Tema 10 Células madre y mecanismos de reparación (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Patología celular y molecular
Año del apunte 2015
Páginas 29
Fecha de subida 03/05/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PATOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR TEMA 10.Células madre y mecanismos de reparación Reparación tisular en repuesta a la lesión En la reparación tisular hay un componente de reparación y otro de regeneración. La REGENERACIÓN es la reparación completa de estructura y función. Requiere proliferación de las células y tejidos para reemplazar las estructuras perdidas. La regeneración por tanto depende de varias cosas, entre ellas de la capacidad proliferativa del tejido, es decir, de la presencia en éste de células madre (que son las encargadas de regenerar los tejidos).
Estas células madre se están tratando de utilizar hoy en día de manera manipulada para la medicina regenerativa.
La REPARACIÓN POR CURACIÓN es aquella que se produce en tejidos con capacidad regenerativa limitada o en aquellos casos en los que la lesión es muy grande. Consisten en la formación de cicatrices por deposición de matriz extracelular (colágeno).
Por tanto, la contribución relativa de la reparación y de la regeneración se ve influidas por: - La capacidad proliferativa de las células del tejido - presencia de células madre.
- La integridad de la matriz extracelular.
- La resolución o cronicidad de la lesión y la inflamación.
La regeneración se produce en casos de daño leve o moderado, sin disrupción de la matriz extracelular. En cambio, la reparación se produce en casos de daño severo cuando la lesión sí afecta a la matriz.
1 Patología celular y molecular En los tejidos adultos, la población de células de un tejido está determinada por los índices de proliferación celular, diferenciación y muerte apoptótica.
La presencia de células madre determina la capacidad proliferativa y regenerativa de un tejido.
En función de esta capacidad, distinguimos tres tipos de tejidos: - Tejidos en regeneración continua: el tejido se regenera continuamente, aunque no haya lesión. Por ejemplo la epidermis en las que las células se generan, se van queratinizando y acaban descamándose.
- Tejidos con alta capacidad regenerativa en los cuales las células madre solo se activan en caso de lesión, es decir, en estos tejidos solo ha regeneración cuando es necesario. Por ejemplo, el hígado.
-Tejidos sin capacidad regenerativa. Son aquellos en los que, en principio, no hay células madre, como por ejemplo, el cerebro.
TEJIDOS CON PROLIFERACIÓN CONTINUA Se caracterizan por la proliferación de células durante toda la vida y por ser tejidos con células madre que continuamente generan nuevas células: a medida que se generan las células, se diferencian hasta llegar a ser células maduras que acabarán muriendo por apoptosis. Son, por tanto, tejidos con un elevado recambio celular.
Por ejemplo, en el epitelio gastrointestinal las células se generan en las criptas y a medida que se diferencian van "subiendo".
Otros ejemplos en los que podemos encontrar estas células son otros epitelios columnares (como el del endometrio), epitelios escamosos (cavidad oral, cérvix), epitelios secretores (páncreas, glándulas salivales).
TEJIDOS QUIESCENTES 2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Son aquellos tejidos en los que la reparación solo se produce cuando hay lesión. Es por ejemplo el caso de la regeneración hepática - las células comienzan a proliferar solo cuando reciben el estímulo (hepatectomía).
Estos tejidos tienen un bajo nivel del replicación pero sus células pueden realizar una división rápida en respuesta a los estímulos y son, por tanto, capaces de reconstituir el tejido de origen.
También es el caso de la regeneración en los vasos sanguíneos: cuando se rompen vasos como consecuencia de una lesión deben generarse nuevas células para reponer el tejido dañado; las células madre dan lugar a nuevas células endoteliales.
Las células hematopoyéticas también se generan A DEMANDA, ya que por ejemplo los eritrocitos se sintetizan cuando disminuye la presión parcial de oxígeno (a pesar de que la médula ósea es un tejido en regeneración contínua).
TEJIDOS NO PROLIFERATIVOS Son aquellos tejidos que no tienen capacidad regenerativa o, al menos, tienen capacidad regenerativa dudosa. Contienen células madre que han abandonado el ciclo celular y no pueden volver a retomarlo.
