DGM- Tema 4. Tècniques citogenètiques moleculars (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 14
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 4 mfiguls TEMA 4: TÈCNIQUES CITOGENÈTIQUES MOLECULARS (mirar fotos de FISH a les diapositives) 10/3/15 Hem parlat de tècniques moleculars, però hi ha altres alteracions que sobrepassen el nivell molecular, sinó que són més cel·lulars.
Per tant, podem introduir les tècniques moleculars a nivell cel·lular, aquestes són les TÈQNIQUES CITOGENÈTIQUES MOLECULARS, que apliquen tècniques moleculars a nivell cel·lular.
Amb les tècniques citogenètiques moleculars podem: - Identificar - Localitzar: perquè no hem trencat les estructures (sobretot amb FISH). à HIBRIDACIÓ IN SITU o Amb la FISH podem § localitzar un RNA en el citoplasma o en teixits § localitzar seqüències de DNA en cromosomes o nuclis.
- Quantificar Un dels problemes de la hibridació in situ és que la sonda arribi al seu destí. Per exemple, en els mitocondris seria molt més difícil perquè estan dins de la cèl·lula, i a més, tenen membrana.
Per tant, moltes vegades no tenim senyal perquè la sonda no ha arribat. Això depèn del pretractament que hem fet abans.
HIBRIDACIÓ IN SITU fluorescent Tradicionalment la hibridació in situ es feia mitjançant radioactivitat però es van començar a utilitzar fluorocroms. La hibridació in situ fluorescent (FISH) es la que ha donat millors resultats.
Els seus principals avantatges són: - Rapidesa: detecció més ràpida que les ISH no fluorescents - Seguretat: menys perillós que l’ús d’isòtops radioactius - Versatilitat: es el seu punt més fort. En una hibridació in situ radioactiva nomes podem utilitzar una sola sonda perquè si n’utilitzem més, no podrem distingir d’on ve la senyal.
Mentre que per FISH podem utilitzar diferents sondes i veure on està cadascuna tansols utilitzant fluorocroms diferents, per tant es pot fer un anàlisi múltiple.
- Sensibilitat: major que a la resta de tècniques citogenètiques moleculars (més resolució).
- Anàlisi de mutacions cromosòmiques en cèl·lules interfàsiques: no és necessari tenir una metafase per poder observar l’alteració cromosòmica (a diferència de les tècniques citogenètiques clàssiques): Espectre d’excitació i emissió dels fluorocroms Els fluorocroms tenen un espectre d’excitació (absorció) i emissió, que són característics per cada fluoròfor. Per tant, podem utilitzar fluoròfors amb diferents espectres i distingir els diferents colors amb un microscopi de fluorescència, que permet analitzar diferents longituds d’ona (=color) segons el filtre.
mfiguls DGM- Tema 4 Detecció múltiple de RNA in situ Podem veure l’expressió de diferents gens si marquem el seu transcrit amb fluorocroms diferents.
Desenvolupament de la tècnica FISH Mostra 1. Pretractament (predesnaturalització): és un tractament que pot ser amb proteïnasa K o RNAasa. Aquest tractament elimina o bé les proteïnes o els RNA (perquè no ens interfereixin).
2. Si analitzem DNA, hem de desnaturalitzar tant la mostra com la sonda. La desnaturalització del DNA no ha de ser molt severa (poc pH i Tº), perquè hem de mantenir les estructures.
Per tant, en la desnaturalització de la mostra utilitzarem agents densaturalitzants.
3. Fixació de la mostra, es fa amb Carnoy.
Sonda: 1. Marcat 2. Fragmentació: per tal d’augmentar la hibridació.
3. Desnaturalització: la desnaturalització de la sonda pot ser mitjançant Tº o pH.
4. Hibridació o Hibridació (renaturalització) o Rentats 5. Detecció o § Incubacions § Rentats Contratinció: mitjançant clorur de propidi. La contratinció és necessària per poder detectar l’estructura, és a dir, per poder posar de manifest els cromosomes o nuclis objecte del nostre estudi.
