescalar les dades i ajustar el pendent a 1.
 S’assumeix que existeix una sèrie de gens housekeeping que tenen una mitjana d’expressió i una desviació estàndard independentment de la mostra, en aquest cas, el ratio Cy5 i Cy3 per aquests gens pot ser modelat per ajustar-lo a 1.
o Identificació dels gens que presenten diferent expressió QÜESTIONS A RESOLDRE: (Cert o Fals) o o o o o o o o o Els microarrays són assaigs de l’expressió gènica diferencial entre mostres de RNA. Cert La puresa i qualitat del RNA original assajat és important de cara als resultats. Cert Un cop la mostra es marca amb fluorocroms, és important una correcta neteja d’aquesta per evitar hibridacions o background inespecífic. Cert Les condicions d’hibridació i de rentat són importants de cara a obtenir un resultat específic i minimitzar les reaccions creuades. Cert En quant al mètode d’extracció d’ARN, es recomana l’ús d’un sistema d’extracció total (tipus reactiu Trizol) i una posterior neteja de polisacàrids depenent del teixit. Cert El procediment de marcatge de les mostres amb fluorocroms es pot fer de diferent formes, però la més senzilla consisteix en incorporar nucleòtids trifosfat marcats amb un fluorocrom durant el pas de síntesi de cDNA a la reacció de retrotranscripció. Cert Si volem treballar només amb ARNm hi ha dues maneres d’obtenir-lo: a) a partir del RNA total fent la retrotranscripció amb oligo(dT) com a primer o b) partint directament d’ARNm obtingut amb columnes d’oligo(dT) d’afinitat. Cert 1,5 µg de PolyA RNA equivalen a 50-100µg de RNA total. Cert Els fluorocroms més usats són el Cy3 i el Cy5, malgrat això, se sap que aquests fluorocroms s’incorporen amb diferent grau a les cadenes de cDNA i poden produir artefactes d’hibridació específics de fluorocrom. Cert o o o o o o o o o o o Una alternativa a l’ús de nucleòtids marcats amb fluorocroms, és el marcatge a posteriori gràcies a un grup aminoalil que incorpora el fluorocrom amb un èster. Cert Els fluorocroms Cy3 i Cy5 són fotosensibles i s’han de manipular minimitzant l’exposició lumínica.
Cert És molt útil comprovar l’eficàcia de les reaccions de marcatge abans de realitzar la hibridació. Això es fa mesurant l’absorbància de cada mostra a 260 nm, 550 nm i 650 nm i calculant la quantitat de cDNA 37 ng/mL de cDNA. Fals Es calcula la incorporació de cada colorant i s’estima que una incorporació de 150 pmol de colorant és òptima per hibridar. Cert Prehibridació i hibridació: com que els portaobjectes tractats amb aminosilà són unidors de DNA amb molt alta eficiència, abans d’hibridar hem d’inactivar-los o bloquejar-los incubant el slide amb una solució d’albúmina a l’1%. Cert Després es procedeix a hibridar amb la mostra marcada amb l’objectiu d’obtenir alta especificitat i mínim background. Cert A continuació es renten els slides i s’escanegen els resultats. L’escaneig es fa amb un scanner que detecta primer el Cy5 i després el Cy3. Cert Es fa una imatge TIFF dels resultats que s’analitzen per veure els gens diferencialment expressats i l’expressió relativa de cada gen. Cert El processat de la imatge implica tres fases: 1) identificar spots i diferenciar-los de senyals espúries 2) estimació del background i 3) substreure el background de la senyal de cada spot. Cert Després té lloc la normalització i anàlisi de les dades. Un cop les dades s’han general cal analitzarles més profundament abans d’identificar els gens diferencialment expressats. Cert La normalització de les fluorescències relatives de cadascun dels canals analitzats és necessària per ajustar les diferències de marcatge i la detecció de diferents eficiències en els marcatges fluorescents i en la quantitat de RNA inicial de les dues mostres analitzades. Aquests problemes poden causar un canvi en el ratio Cy5/Cy3 i les intensitats s’han de reescalar abans de ser analitzades. Cert ...