Si se leen revisiones de células madre neuronales, existen artículos que demuestran que en el sistema nervioso hay células madre con capacidad regenerativa que no funcionan, es decir, que no se activan cuando reciben el estímulo (cuando hay lesión).
A este grupo pertenecen las neuronas y las células del músculo esquelético y cardiaco.
TIPOS DE CÉLULAS MADRE IMPLICADAS EN REGENERACIÓN Las células madre o Stem Cells implicadas en la regeneración son células madre adultas o somáticas que se encuentran en baja cantidad dentro de cada uno de nuestros órganos o tejidos con capacidad regenerativa. Son específicas de tejido: cada tejido tendrá su tipo particular.
En contrapartida, existen las células madre embrionarias, que tienen propiedades diferentes. Son aquellas que provienen de embriones en estado de blastocisto  son las células de la masa celular interna del blastocisto.
Por tanto, son las células madre adultas las que ayudan a regenerar/reparar tejidos después de una lesión. Como ya se ha dicho, se encuentran en cantidades pequeñas dentro de los tejidos con capacidad regenerativa.
Se encuentran en el tejido después del nacimiento y solo pueden regenerar el tipo de células especializadas del tejido del cual derivan. Es decir, tienen plasticidad limitada.
PLASTICIDAD: una célula madre de un tejido puede dar lugar a una célula adulta diferenciada de otro tejido.
3 Patología celular y molecular *Células madre hematopoyéticas: dan lugar a células de la sangre.
Las células madre del cordón umbilical son una fuente rica de células madre hematopoyéticas.
* Células madre mesenquimales: dan lugar a células del tejido conectivo y huesos.
PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS MADRE - En general, viven/se localizan en ambientes muy protegidos: los nichos. Se trata de lugares donde hay un microambiente que protege la potencialidad de las células madre.
- Tienen capacidad de autoperpetuación, es decir, puede dividirse infinitamente (una célula madre puede dividirse tantas veces como quiera).
- Tienen capacidad de división celular asimétrica: una célula madre puede dividirse dando lugar a dos células hijas o bien puede dividirse asimétricamente dando lugar a una célula madre y a una célula que ya comienza un camino hacia la diferenciación celular.
- Capacidad de reubicación y de diferenciación. Cuando las células madre se dividen de forma asimétrica, deben ser capaces de movilizarse y reubicarse - una de las células hijas resultantes (la que ya ha iniciado el camino hacia la diferenciación) debe migrar para poder diferenciarse en aquel tejido del que formará parte.
Normalmente, las células viven en sus nichos protegidos que les permiten mantener su potencialidad. Se dividen dando lugar a dos nuevas células madre por cada división. Como ya hemos visto, también pueden dividirse de manera asimétrica, dando lugar a una célula madre y a una célula que comienza el camino a la diferenciación. El conjunto de células que comienzan a diferenciarse son conocidas como CÉLULAS AMPLIFICADORAS DE TRÁNSITO. Estas células comienzan a dividirse para amplificarse, es decir, se produce un incremento de la proliferación. A medida que van proliferando, estas células se van diferenciando hacia los tipos celulares a los que darán lugar y van perdiendo la potencialidad de células madre. Finalmente, acabarán siendo células completamente diferenciadas (terminalmente diferenciadas).
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV No se conoce exactamente qué hay en el nicho que ayude a las células madre a mantenerse indiferenciadas. Se están postulando diversos factores que puedan contribuir al mantenimiento de la potencialidad: - Células de soporte - Adhesión celular - Factores solubles del tejido - Células del sistema inmunitario y sistema inflamatorio - Concentración de oxígeno - se sabe que a las células madre les agradan las situaciones de hipoxia (una manera de mantener la potencialidad en cultivo es bajando el oxígeno). La bajada de la presión de O2 hará que se activen factores de transcripción.
- Matriz extracelular Como ya hemos dicho, las células madre pueden dar lugar a CÉLULAS DE TRÁNSITO durante su división. Estas células incrementan su proliferación, adquieren un compromiso con un determinado tipo celular y se acaban diferenciando.