Imaginem que marquem regions centromèriques, però llavors nomes veurem un color i no sabrem on estan els nuclis, per això, fem una contratinció del nucli en vermell, així podrem delimitar-lo. Igual si volem marcar els telòmers.
mfiguls DGM- Tema 4 o Tractament amb antifade: L’antifade es un antiesmorteïdor: tots els senyals fluorescents s’emmorteixen, s’apaguen. L’antifade manté durant molt temps l’emissió de la fluorescència.
TIPUS DE SONDES - De regió específica Telomèriques : són específiques de cada cromosoma (només pintaran el telòmer d’un parell de cromosomes).
- Subtelomèriques: reconeixen seqüencies repetitives que estan presents en tots els telòmers, per tant, ens marcaran tots els telòmers.
- Centromèriques: reconeixen tots els centròmers - Pericentromèriques: reconeixen regions específiques del cromosoma, no marcaran tots els cromosomes, sinó nomes un parell.
- Cromosòmiques: marquen tot un cromosoma sencer - De braç cromosòmic: tenim sondes tant pel braç p com el q - Genòmiques: ens marquen tot el genoma (veure imatges a les diapositives) 1. Sondes centromèriques Si marquem els centròmers d’un parell de cromosomes, en funció de senyals fluorescents que tingui el nucli podem saber quantes copies tenim del cromosoma.
Sondes centromèriques per als cromosomes sexuals: DGM- Tema 4 mfiguls Si volem veure els cromosomes X d’un individu, hem de marxar el cromosoma X i també el cromosoma Y. Ja que si només utilitzem una sonda pel cromosoma X i cap per l’Y només deduirem si te X però no podrem diferenciar X0 de XY.
Es pot detectar tant en metafase com en interfase.
Moltes vegades hem d’incorporar controls per obtindre alguna referència (per exemple, per diferenciar trisomia de triploïdia). Els controls ens proporcionen una certa seguretat.
Diagnòstic prenatal d’aneuploïdies Tradicionalment es feia el cariotip de cèl·lules del líquid amniòtic, prèviament cultivades i en estat de metafase. Però treballar amb cèl·lules de líquid amniòtic es complicat perquè s’ha d’estimular la divisió i, si no s’aconsegueix, cal demanar un altra preparació.
Actualment, s’està utilitzant la FISH per al diagnòstic prenatal d’aneuploidies, en la que s’utilitzen sondes centromèriques.
La FISH presenta diferents avantatges de la FISH respecte a la tinció de bandes convencional: - La tècnica FISH permet detectar aneuploïdies en cèl·lules que no estan en divisió (nuclis interfàsics). Per tant, no hem d’estimular, el que fa que l’anàlisi sigui més ràpid (amb 2-3 dies obtenim els resultats, cosa que amb l’anàlisi convencional es tarda unes dues setmanes) - el cariotip te l’avantatge respecte al FISH que vas a un punt concret: es poden detectar altres alteracions cromosòmiques que no es detecten amb FISH (ex. aneuploïdies provocades per edat avançada). Però les aneuploïdies que es detecten en un embaràs, les quals impliquen un risc, són el 13, 18 , 21 i els cromosomes sexuals. L’aneuploïdia més freqüent es la trisomia del 21. La resta d’aneuploïdies no cal detectar-les perquè són inviables. En molts laboratoris es conjuguen sondes per detectar aneuploïdies en diferents cromosomes.
2. Sondes pantelomèriques Variacions en la llargada dels telòmers Hi ha moltes malalties que afecten a la llargada dels telòmers. Els telòmers es poden observar en interfase com metafase.
Les cèl·lules embrionàries tenen capacitat telomeràsica i la llargada del telòmer es va mantenint. Però en les cèl·lules somàtiques el telòmer es va escurçant cada cop més.