Existen distintas nomenclaturas para estas células de tránsito (que son todas aquellas que se encuentran entre la célula madre y la célula totalmente diferenciada); el nombre que se les da depende del tejido (por ejemplo, células hematopoyéticas) o de la etapa del proceso de diferenciación en la que 5 Patología celular y molecular se encuentran. Las células Long Term por ejemplo, son las más indiferenciadas. Las Long term se convierten en Short Term (más avanzadas en el camino hacia la diferenciación).
Los progenitores multipotentes tienen ya un cierto grado de diferenciación; son por ejemplo los progenitores hematopoyéticos de la serie mieloide y de la serie linfoide (un tipo no podrá dar el otro).
Regeneración del epitelio intestinal Como ya se ha comentado, en el colon hay células madre en el fondo de las criptas. Estas células madre solo podrán dar lugar a los cuatro tipos celulares que forman parte del epitelio del colon. Cuanto más "arriba" se encuentra la célula en la cripta, más diferenciada está.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El colon se trata de un tejido que se está regenerando continuamente.
CONTROL DE LA REGENERACIÓN Básicamente existen dos tipos de señales/elementos que regulan la proliferación en un tejido dañado: factores de crecimiento y matriz extracelular.
Los FACTORES DE CRECIMIENTO son proteínas que se unen a receptores específicos, que suelen tener actividad tirosina kinasa. La unión con los receptores provoca la activación de vías de señalización. Estos receptores regulan muchos procesos en la regeneración, como la proliferación celular, la supervivencia (ya que frecuentemente deben sobrevivir algunas células que están algo lesionadas), apoptosis (de aquellas células que tengan una lesión muy grande), migración celular, diferenciación, contractilidad.
La respuesta a un factor será específica para cada célula.
En el siguiente cuadro se muestran algunos de los factores de crecimiento que se han visto implicados en la regeneración y en la curación de heridas.
7 Patología celular y molecular Por ejemplo, el EGF hace que proliferen los queratinocitos y los fibroblastos de soporte y que migren al lugar en el que se encuentra la lesión (para que la tapen).
Como ya hemos dicho, la respuesta será específica para cada célula o tejido, por lo que un mismo cóctel de factores de crecimiento puede generar respuestas diferentes en función del tejido.
MATRIZ EXTRACELULAR Uno de los determinantes de la regeneración es que se mantenga la integridad de la matriz extracelular.
Cuando ésta está dañada, no será posible o será más difícil la regeneración del tejido.
Regula el crecimiento, la proliferación, la migración y la diferenciación de las células vivas de su interior.
La matriz celular está en constante remodelación: se sintetiza de manera controlada a la vez que se va degradando. Esta remodelación participa en el proceso de regeneración y en la curación de heridas pero también acompaña a procesos patológicos como procesos crónicos fibrosos, la invasión tumoral y la metástasis.
FUNCIONES DE LA MATRIZ DURANTE LA REGENERACIÓN - La matriz aporta soporte mecánico para el anclaje celular y la migración: las células que regenerarán el tejido pueden engancharse a la matriz e ir migrando. También aporta el soporte necesario para el mantenimiento de la polaridad (ayuda a mantener la arquitectura).
- Control del crecimiento y diferenciación celular. Componentes de la matriz extracelular regulan la proliferación o la diferenciación celular mediante la señalización a través de receptores de la familia de las integrinas - las moléculas de adhesión actúan, muchas veces, como receptores que, una vez se unen a la matriz extracelular, activan vías de señalización (que se propagan hacia el interior de la célula).
- Soporte estructural para la organización de la regeneración - si la lesión no daña la matriz extracelular, ésta dirigirá la organización de los componentes celulares del tejido que se está regenerando.
- Establecimiento del microambiente tisular - Almacén y presentación de moléculas reguladoras, como factores de crecimiento como el FGF y el HGF, que se almacenan en la matriz extracelular tras ser secretados.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV COMPOSICIÓN DE LA MATRIZ La composición de la matriz extracelular será diferente en función del tejido donde se encuentre.
Además, en función de la composición, tendrá diferentes propiedades que puedan afectar a la capacidad regenerativa del tejido.
Básicamente, la matriz extracelular se compone de proteínas fibrilares y estructurales (como colágeno), glicoproteínas de adhesión (como laminina y fibronectina), proteoglicanos y ácido hialurónico.
La glicoproteínas de adhesión, como la fibronectina, se unen a sus receptores, las integrinas.
Como ya se ha comentado, la regeneración es un proceso en el cual participan factores de crecimiento y matriz extracelular. Debe existir un Crosstalk entre los receptores de los factores de crecimiento y los factores de la matriz extracelular, como por ejemplo las integrinas. Las integrinas comparten vías de señalización con los receptores de factores de crecimiento.
Las señales que provienen de la matriz y las señales de los factores de crecimiento están ligadas, de forma que el conjunto orquesta la regeneración del tejido, que dice a la célula lo que debe hacer en un momento determinado integrando las diferentes señales.
9 Patología celular y molecular Los proteoglicanos de la matriz también pueden intervenir en la señalización implicada en la regeneración de tejidos: REPARACIÓN POR CICATRIZACIÓN Es propia de aquellos tejidos que no tienen capacidad proliferativa o que sí la tienen pero se han visto sobrepasados por la lesión y no han sido capaces de regenerar. Es decir, se produce cuando la regeneración no puede ser completa.
El hueco que ha dejado la lesión se rellena mediante la formación de cicatrices por deposición de matriz extracelular, sobre todo de colágeno.
La contribución relativa de reparación y regeneración se ven influidas por: - La capacidad proliferativa de las células del tejido.
- La integridad de la matriz extracelular.
- La resolución o cronicidad de la lesión y la inflamación 10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Características y fases de la reparación por cicatrización 1º Lesión 2º Se produce inflamación 3º Comienza a haber proliferación de fibrocitos - células de soporte o células intersticiales, que además, migran hacia la zona lesionada.
4º Angiogénesis: i la lesión ha provocado que se rompan vasos sanguíneos, la zona debe reirrigarse.
5º Se produce un pico proliferativo de los fibrocitos, que comienzan a secretar matriz extracelular se produce acumulación de colágeno (desarrollo de la cicatriz) que comienza a la vez que la proliferación de los fibrocitos.
Durante la fase de proliferación de linfocitos se forma el tejido de granulación: tejido que muestra todas las características de un tejido en inflamación y reparación (angiogénesis, presencia de células inflamatorias, deposición de matriz extracelular, …) La inflamación va ligada a los procesos de reparación; como puede verse en la gráfica, durante la inflamación también se dan angiogénesis y migración de fibroblastos, procesos destinados a la reparación tisular.
El tamaño de la herida determina la formación de cicatrices. Cuando la herida es pequeña, la piel podrá recuperar básicamente toda su función.
En cambio, cuando al herida es de gran tamaño, se producirá mucha más deposición de matriz extracelular (colágeno); el colágeno se contrae y se abulta (como puede verse en la imagen). Este colágeno sustituye a las células del tejido lesionado y forma lo que se conoce como cicatriz. Se produce la pérdida de función del tejido en la zona lesionada por la sustitución de sus células por matriz extracelular.
11 Patología celular y molecular Aquí es donde comienza a introducirse el término de tejido de granulación: se puede observar infiltrado inflamatorio, angiogénesis, fibroblastos en migración que están proliferando ( fibroblastos reactivos), deposición de matriz extracelular, … ANGIOGÉNESIS Consiste en la formación de vasos sanguíneos mediante la cual el tejido se recapilariza para que las células vuelvan a ser irrigadas.
Se puede producir de dos formas: - A partir de vasos sanguíneos preexistentes que comienzan a ramificar.
- A partir de células endoteliales que proceden de precursores de la médula ósea.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Durante la lesión se produce la acumulación de leucocitos polimorfonucleados. Las células endoteliales comienzan a proliferar y a migrar y, de manera organizada, comienzan a formar vasos sanguíneos hacia la zona lesionada.