DGM- Tema 4 mfiguls Les sondes pantelomèriques es poden utilitzar com a element de diagnòstic o com a suport d’aquest: si mesurem el telòmer estem mesurant les conseqüències i les causes poden ser diverses.
En moltes patologies on es dona l’escurçament dels telòmers presenten alteracions del sistema immunitari, afecten al sistema hematopoètic. Hi ha pocs glòbuls blancs, anèmia, etc. això es pot diagnosticar per diferents tècniques.
Algunes malalties hereditàries presenten translocacions en el gen de la telòmerasa o en el gen que codifica el RNA de la telomerasa, donant lloc a un escurçament ràpid d’aquests. Cada generació els símptomes son més greus perquè els telòmers es van escurçant de generació en generació.
Q - FISH Podem utilitzar FISH per quantificar, de manera que en cromosomes metafàsics podem detectar els quatre telòmers del cromosoma. S’han desenvolupat sistemes de software per quantificar la intensitat de les senyals fluorescents. Aquest sistema és la Q-FISH, que ens dona una informació de cadascun dels cromosomes i cadascun dels telòmers de cada cromosoma d’una cèl·lula.
Per Southern també podríem fer-ho però no obtindríem informació de una cèl·lula sinó en global. El que es fa es fer talls en dianes molt concretes, no son dianes que es troben a l’interior de les regions repetides i, d’aquesta manera, al tallar, la regió telomèrica es queda intacta. Si hibridem amb una sonda específica observem una dispersió de grandària. Amb això ens podrem fer una idea global de la grandària dels telòmers, no de forma específica de cada cèl·lula.
DGM- Tema 4 mfiguls Disposem d’un conjunt de tècniques que podem utilitzar en funció del que ens interessi. Hi ha casos que serveixen totes i altres que preferiblement és una.
3. Sondes de regió específica Les utilitzem quan ens interessa detectar que passa en una regió concreta d’un cromosoma de l’individu. Aquesta sonda detectarà aquesta regió.
Per a que es poden fer servir? La FISH és una tècnica d’elevada resolució que permet detectar anomalies submicroscòpiques inclòs en els nuclis de cèl·lules interfàsiques. És molt més resolutiva que les tècniques bàsiques.
Hi ha moltes patologies associades a microdelecions o microduplicacions (que es mostren a la taula). Aquestes, son regions petites repetides que estan per sota del nivell de resolució de les tècniques de detecció de bandes. Per tant, necessitaríem treballar amb cromosomes poc condensats i fins i tot així seria complicat torbar alguna cosa.
Tenim diversos nivells de resolució: • Tinció de bandes en cromosomes metafàsics (>5Mb). És l’estat de màxima condensació, amb aquesta tinció tradicional no podem detectar una deleció més petita de 5 Mb.
• FISH en cromosomes metafàsics (>1Mb). Amb FISH ja podríem detectar la deleció que no havíem detectat abans, amb el bandeig. Per tant, una deleció de l’ordre de 2-3Mb es molt fàcil de detectar-la per FISH.
• FISH en cromosomes interfàsics (20kb-1Mb). Com a més podem detectar sondes en interfàsics, aquí la resolució augmenta molt més.
• FISH en DNA estès (5kb-700kb)(1-2kb) Per tant, la capacitat de resolució de les tècniques d’hibridació in situ fluorescent és molt major.
DGM- Tema 4 mfiguls Detecció de microdelecions: Ex/ Síndrome de Williams / Síndrome de Digeorge - Williams: És una patologia produïda per una microdeleció (deleció 7q11.23) que inclou el gen de l’elastina (Williams), que codifica una proteïna que contribueix a l’elasticitat dels vasos sanguinis.
- Digeorge: és una patologia produïda per una microdeleció del braç llarg del cromosoma 22). Tenen afectat el sistema immunitari i poc desenvolupades la glàndula paratiroidea i la melsa.