A nivel molecular, parece ser que la angiogénesis viene guiada por las células de la punta; las células del tallo proliferan para alargar la rama del vaso mientras que las células de la punto las guían para que el vaso se dirija a la región correcta.
Se produce una señalización diferenciada: - Las células de la punta tienen receptores para factores de crecimiento que estimulan la angiogénesis - VEGF (principal estimulador de la angiogénesis). Mediante vías de señalización, esta célula hace que aumente la expresión de la proteína transmembrana DLL4, ligando del receptor Notch de las células del tallo.
- Las células del tallo captan el estímulo de DLL4 (que es insoluble).
El receptor de Notch hace que disminuya la producción del receptor de VEGF en las células del tallo, ya que solo una célula debe dirigir el crecimiento (crecimiento guiado -hacia una dirección). Además, el receptor de Notch también estimula genes de proliferación, provocando que las células del tallo proliferen.
13 Patología celular y molecular Por tanto, VEGF hace que se produzca DLL4, el ligando de Notch.
Parece ser que VEGF puede llegar a varias células endoteliales del vaso sanguíneo, provocando que se formen pequeñas ramificaciones, una de las cuales será la dominante - induce primero los receptores de VEGF. Se ha observado que las demás reciben señales para comenzar la angiogénesis.
Cada factor que interviene puede realizar una o varias funciones dependiendo del tejido en el que se encuentre. Muchos factores de crecimiento controlan los diferentes pasos de la curación de heridas.
Las CÉLULAS INFLAMATORIAS son las primeras que intervienen en la cicatrización ya que el mecanismo de inflamación está íntimamente relacionado con la reparación.
Los macrófagos de encargan de fagocitar los restos de tejido dañado, así como de la producción de elastasas y colagenasas para degradar los restos de matriz extracelular, Además, como ya sabemos, los macrófagos producen ácido nítrico y ROS como parte de su actividad antimicrobiana.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Participan en la quimiotaxis y la proliferación de fibroblastos y queratinocitos mediante la secreción de diversos factores de crecimiento en la zona lesionada.
También colaboran, mediante e la secreción de factores de crecimiento, como VEGF, en la angiogénesis.
Por último, participan en la deposición y la remodelación de la matriz extracelular, también mediante la secreción de factores de crecimiento, así como de otros productos como colagenasa (remodelación de la MEC).
La deposición excesiva de colágeno y otros componentes de la matriz extracelular dan lugar a FIBROSIS. Este fenómeno se da en caso de un daño muy severo.
Por ejemplo, se producirá fibrosis como consecuencia de un infarto de miocardio severo: se deposita matriz extracelular que sustituye a las células del tejido. La acumulación de matriz hará que el tejido pierda función y se endurezca mucho.
En caso de estímulo lesivo prolongado -inflamación crónica- se secretan citoquinas que inducirán la secreción de más colágeno y la inhibición de enzimas que normalmente degradan la matriz extracelular.
Todo esto provoca un aumento neto de la matriz en la zona lesionada.
A continuación se muestra un cuadro resumen de la regeneración, la reparación y la fibrosis.
15 Patología celular y molecular CÉLULAS MADRE Y MEDICINA REGENERATIVA En los siguientes esquemas se muestran posibles enfermedades o campos en las cuales las células madre podrían tener una oportunidad terapéutica, es decir, las células madre podrían llegar a regenerar esos tejidos.
Podemos diferenciar dos tipos de células 16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV madre en función de su procedencia: - Células madre adultas - Células madre embrionarias CÉLULAS MADRE ADULTAS Son células multipotentes, lo que quiere decir que pueden dar lugar a los tipos celulares del tejido donde residen. Por tanto, tienen plasticidad limitada.
Hay estudios que demuestran que determinados tipos de células madre adultas, por ejemplo las células de la médula ósea, pueden dar lugar a otros tipos celulares que no son de su tejido aunque no de forma fisiológica, es decir, que no son células de la sangre.
17 Patología celular y molecular CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Provienen de la masa celular interna de un embrión en estadío de blastocisto. Dentro del blastocisto podemos distinguir dos partes: - Trofoblasto: esfera vacía de células que se implanta en el útero y que, cuando se desarrolla, da lugar a las membranas extraembrionarias como la placenta, el cordón umbilical y al amnios.
- Células de la masa celular interna; son las células madre embrionarias.
Estas células pueden ser inmortales - pueden auto-renovarse indefinidamente en cultivo.
Las células madre embrionarias tienen plasticidad completa; esto quiere decir que pueden dar lugar a cualquier célula del organismo, es decir, a cualquiera de las capas germinales (mesodermo, ectodermo o endodermo). Por esto mismo se dice que las células madre embrionarias son pluripotentes.
Como no pueden dar lugar a tejido extraembrionario, no son totipotentes. Para obtener células totipotentes hay que retroceder a estadíos de tres o cuatro células.
Las células madre embrionarias se extraen del embrión y se cultivan en placas sobre una capa de fibroblastos (fiber layer). Las células madre van creciendo y forman lo que se conoce como el embryon body. Cada una de las células de este embryon body puede generar cualquier tipo celular (ya que está formado por cél. madre embrionarias).
A nivel de potencialidad regenerativa, las células madre embrionarias ofrecen muchas posibilidades, ya que son pluripotentes. Esta constituye su principal gran ventaja.
18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En el embryon body tenemos células completamente indiferenciadas. Debemos conseguir que éstas se diferencien en un tipo celular concreto.
Es muy complicado conseguir la combinación de factores que hacen que la célula indiferenciada se diferencie en el tipo celular que queremos: medio de cultivo para dirigir las células, matriz extracelular, …  Se han empleado células madre embrionarias por ejemplo, para obtener células secretoras de insulina que han sido trasplantadas al páncreas de un ratón. Así, se consiguió que el ratón produjera insulina.
19 Patología celular y molecular 20  También se ha logrado diferenciar células madre embrionarias en cardiomiocitos con los que se han realizado pruebas y estudios implantándolos en un corazón infartado.
 Las células madre embrionarias se han empleado en enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, se han obtenido progenitores de oligodendrocitos a partir de células madre que se han inyectado en la médula espinal de ratones enfermos (con daño en la médula espinal). Estos ratones recuperaron, en parte, su capacidad de movimiento.
2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV  Células madre y regeneración de la piel. Por ejemplo, un trasplante de queratinocitos obtenidos a partir de células madre embrionarias. El aspecto de la piel tras el trasplante es exactamente el mismo.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS VENTAJAS - Pueden obtenerse muy fácilmente de embriones en clínicas de fertilidad, ya que se generan en exceso.
- Son pluripotentes, es decir, tienen capacidad de diferenciarse en las células derivadas de las tres capas germinales.
- Son inmortales: pueden proliferar de manera más o menos indefinida.
DESVENTAJAS - Como se trata de células extraídas de otro organismo diferente del receptor, puede haber rechazo inmunológico (tienen antígenos distintos) - siempre son alogénicas.
- Es muy complicado establecer los protocolos de diferenciación para el tipo celular deseado.
21 Patología celular y molecular - Se ha observado en modelos animales que pueden llegar a ser tumorogénicas.
- Generan problemas éticos, ya que implican el uso de embriones.
Una de las formas de intentar solventar los inconvenientes del uso de las células madre embrionarias para la medicina regenerativa es el CLONAJE TERAPÉUTICO.
Esta técnica consiste en obtener un óvulo, que posteriormente se enuclea - se quita el núcleo y con él, el material genético. Se extraen células del paciente y se inyectan sus núcleos en los óvulos. El oocito tiene determinantes citoplasmáticos que inducen la reprogramación de la célula (en este caso del núcleo). A partir de aquí, se desarrolla in vitro un blastocisto del que se obtienen las células madre embrionarias a las que se induce la diferenciación al tipo celular deseado.
Estas células madre no podrán causar problemas de histocompatibilidad, por lo que no puede producirse rechazo.
Continúa habiendo problemas éticos con esta técnica, ya que implica el uso de embriones.
CÉLULAS MADRE ADULTAS 22  Podrían tratarse con células madre adultas, por ejemplo, quemaduras mediante células madre de la piel. Estas células solo podrán regenerar el tejido epidermal.