Aquestes microdelecions amb FISH són molt fàcils de detectar, però amb bandes és complicat. A més, utilitzem una sonda d’un altra regió del mateix cromosoma, normalment de la regió centromèrica, com a control. Això és perquè a metafase tenim identificat cada cromosoma però en nucli interfàsic veure una senyal no ens dona cap informació. Si aquesta senyal està associada a la del control podem saber que hi ha dos cromosomes i que un d’ells presenta una deleció.
Per tant, la FISH una eina útil en el cas de microdelecions, microduplicacions i algun tipus d’alteració que està per sota del nivell de resolució de les tècniques convencionals.
Ex/ Trencament 17cen-p53 que origina la pèrdua del p53 També podem estar interessats en veure que passa en una regió concreta, com per exemple el gen 17cen-p53. Un mal pronòstic per processos cancerígens es la pèrdua d’activitat del gen p53. En oncologia a l’inici sol fer-se un diagnòstic per veure les possibles alteracions a gens concrets, que solen estar presents a gens tumorals.
Normalment el pronòstic es basa en veure si hi ha pèrdua d’heterozigositat mitjançant marcadors. Però també es pot fer amb FISH per veure si s’ha perdut la regió.
En principi hauríem de tenir les dues còpies en cada cromosoma. Si s’ha produït una deleció tindrem dos senyals corresponent al centròmer del cromosoma 17 però només un de la regió p53.
DGM- Tema 4 mfiguls (veure carcinoma de mama) Ex/ Cromosoma philadephia i gen de fusió ABL-BCR En molt de casos trobem tumors on predomina un tipus d’alteració cromosòmica. En el cas el cromosoma Philadelphia, l’oncogen afectat és el gen ABL. Si volem saber si les dues regions es transloquen dissenyem dues sondes específiques: una pel cromosoma 9 (gen ABL, en vermell) i una pel cromosoma 22 (gen BCR, en verd).
- Així doncs, si fem aquestes sondes, en una cèl·lula interfàsica no mutada trobaríem els senyals separats. Per tant esperarem un nucli amb 4 senyals.
- si s’ha produït la translocació les senyals estarien juntes perquè es produeix un gen de fusió (ABL-BCR). Si es produeix la translocació, el cromosoma 9 no es reconeix perquè no hi ha cap seqüència i el translocat presenta les dues adjacents. Per tant, en lloc de tenir quatre senyals tindrem 3 senyals diferents (verda, vermella i verda-vermella).
Ex/ Translocació 8-14 i gen de fusió IGH-MYC Un altre exemple seria el gen myc. En aquest cas es mostren les FISH marcant per una banda el gen del cromosoma 14 en vermell i per l’altra el verd. Si mirem les imatges per separat, veiem tots els punts, però si les superposem veiem que hi ha tres senyals diferents, el que ens indica la presència de la translocació. (veure imatges Diapo 31 - 33) Tandem labeling Si dissenyem sondes al voltant de punts fràgils dels cromosomes podem detectar si s’ha produït un trencament.
Es el procés contrari a abans, en lloc de tenir dos senyals en tindrem 3: un cromosoma intacte que presenta els dos senyals: verd i vermell i, després, per separat verd, i un altre de vermell.
Hi ha molts casos en que punts fràgils van associats a tumors, com per exemple el del cromosoma 12, que està associat a càncer de mama. Els punts fràgils son element de pronòstic, no de diagnòstic.
DGM- Tema 4 mfiguls Aquesta tècnica a més, ens permet observar les diferències entre no disjunció i trencament: - 3 punts grocs (verd + vermell) à no disjunció - 2 o 1 punts grocs (verd + vermell) à trencament (veure imatge Diapo 36) 4. Sondes cromosòmiques Les sondes cromosòmiques son aquelles que marquen tot un cromosoma. Gràcis a aquestes, podem mirar si aquest cromosoma té intercanvis amb altres cromosomes. Podem pintar els dos braços igual o un de cada color.
En l’exemple, veiem que hi ha una inversió pericentromèrica + translocació en une cromosoma i en un altre cromosoma hi ha un fa fusió donant lloc a un cromosoma dicèntric.