 Se ha observado que se produce la regeneración funcional de la conexión supraespinal en un paciente con la cuerda espinal transectada tras un trasplante de células madre del bulbo olfatorio, altamente proliferativas.
2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV  También se ha podido tratar la epidermólisis bullosa mediante células madre de la piel manipuladas genéticamente. Esta enfermedad es causada por un déficit de laminina 5, que es transfectada a los cultivos de células madre con los que se realiza el tratamiento.
 Otro ejemplo de empleo de células madre adultas es la obtención de las células madre del limbo del ojo (limbo esclerocorneal) para la reparación de la córnea. Las células del limbo se consiguen mediante una biopsia.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS VENTAJAS - Pueden utilizarse células provenientes del propio paciente por lo que se evita el rechazo.
- Como se trata de células más avanzadas en el proceso de diferenciación, diferenciarlas resulta un proceso menos complejo que en las células embrionarias.
- Conllevan menos problemas éticos.
DESVENTAJAS - Son raras en los tejidos maduros por lo que es difícil obtener grandes cantidades.
- Son difíciles de cultivar.
- Su plasticidad es dudosa, ya que generalmente se limitan a diferenciarse en tipos celulares de su mismo tejido de origen.
REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS A STEM CELLS PLURIPOTENTES Esta podría ser la solución para llevar a cabo medicina regenerativa sin los problemas que implican las células madre. Consiste en obtener células somáticas adultas del organismo y reprogramarlas para que se conviertan en células madre embrionarias o pluripotentes de nuevo, es decir, para que vuelvan a adquirir sus características. Se trata de un proceso similar al clonaje terapéutico pero logra evitar los problemas éticos ya que no implica el uso de embriones.
23 Patología celular y molecular El genoma de las células diferenciadas se manipula para que éstas vuelvan a ser Stem Cells pluripotentes.
Estos cambios en el genoma consisten en cambio epigenéticos y se basan en que la célula adulta y las células del blastocisto tienen el mismo genoma, pero con una "programación" diferente.
Es decir, los genomas solo difieren en las modificaciones epigenéticas, por lo que es posible que, mediante la modificación de éstas, se puedan "reprogramar" las células.
Las células obtenidas mediante este proceso reciben el nombre de iPS o células madre pluripotentes inducidas.
Se identificaron, mediante Screening genético 24 genes expresados en las células embrionarias que podrían ser los responsables de su pluripotencialidad. Para investigar cuáles eran estos genes de entre los 24 candidatos se infectó un cultivo de células con un virus. Se llegó a la conclusión de que la combinación de 4 genes (Oct3/4, Soc2, Klf4 y cMyc) conferían a las células infectadas las propiedades de célula madre embrionaria.
24 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV iPS Y MEDICINA REGENERATIVA A continuación vemos un esquema del proceso de obtención y uso de las iPS.
En primer lugar se extraen los fibroblastos de un ratón transgénico. A estos fibroblastos se les quita el núcleo y se les transfecta con un plásmido con el gen de interés, al que también se añaden los genes que hacen posible la conversión a iPS y un gen de resistencia a un antibiótico para llevar a cabo la selección.
Las células que han incorporado el plásmido serán aquellas que sobrevivan al antibiótico. Cultivamos estas células para obtener un cultivo de iPS, que se introducen a continuación en un blastocisto de ratón que, cuando nazca, habrá incorporado los genes de interés.
Este proceso también se ha probado en humanos en los que los cuatro factores (o genes) mencionados anteriormente inducen el carácter de célula pluripotente a células somáticas adultas convirtiéndolas en iPS.
Estas células pueden dar lugar a las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo). La célula somática cambia mediante modificaciones epigenéticas, que modifican la expresión de ciertos genes responsables de las características de las células madre.
Por tanto, podemos decir que existen una serie de mecanismos epigenéticos implicados en la reprogramación y que cambian el patrón de expresión.
25 Patología celular y molecular Los factores de transcripción son proteínas que se unen al DNA y regulan la expresión de los diferentes genes (bien en positivo o en negativo).