17/3/15 FISH MULTICOLOR Abans es volien obtenir sondes pels 24 cromosomes, així es podria estudiar tot el complement.
Aquestes sondes actualment es poden aconseguir amb la combinació de 5 cianines diferents, que generen fins a 24 sondes, per tant, ens permeten marcar tots els autosomes i els dos cromosomes sexuals d’humans.
Es van arribar a dos sistemes de FISH MÚLTIPLE per analitzar tot el complement: M-FISH i SKY (desenvolupats per laboratoris diferents).
- M-FISH, Multiple Fluorescence In Situ Hybridyzation (Yale university): Obtenció de cinc imatges digitals per separat per cada una de les cianines, que un software combina donant una imatge composta amb pseudocolors en funció de la composició dels fluorocroms - SKY, Spectral Karyotyping (National - Tenen poques diferències, bàsicament en una els colors son més vius que en l’altra.
Center for Human Genome Research: Obtenció d’una imatge digital composta que un interferòmetre analitza les longitud d’ona de cada pixel i assigna a cada cromosoma un pseudocolor DGM- Tema 4 mfiguls A la imatge es veu una M-FISH d’una leucèmia mieloide crònica d’humans. En aquesta es veuen diferents reordenacions cromosòmiques.
CGH: HIBRIDACIÓ GENÒMICA COMPARADA Es tenen dues mostres que es marquen diferencialment; una en verd (mostra problema) i l’altre en vermell (control). A continuaciómm les mostres de gDNA es fragmenten a l’atzar (pot ser per sonicació). A continuació es posen quantitats equimolars de cadascuna de les mostres i es fan hibridar sobre una metafase estàndard (normal o de referència).
Per tant, en principi, per cada regió competiran la mateixa quantitat de DNA marcat amb vermell i en verd, per tant s’hi uniran a l’atzar.
- Si la senyal es groga s’hi han hibridat els dos tipus de DNA. El que ens indicarà que a la mostra problema no hi ha ni guany ni pèrdua de material. No obstant la senyal no serà groga si hi ha dup/del.
- Si la senyal és vermella és que hi ha una deficiència (deleció) en la mostra del tumor Si la senyal és verda, significa que hi ha una duplicació en la mostra del tumor Per tant, l’array de cGH serveix per detectar variacions quantitatives (excés o defecte) de la mostra que analitzem respecta la mostra control o referència.
- Detecció d’aneuploïdies, pèrdues o amplificacions en tumors DGM- Tema 4 mfiguls - Detecció d’aneuploïdies en avortaments espontanis (en teixits que no solen créixer) - No resulta útil per a detectar reordenacions equilibrades ni poliploïdies Human Cot-1 DNA: és un DNA placentari enriquit amb seqüencies repetitives.
Al DNA, hi ha moltes seqüències repetitives que, al fer la CGH, poden hibridar sobre qualsevol regió complementària de la metafase. Per exemple, les seqüències repetitives dels telòmers, a l’hora d’hibridar sobre la metafase de referència, ho poden fer sobre qualsevol cromosoma ja que, a l’haver fragmentat el DNA, es perd la referència de localització.
Com controlem doncs tot aquest soroll de fons que generen les regons repetitives? • Per eliminar el soroll de fons, el que fem és afegir una quantitat relativament petita d’aquestes seqüències repetitives sense marcar.
Al fer la hibridació, és més fàcil que les seqüències repetitives marcades hibridin amb aquestes seqüències repetitives no marcades que no que hibridin amb la metafase referència.
A més de tenir les dues sondes genòmiques marcades (les dues mostres), es fa una contratinció amb DAPI, de manera que tots els cromosomes estaran marcats en blau. Un cop haguem afegit les dues mostres, les seqüències repetitives (que estan segrestades per les seqüències sense marcar de Human Cot-1 DNA) se’ns quedaran de color blavós, cosa que si no haguéssim fet la contratinció no haguéssim vist .
• Així doncs, s’espera que si hi ha la mateixa quantitat de DNA de les dues sondes es vegin els cromosomes pintats de groc, els guanys de la mostra analitzada es veuran en verd i les pèrdues en vermells.
Els colors obtinguts en la metafase els llegeix un software que ens dona un resultat. Normalment, per trobar els límits de variació dins del qual les variacions de guany/pèrdua de material són mfiguls DGM- Tema 4 normals i aleatòries el que es fa és comparar dues mostres normals entre elles, així trobem el rang sobre el que les variacions són aleatòries (el rang en que el verd i vermell varien). De manera que tots els pics que surtin d’aquest rang indicaran pèrdues o guanys de DNA.
Comparativa FISH vs CGH: Les principals diferències entre ambdues tècniques són: CGH: SKY: - Només ens indica variacions numèriques - Trenquem (homogeneïtzem) la mostra, per tant no té capacitat de localitzar les seqüències.
- El que estic analitzant directament són les sondes.
- Aplicable a qualsevol teixit (no necessitem una metafase per analitzar la mostra9 - Més ràpida i econòmica, perquè no necessitem la metafase.
La fem sobre la metafase real (del teixit problema), així podem detectar més coses (alteracions numèriques i estructurals).
És una FISH, de manera que no trenquem la mostra de manera que l’estudi pot ser in situ.
Utilitzen sondes específiques de regions per analitzar una mostra. Just al inrevés de la CGH.
No podem utilitzar mostres que provinguin d’un teixit fluorescent, perquè necessitem una metafase DGM- Tema 4 PRINS (PRimed IN situ labeling) La mostra a analitzar es prepara com a la FISH L’anàlisi de la mostra es diferent o Marcatge in situ o Elongació amb la polimerasa de DNA Taq o Nucleòtids marcats o Encebador específic (annealing) o Termociclador • • Amb aquesta tècnica, el que fem és sintetitzar de novo DNA a partir d’encebadors que ens indiquen quina és la seqüencia que volem analitzar. Normalment s’utilitza un termociclador, però no estem amplificant, sinó que nomes hi ha una síntesi.
Els encebadors, per hibridació reconeixeran les seqüencies complementaries i la polimerasa Taq sintetitzarà el DNA, com que afegim nucleòtids marcats, se’ns marca la regió sintetitzada.
Aquesta tècnica és útil quan analitzem seqüències de DNA repetitiu, ja que el senyal serà més gran. No obstant, no funciona gaire per analitzar seqüencies úniques perquè no veurem gaire senyal.
S’utilitza molt, per tant, per al DIAGNÒSTIC D’ANEUPLOÏDIES.
Prins Multicolor Es diu multicolor perquè els cromosomes queden pintats de diferents colors - Fem una primera reacció de síntesi per exemple, per al cromosoma 1, que quedarà marcat del color que estiguin marcats els dNTPs que hem afegit (per exemple, verd) - En la segona reacció, afegim un encebador per al cromosoma 9 i nucleòtids marcats de diferent color que en la primera reacció, per exemple, vermell. En aquesta reacció, es sintetitza cadena del cromosoma 9. Però en el cromosoma 1 encara tenim un extrem 3’ per continuar la reacció de síntesi, de manera que es continua la reacció en el cromosoma 1, que se’ns marca ara de dos colors (verd+vermell) - En la tercera reacció, podem posar un encebador per al 16 i dNTPs d’un altre color, com blau. En aquesta, el cromosoma 16 es marcarà (en blau), però a més, també es marcarà l’1 i el 9.
Per tant, els cromosomes es van marcant seqüencialment. En funció de les combinacions de fluorescència podem veure els cromosomes.
13 DGM- Tema 4 És molt semblant a la FISH, però, perquè s’utilitza? - és fàcil, ràpida i econòmica que FISH - però té limitacions: o No es pot analitzar qualsevol tipus d’alteracions o A vegades és difícil aconseguir suficient senyal 14 ...