- Oct3/4 y Sox2 son factores de transcripción cuya función es mantener la pluripotencia de las células madre embrionarias.
- c-Myc y Klf4 son factores de transcripción que modifican la estructura de la cromatina para que Oct3/4 y Sox2 puedan unirse a su diana.
Estos genes son, por tanto, protooncogenes.
MECANISMOS DE LA PLURIPOTENCIA DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Las células madre embrionarias deben ser capaces de mantener el estado de indiferenciación. Los genes Oct4, Sox2 y Nanog forman una red autorreguladora interconectada que posibilita que las células no se diferencien. Una vez que estos genes de pluripotencialidad están activados, se establece un bucle de retroalimentación positiva que permite que las células continúen siendo pluripotentes.
Gracias a esta red, se mantienen los genes de diferenciación inhibidos.
Además, Oct4 y Sox2 exógenos pueden reactivar a los gene Oct4, Sox2 y Nanog endógenos para que se establezca la red autorreguladora y la célula mantenga su pluripotencialidad.
Durante el proceso de establecimiento de esta red molecular, el factor KLF4 activa a Oct4 y a Sox2 que a su vez activan a Nanog. De esta manera se activa la regulación positiva de los factores de las células madre embrionarias y la regulación negativa de la diferenciación.
26 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV APLICACIONES DE LAS iPS Tenemos, por ejemplo, un ratón con anemia. Podemos reprogramar las células de su piel en iPS gracias a los factores Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Gracias a estos factores logramos iPS a las que se puede inducir la mutación o el gen que solucione la enfermedad de los ratones. A continuación, estas células (genéticamente corregidas) se diferencian en células sanguíneas gracias a las cuales se puede curar la anemia del ratón.
PROBLEMAS DE LA REPROGRAMACIÓN - Uso de vectores virales para la selección de las células que han incorporado el gen.
- Baja eficiencia: se intentan infectar muchas células de las cuales solo se consiguen infectar unas pocas.
- Riesgo de formación de tumores debido a la desdiferenciación de las células (al igual que ocurre en las células tumorales).
- Protocolos eficientes de diferenciación.
ESTUDIOS EN STEM CELLS ¿CÓMO IDENTIFICAMOS LAS CÉLULAS MADRE DE UN TEJIDO? 1) Se pueden buscar marcadores de las células madre, es decir, proteínas y rasgos que se expresan en estas células y no en las células somáticas.
27 Patología celular y molecular 2) Side population (SP): transportadores ABC. Las células madre tienen en su superficie transportadores de la familia ABC, es decir, transportadores dependientes de ATP que no expresan las células ya diferenciadas. Si cultivamos las células madre en presencia de un marcador como el DAPI, éste saldrá de las células gracias a las proteínas ABC, mientras que en las células diferenciadas el DAPI no sale.
Por tanto, las células diferenciadas aparecerán marcadas con DAPI (que tiñe los núcleos), mientras que las células madre, no.
Gracias a un citómetro de flujo podremos diferenciar las células marcadas de las células madre, denominadas Side Population. Una vez tenemos las células madre, podemos comprobar si expresan el transportador ABC (Bcrp1) mediante Western Blot. Esta es la técnica más utilizada, aunque tiene ciertas limitaciones.
3) Ensayos clonal y clonogénicos: estos ensayos se basan en que solo las células madre pueden formar colonias sobre una placa de cultivo. En un tejido hay células madre y células diferenciadas. Si fijamos el tejido en una placa de disolución clonal, de forma que estén aisladas y no puedan comunicarse, las células madre formarán colonias, mientras que las células madre, no.
4) Label Retaining Cells (LRC) 5) Ensayos de teratogénesis: consisten en coger un tejido con células somáticas y células madre. Las células madre se intentan aislar mediante Side Population o mediante marcadores. A continuación, se implantan subcutáneamente estas células en el ratón. Como se trata de células pluripotentes, podrán dar lugar a teratomas, que corresponden al azar a las diferentes capas germinales del organismo (ectodermo, endodermo y mesodermo).
28 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV 29 ...

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